--PAGE_BREAK--Микроскопическое исследование эякулята
Микроскопическое исследование эякулята является самым важным звеном спермограммы. При микроскопии оценивается:
· концентрация сперматозоидов,
· их подвижность и
· строение;
· проводится подсчет и изучение иных клеточных элементов эякулята.
Количество и подвижность сперматозоидов изучается на прижизненных нативных препаратах без окраски. Для оценки жизнеспособности используются нативные препараты с прижизненной окраской. Морфология изучается после фиксации препарата и специального окрашивания. Исследование выполняется с помощью светового или фазово-контрастного микроскопа с рабочим увеличением (объектив 40х, окуляр10х). Конденсор опущен.
Эякулят сразу же помещается в термостат при +370C. Микроскопия выполняется после полного разжижения, не позже чем через 60 минут. Концентрация сперматозоидов и их подвижность определяется при помощи счетной камеры Горяева. Счетная камера изготавливается из плотного предметного стекла. На ее поверхности имеется 225 квадратов (15 рядов по 15 квадратов). Эти квадраты называются «большими». Кроме того, на поверхности камеры имеется «малые квадраты», которые имеют размеры 0,05 мм. Между стенкой камеры (там, где нанесена сетка) и боковыми частями имеется зазор в 0,1 мм. После нанесения материала камера прикрывается и притирается покровным стеклом, что фиксирует определенный объем исследуемого материала. Камера Горяева и покровные стекла должны быть вымыты и обезжирены смесью Никифорова, подогреты до +250C. Кроме того, рекомендуется наносить часть материала и на обычные предметные стекла, обработанные таким же образом. Дело в том, что опытный врач-лаборант при осмотре нативного препарата спермы на обычном предметном стекле может с большой долей достоверности определить основные показатели спермограммы.
После полного разжижения эякулят разводят физиологическим раствором также комнатной температуры в соотношении 5:1. Иногда разведение увеличивают, особенно если имеется молочно-белый цвет эякулята. Полученный материал несколько раз осторожно набирают и опорожняют в пипетку. Далее каплю эякулята подводят под покровное стекло. Материал должен равномерно распределиться по всей камере. После чего необходима стабилизация препарата. Для этого в течение 1 – 2 минут его оставляют на предметном столе микроскопа. Рекомендуется использовать предметный столик микроскопа с подогревом до +370C. В случае, если этого нет, возможно переместить приготовленную и заправленную эякулятом камеру в термостат на 15 минут при той же температуре. После этого переходят непосредственно к микроскопии.
Исследование не вызывает сложностей, если в большом квадрате камеры Горяева расположено не менее 30 – 40 сперматозоидов. Если это число более 150 – 200, то рекомендуется увеличить разведение в 2, а иногда и в 3 раза.
Если же наоборот клеточных элементов слишком мало, то тогда выполняется центрифугирование эякулята. Излишки жидкости удаляют пипеткой. Следует заметить, что возможно некоторое изменение морфологии в худшую сторону при проведении центрифугирования.
Для оценки достоверности полученного результата исследуют второй препарат. Подсчет ведется, исследуя около 200 – 300 клеток. При подсчете 50 клеток результат считается статистически недостоверным, если разница между двумя исследованиями составляет менее 5 клеток. При подсчете 100 клеток это значение равно 7. И при подсчете 250 клеток – 9.
Во время проведения микроскопического спермиологического обследования определяются следующие параметры:
1. Определение количества сперматозоидов.
2. Оценка подвижности сперматозоидов.
3. Оценка жизнеспособности сперматозоидов.
4. Оценка морфологии сперматозоидов.
5. Исследование «круглых» клеток.
6. Определение агглютинации сперматозоидов.
7. Оценка неклеточных структур.
Определение количества сперматозоидов
Определение количества сперматозоидов выполняется при микроскопии препарата в счетной камере. Для того, чтобы движения сперматозоидов не вызывали технических сложностей, необходимо провести их обездвиживание. Для этого используется раствор, который содержит 50 грамм бикарбоната соды (NaHCO3), 10 мл 35% раствора формалина, разведенного в 1 литре воды. Это рекомендация ВОЗ. Обездвиживание происходит в камере Горяева. Также возможно использовать один препарат для оценки подвижности сперматозоидов и подсчета концентрации. Для этого после проведения оценки подвижности в тот же препарат вносится 96% раствор этилового спирта, путем поднесения смоченной фильтровальной бумаги к краю покровного стекла камеры.
Иногда используют жидкость Рубенкова, которая состоит из основного фуксина – 0,1 г, красителя Романовского – 0,02 мл, концентрированной карболовой кислоты – 0,2 мл, глицерина – 0,1 мл, этилового спирта ректификата – 2 мл, 1% раствора натрия хлорида – 100 мл. Эта жидкость кроме фиксации окрашивает сперматозоиды, что дает возможность оценить морфологию сперматозоидов – сперматограмму.
Камеру готовят для микроскопии, так же, как было описано ранее. Для более удобного исследования рекомендуется выдержать камеру Горяева во влажной среде специального устройства. Это необходимо для оседания клеточных элементов.
Исследование проводится путем микроскопии световым микроскопом (или фазово-контрастным) при увеличении 200х (объектив 20х и окуляр 10х). Подсчет сперматозоидов происходит внутри квадратов камеры Горяева. Если клетка расположена на границе между квадратами, то пользуются правилом подсчета только на одной стороне камеры (правой или левой). Подсчет проводится сперматозоидов, имеющих головку и жгутик. Если встречаются аномальные сперматозоиды, например, без жгутика, то они в подсчет не входят.
Техника подсчета следующая:
· если в одном большом квадрате камеры имеется более 40 сперматозоидов, то подсчету подлежат сперматозоиды, находящиеся в пяти больших квадратах;
· если количество клеток составляет от 10 до 40, то исследуются десять больших квадратов, и если имеется менее чем 10 сперматозоидов, то подсчитываются сперматозоиды, лежащие в 25 квадратах.
Принцип подсчета основан на том, что зная все размеры камеры, соответственно ее объем, можно определить концентрацию клеток, находящихся в данном объеме.
Итак, вначале определяется количество малых квадратов, которые расположены в пяти больших. Это число равно 80 (16 * 5 = 80). Далее определяется объем малого квадрата, который составляет 1/4000 кубических миллиметра (V = 0, 05 мм * 0,05 мм * 0,1 мм = 1/4000 кубических миллиметра). После чего подсчитывается количество сперматозоидов в одном малом квадрате. Это число делят на число малых квадратов (N/80). Определяется число сперматозоидов в 1 кубическом миллиметре. Это выполняется так:
· в 1 кубическом миллиметре объема камеры содержится в 4000 раз больше сперматозоидов, чем в одном малом квадрате.
Формула подсчета числа клеток в 1 кубическом миллиметре следующая:
C = N * 4000/80 = N * 50 (сперматозоидов / кубический миллиметр). Поскольку 1 мл содержит 1000 кубических миллиметра, соответственно количество сперматозоидов в 1 мл определяется по формуле:
C (1 мл) = (N * 50) * 103 (сперматозоидов / мл).
В конце учитывается степень разведения эякулята:
C (общее) = N * 50000 * степень разведения яээкулята.
При проведении подсчетов сперматозоидов в десяти или двадцати пяти больших квадратах следует помнить, что количество малых квадратов будет равно 16 * 10 или 16 * 25. И тогда в формулы подсчета вносятся значения 160 или 400.
Для того чтобы определить концентрацию сперматозоидов во всем эякуляте, необходимо умножить количество клеток в 1 мл эякулята на весь его объем. Для контроля необходимо провести второй подсчет из двух разных порций спермы. Если разница числа сперматозоидов составляет более 5%, то такой результат считают недостоверным и проводят исследование заново.
Нормы концентрации сперматозоидов
Нормы концентрации сперматозоидов рекомендованы ВОЗ в 1992 году и являются общепризнанными во всем мире.
Нижняя граница числа сперматозоидов 1 мл эякулята должна составлять 20 миллионов. Неоднократно наблюдали наступление беременности в тех случаях, если эта цифра была равна 10 – 12 миллионов.
Снижение числа сперматозоидов (менее 20 миллионов в 1 мл спермы) носит название олигозооспермия. Если в 1 мл эякулята содержится от 10 до 20 миллионов сперматозоидов, то такая олигозооспермия считается 1 степени. Если концентрация сперматозоидов составляет менее 10 миллионов в 1 мл, то это олигозооспермия 2 степени.
Если в эякуляте вообще отсутствуют сперматозоиды, то данное состояние называется азооспермией. При наличии единичных сперматозоидов, определенных после центрифугирования эякулята присваивается термин – криптоспермия.
Если в 1 мл эякулята число сперматозоидов превышает цифру 150 миллионов, то тогда данное состояние называется гиперспермией. По некоторым данным эта цифра равна 120 миллионам.
продолжение
--PAGE_BREAK--Оценка подвижности сперматозоидов
Оценка подвижности сперматозоидов выполняется путем микроскопии препарата спермы на обычном предметном стекле и камере Горяева. Опытный врач-лаборант начинает исследования с микроскопии нативного препарата на предметном стекле. Для получения точных значений подсчет проводится в счетной камере. Вначале просматриваются пять больших квадратов, которые расположены по диагонали. Если концентрация сперматозоидов мала (сумма клеток в пяти квадратах менее 150), то осмотру подлежит большее число квадратов. Также возможно использовать меньшую степень разведения эякулята.
Согласно критериям ВОЗ различают следующие варианты подвижности сперматозоидов:
1. a – сперматозоиды с быстрым поступательным движением (скорость движения таких сперматозоидов составляет более чем пять длин головок или половины хвоста за 1 секунду, при +370C). Стоит сказать, что определение этого параметра достаточно субъективно и в первую очередь зависит от опыта врача, проводившего исследование.
2. b – сперматозоиды с медленным поступательным движением (скорость движения таких сперматозоидов составляет менее чем пять длин головок или половины хвоста за 1 секунду, при +370С).
3. c – сперматозоиды с непоступательным движением (или же крайне медленным поступательным движением по прямой). Сюда же относят сперматозоиды, имеющие движение по кругу, даже если эта скорость велика.
4. d – неподвижные сперматозоиды.
Техника исследования следующая:
· вначале считаются сперматозоиды с подвижностью типов a и b. Это исследование рекомендуется выполнять в двух оптических плоскостях – верхней и нижней.
· Затем определяется число сперматозоидов с подвижность типа c и d.
Значениями являются%. Формулы получения значений следующие:
· a = a * 100/(a+b+c+d),
· b = b * 100/(a+b+c+d),
· c = c * 100/(a+b+c+d),
· d = d * 100/(a+b+c+d).
Полученные значения округляют.
Еще одним важным критерием является определение длительности сохранения подвижности. При этом контейнер с образцом спермы выдерживается в термостате при стандартной +370С в течение 2-х часов. После чего проводятся повторное изучение подвижности сперматозоидов. За это время ухудшение показателей подвижности в норме составляет не более 20%.
Оценка достоверности исследования заключается в повторном исследовании. Для 50 исследуемых сперматозоидов допускается отклонение до 5 клеток в двух образцах спермы. Для 100 сперматозоидов эта цифра составляет менее 7 и для 250 – не более 9.
Нормы подвижности сперматозоидов
Чем больше число сперматозоидов с активной прогрессирующей подвижностью, тем выше фертильность спермы. В настоящее время в качестве норм подвижности рекомендуется использовать значения ВОЗ:
· Количество прогрессивно подвижных сперматозоидов (a + b) должно составлять не менее 50%. Число активно подвижных сперматозоидов (a) в норме считают не менее 25%.
· Неподвижных сперматозоидов (d) должно быть менее 50% и
· сперматозоидов с отсутствием поступательного движения (c) не более 2%.
Однако значения физиологической нормы могут быть весьма вариабельны, и наступление беременности происходит и при значительно худших показателях подвижности сперматозоидов, чем нормы ВОЗ.
Причины нарушения подвижности сперматозоидов
Снижение числа подвижных сперматозоидов называется астенозооспермия. Существует множество классификаций степени астенозооспермии:
· Если суммарный процент прогрессивно–подвижных сперматозоидов (a + b) составляет менее 50%, то такую астенозооспермию считают слабовыраженной.
· Если это значение меньше 40%, то говорят об умеренной астенозоооспермии.
· И если имеется лишь 30% подвижных сперматозоидов, то тогда говорят о выраженной астенозоооспермии.
Причин, которые в той или иной степени действуют на показатели подвижности, множество. Это могут быть как экзогенные, так и эндогенные факторы. Из экзогенных стоит выделить следующие:
· неблагоприятные факторы внешней среды,
· различные токсические влияния,
· колебания климатических показателей,
· злоупотребление алкоголем,
· курение,
· действие электромагнитного излучения,
· неблагоприятные условия работы.
Из эндогенных факторов в первую очередь стоит отметить различные аномалии строения и функционирования жгутикового аппарата сперматозоидов. Среди них известны генетические нарушения, которые изменяют нормальное строение аксонемы и ферментопатии, что приводит к нарушениям энергетических процессов, происходящих во время движений жгутиков. Часто это клеточные нарушения, например, патология митохондрий.
Кроме того, известно, что хронические воспалительные процессы придаточных половых желез (вызванные как специфической, так и неспецифической урогенитальной инфекцией) оказывают существенное отрицательное влияние на подвижность сперматозоидов. Это обусловлено токсическим влиянием продуктов воспаления, замещением соединительной тканью функционирующей части желез, а также уменьшением секреции в придатке яичка так называемых андроген-зависимых факторов, необходимых для обеспечения механизмов подвижности сперматозоидов. Также не исключен такой фактор, как аутоиммунный процесс, приводящий к нарастанию титра антиспермальных антител.
продолжение
--PAGE_BREAK--