--PAGE_BREAK--Конструювання рекомбінантних плазмід для експресії АРОА1 людини in vitro та in vivo. На сьогодні створено велику кількість гібридних промоторів, які мають вищу швидкість ініціації транскрипції порівняно з промотором hCMV-IE. Продемонстровано, що введення до складу вектора експресії деяких геномних елементів, зокрема, інтронів та 3`- і 5`- послідовностей, які не транслюються, підвищує рівень експресії трансгена як in vitro (Palmiter et al., 1991) так і в трансгенних тваринах (Ebert et al., 1998). Механізм впливу таких послідовностей на рівень експресії трансгенів не в усіх випадках відомий, але його пов`язують з такими явищами, як підвищення частоти ініціації транскрипції, стабільності і ефективності транспорту і/або підвищення ефективності формування 3`-кінця мРНК при її дозріванні (Kawamoto et al., 1998). Тому, одним із перспективних шляхів підвищення рівня експресії трансгена є використання послідовностей, що містять не лише промотор, а також і перший інтрон гена, транскрипцію якого регулює даний промотор чи промотор іншого гена, у випадку гібридних послідовностей. В експериментах із використанням маркерних генів показано, що послідовності CAG та hCMV-ІA забезпечують вищий рівень синтезу трансгена in vitro порівняно з hCMV-IE (Niwa et al., 1991; Chapman et al., 1991; Xia et al., 2006). З використанням цих промоторів одержано трансгенні тварини (Okabe et al., 1997; Ishii et al., 1997) та здійснено експресію трансгенів in vivo (Xu et al., 2001). Враховуючи дані літератури, використання цих елементів регуляції транскрипції видається перспективним для підвищення рівня експресії трансгена АРОА1 людини в клітинах ссавців.
Як трансген у роботі використано повнорозмірний геномний варіант гена АРОА1 людини (рис. 1).
Для оцінки впливу вищезазначених гібридних послідовностей на експресію гена АРОА1 людини крім вихідної плазмідиpTRhCMV-IEapo, яку створено співробітниками нашого відділу раніше (Топорова і співав., 2004), було сконструйовано рекомбінантні плазміди pTRCAGapo таpTRhCMV-IAapo. Для конструювання вектора експресії pTRCAGapo в плазміді pTRhCMV-IEapo промоторhCMV-IE було замінено на CAG. Для одержання цільової плазміди pTRhCMV-IAapo в плазміді pTRhCMV-IEapo промотор hCMV-IE було замінено на hCMV-ІA.
Для вивчення рівня експресії гена АРОА1 людини стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1, до складу плазмід pTRhCMV-IEapo, pTRCAGapo таpTRhCMV-IAapo було клоновано ген неоміцинфосфотрансферази (neoR), який дозволяє відбирати клітини на селективному середовищі з антибіотиком G418 та отримано плазміди pTRhCMV-IEapo neoR, pTRCAGapo neoR, pTRhCMV-IAapo neoR.
Транзиторна експресія гена АРОА1 клітинами СНО-К1. Нами було досліджено експресію АРОА1 людини під контролем різних елементів регуляції транскрипції транзиторно та стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1.
Перевагами використання транзиторної системи експресії є незалежність рівня експресії трансгена від «ефекту положення», тобто впливу регуляторних хромосомних елементів, оскільки експресія трансгена відбувається з неінтегрованих послідовностей. Дослідження рівня транзиторної експресії трансгена трансфікованими клітинами СНО-К1 проводили після трансфекції клітин препаратами ДНК/ПЕІ з рекомбінантними плазмідами:pTRhCMV-IEapo, pTRCAGapo та pTRhCMV-IAapo, що містять у своєму складі генАРОА1 людини.
Наявність плазмідної ДНК у трансфікованих клітинах визначали на 6-ту добу після трансфекції за допомогою методу «nested» ПЛР. Для проведення ПЛР використовували розраховані нами за допомогою програми Vector NTI Advance 10 пари праймерів Ap-r/Ap-f та Ap(n)-f /Ap(n)-r (Гільчук та співав., 2006).
Синтезований АРОА1 людини секретується клітинами і тому його визначення проводили безпосередньо у культуральному середовищі. Для цього використовували таку схему: через добу після трансфекції змінювали середовище на безсироваткове, на наступну добу середовище повністю відбирали та зберігали при -20 0С, а до клітин додавали свіже середовище без сироватки. Таким чином були відібрані проби культурального середовища на 2-5 добу після проведення трансфекції клітин.
На 2-гу добу після трансфекції Вестерн-блот аналізом було показано наявність АРОА1 людини в культуральному середовищі клітин трансфікованих рекомбінантними плазмідами pTRhCMV-IEapo та pTRhCMV-IAapo (рис. 2).
Встановлено, що рівень синтезу АРОА1 клітинами, трансфікованими плазмідою pTRhCMV-IAapo, складає ~ 3 нг білка/мл середовища за добу, в той час, як при трансфекції клітин плазмідою pTRhCMV-IEapo – ~ 0,4 нг/мл. Рівень експресії трансгена, що контролюється гібридною послідовністю CAG, був нижчий за чутливість використаного методу аналізу (
Експресія гена АРОА1 стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1. Для порівняння сили промоторів, крім транзиторної експресії трансгена у низці випадків досліджують експресію у пулі стабільно трансфікованих клітин (Xia et al., 2006). Це дозволяє вилучити з аналізу клітини, в які при трансфекції не потрапив цільовий ген. З іншого боку, оскільки експресія трансгена відбувається з інтегрованих векторних послідовностей її рівень залежить від „ефекту положення”. Для зменшення впливу ефекту положення трансгена на рівень його експресії, досліджується експресія пулом стабільно трансфікованих клітин, а не окремими клонами.
Для дослідження синтезу АРОА1 людини у стабільно трансфікованих клітинах було проведено трансфекцію клітин СНО-К1 препаратами ДНК/ПЕІ з плазмідами: pTRhCMV-IEapo neoR, pTRCAGapo neoR та pTRhCMV-IAapo neoR. Трансфіковані клітини відбирали на селективному середовищі, яке містило антибіотик G418. Після двох тижнів селективного відбору клітин, які були трансфіковані окремо кожною з плазмід, отримано не менш ніж 100 клонів стабільно трансфікованих клітин.
Оскільки селекцію клітин після трансфекції проводили лише за геномneoR, важливо було встановити наявність гена АРОА1 людини в трансфікованих клітинах. Наявність трансгена визначали в пулі трансфікованих клітин ампліфікацією з різної кількості тотальної ДНК. При цьому визначали мінімальну кількість тотальної ДНК, продукт ампліфікації якої ще виявляли за допомогою електрофорезу. Встановлено, що різні пули стабільно трансфікованих клітин містять приблизно однакову кількість копій АРОА1 людини на клітину (рис. 3).
Для порівняння рівня експресії трансгена з різних регуляторних елементів у пулах стабільно трансфікованих клітин у чашки Петрі переносили по 1·106 клітин, отриманих для кожної з одержаних рекомбінантних плазмід. Через добу середовище замінювали на безсироваткове, а через дві доби відбирали для аналізу. Аналіз проводили для пулів стабільно трансфікованих клітин (надалі стабільно трансфіковані клітини). Вміст АРОА1 у культуральному середовищі визначали методом ELISA (рис. 4).
Кількісний аналіз вмісту АРОА1 у культуральному середовищі проводили також Вестерн-блот аналізом (рис. 5). Встановлено, що рівні експресії гена АРОА1 людини клітинами, трансформованими pTRhCMV-IEapo neoR, pTRCAGapo neoRтаpTRhCMV-IAapo neoR, становили 156 нг/мл, 253 нг/мл та 634 нг/мл, відповідно. Одержані результати свідчать, що стабільно трансфіковані клітини СНО-К1, які були отримані для плазмід pTRCAGapo neoR таpTRhCMV-IAapo neoR, забезпечують вірогідно вищий рівень синтезу трансгена, порівняно з рівнем отриманим для pTRhCMV-IEapo-neoR.
Аналіз тривалості знаходження трансгена АРОА1 людини invivo. Важливим етапом при розробці генно-терапевтичних підходів до корекції генетичних дефектів людини є проведення експериментів на тваринах для встановлення таких характеристик системи доставки трансгена, як специфічність, ефективність, безпечність та інші.
Виходячи з результатів, одержаних на культурі СНО-К1, плазміда pTRhCMV-IAapo забезпечує найвищий рівень експресії гена АРОА1 людини порівняно з іншими сконструйованими нами плазмідами. Однак, із даних літератури відомо, що характер експресії з промоторів може відрізнятись для різних типів клітин, та для досліджень in vitro та in vivo (Xu et al., 2001; Xu et al., 2002). Тому, проводити вибір рекомбінантної плазміди для розробки підходу до ГТ атеросклерозу можливо лише після досліджень in vivo. Крім того, невідомо, який рівень експресії цільового білка можливо забезпечити запропонованим нами методом генно-терапевтичної корекції дефіциту АРОА1 людини in vivo та чи достатній цей рівень для отримання очікуваного терапевтичного ефекту. Тому перші експерименти на тваринах in vivo нами проводились з метою дослідження як характеристик запропонованої нами системи доставки трансгена (тривалість зберігання трансгена, його локалізація в організмі), так ідля вивчення можливого рівня експресії гена АРОА1 людини в організмі кролів та здійснювався з використанням базової плазміди – pTRhCMV-IEapo.
Для дослідження тривалості знаходження трансгена АРОА1 людини, в організм піддослідних тварин ін’єкцією в паренхіму печінки вводили препарат плазміди pTRhCMV-IEapo. При цьому кількість плазмідної ДНК, яку вводили тваринам (щур – 100 мкг, кріль – 240 мкг), була максимально можлива для цього методу, та обмежена сумарним об’ємом препарату, який можливо ввести в паренхіму печінки тварин без видимих її пошкоджень. Тривалість зберігання трансгена в організмі аналізували за його наявністю у фракції тотальної ДНК тканин печінки через різні проміжки часу після введення плазміди pTRhCMV-IEapo. Аналіз проводили методом «nested» ПЛР з використанням пар праймерів Ap-f/Ap-r, Ap(n)-f/Ap(n)-r та Ap(h-Rab)-f/Ap(h-Rab)-r, Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r), розрахованих нами для виявлення ДНК АРОА1 людини на фоні тотальної ДНК клітин щура та кроля, відповідно (Гільчук та співав., 2006).
Ген АРОА1 людини виявлено в клітинах печінки всіх щурів піддослідної групи на 3-ю та 25-у добу після ін’єкції, у той час, як при подальшому аналізі на 90-у добу, трансген не виявлений в усіх проаналізованих тварин (табл. 1). Одержаний результат може свідчити про те, що у зазначений період часу після ін’єкції препарату ДНК/ПЕІ відбуваються процеси, що призводять або до зменшення у клітинах плазмідної ДНК до рівня, який нижчий за чутливість методу аналізу, або до загибелі трансфікованих клітин. Варто зазначити, що в усіх випадках трансген виявляли лише за результатом другого раунда ампліфікації, однак при цьому спостерігали гетерогенність проб за кількістю синтезованого амплікону та за наявністю чи відсутністю продукту першого раунда ампліфікації.
Таблиця 1
Тривалість знаходження трансгена АРОА1 у тотальній ДНК клітин печінки щурів, визначена методом «nested» ПЛР
Кількість тварин
Час, що пройшов після ін’єкції, доба
3
6
15
25
90
У ДНК яких виявлено цільовий ген
2
3
2
2
0
Загальна
2
4
3
2
3
Дослідження наявності гена АРОА1 людини у тотальній ДНК клітин печінки кролів виявило тривале збереження цільової ДНК в клітинах (табл. 2). Так, трансген виявляли і на 85-у добу після введення ДНК, в той час, як на 150-у добу АРОА1 людинине детектували. Через годину після введення плазмідної ДНК у паренхіму печінки трансген був детектований у першому раунді «nested» ПЛР, в той час, як в усі наступні часові періоди його наявність детектували за продуктами другого раунда ампліфікації. При цьому не спостерігали значної гетерогенності за кількістю продуктів ампліфікації, що можна значною мірою пояснити особливістю аналізу наявності гена АРОА1 людини саме з використанням пар праймерів Ap(h-Rab)-f/Ap(h-Rab)-r та Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r: було показано інгібування другого раунда ПЛР з використанням прймерів Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r при більшій за 106 кількості копій цільової ДНК у реакційній суміші.
Таблиця 2
Тривалість знаходження трансгена АРОА1 у тотальній ДНК клітин печінки кролів, визначена методом «nested» ПЛР
Кількість тварин
Час, що пройшов після ін’єкції, доба
1/24
6
14
30
85
150
У ДНК яких виявлено цільовий ген
1
3
1
1
3
0
Загальна
1
3
1
1
3
2
Встановлення локалізації введеного трансгена in vivo. Дослідження розповсюдження плазмідної ДНК в органах піддослідних тварин проводили на щурах та кролях, яким ін’єкцією в паренхіму печінки вводили препарат ДНК/ПЕІ. Тварин забивали на 6-у та 85-у добу після ін’єкції плазміди pTRhCMV-IEapo. Для проведення аналізу відбирали у щурів проби тканин печінки, серця, легенів та нирок, а у кролів, окрім цих органів − також лімфатичні вузли та стінку аорти.
За допомогою підібраних для кожної з тварин наборів праймерів проведено «nested» ПЛР аналіз наявності гена АРОА1 людини у тотальній ДНК, що була виділена з тканин різних органів щурів та кролів. За результатами другого раунда «nested» ПЛР встановлено наявність трансгена в усіх проаналізованих зразках тканин тварин (табл. 3) (чутливість «nested» ПЛР у присутності ДНК щура 10 копій гена АРОА1 людини/500 нг ДНК, у присутності ДНК кроля − 103 копій гена/500 нг ДНК). Це свідчить про ефективність доставки плазмідної ДНК ін’єкцією in vivo у складі комплексів ПЕІ/ДНК.
Таблиця 3
ПЛР аналіз розповсюдження в організмі піддослідних тварин гена АРОА1 після введення плазмідної ДНК
Тварини
Час після введення, доба
Органи
Печінка
Легені
Серце
Нирки
Лімфовузли
Стінка
аорти
Щур (n=3)
6
+
+
+
+
н/п
н/п
Кролик (n=3)
6
+
+
+
+
+
+
Кролик (n=3)
85
+
+
+
+
+
+
Примітки: + трансген виявлено; – трансген не виявлено; н/п – дослідження не проводили.
Результати аналізу локалізації трансгена invivo показали, що частина плазмідної ДНК, яку було введено в печінку, потрапляє з міжклітинною рідиною та лімфою, або через капіляри з венозною кров’ю, у кровообіг, і таким чином, розповсюджується по організму. Але в даному випадку, методом ПЛР, важко визначити, чи потрапляє плазмідна ДНК у клітини тканин інших органів (серце, легені, нирки, лімфовузли), чи виявляється лише плазмідна ДНК, яка знаходиться у крові в капілярах цих органів або у клітинах ендотелію судин. Звичайно, при локальному введенні плазмідної ДНК з катіонними ліпідами спостерігають зберігання переважної кількості трансгена біля місця введення (Eliyahu et al., 2007), що з високою вірогідністю вірно і для комплексів ДНК/ПЕІ. Однак, використаний нами для аналізу локалізації трансгена метод «nested» ПЛР, з метою підвищення чутливості аналізу, не дозволяє робити висновок щодо кількісного розподілу введеної плазміди та відображає лише якісно здатність трансгена потрапляти до певних тканин організму після введення плазміди запропонованим нами методом.
Дослідження синтезу АРОА1 та очікуваного терапевтичного ефекту при повторних введеннях плазміди pTRhCMV-IEapo тваринам. Вивчення ефектів, обумовлених введенням трансгена АРОА1 людини invivo здійснювали на експериментальній моделі атеросклерозу, яку одержували при утримуванні кролів на холестериновій дієті. Відомо, що метаболізм ліпопротеїдів кролів більш подібний до метаболізму людини порівняно з метаболізмом мишей та щурів (Moghadsian et al., 2001). Саме тому кролі з експериментально індукованим атеросклерозом є адекватною моделлю для вивчення ефектів від введення трансгена людини на метаболізм ліпопротеїдів та сприйнятливості до атеросклерозу. При утриманні кролів на холестериновій дієті вже на другий тиждень спостерігається зростання вмісту холестерину у крові піддослідних тварин і надалі таке зростання продовжується щонайменше 4 місяці (Цинциадзе и соавт., 1981). Це призводить до гістологічних та морфологічних змін тканин органів, зокрема: печінки, легенів, нирок, серця, стінок судин та інших. Виходячи з вищезазначеного, у даній роботі аналізували вплив введення у складі комплексів з ПЕІ трансгена АРОА1 людинина вміст тотального холестерину у плазмі крові, морфологію тканин печінки, серця та стінки аорти у кролів з експериментально індукованим атерослерозом.
Досліди проводили на кролях, які були поділенні на дві групи: тваринам першої групи (n=4) тричі вводили плазміду pTRhCMV-IEapo, дотримуючись проміжку один місяць між ін’єкціями; другій, контрольній, групі (n=4) вводили плазміду pTR, що не містить цільовий ген за такою ж схемою. Після першого введення плазмідної ДНК всіх кролів утримували на холестериновій дієті. На шосту добу після кожного введення препарату плазмідної ДНК у тварин відбирали кров для аналізу наявності АРОА1 людини. Одночасно визначали концентрацію тотального холестерину у плазмі крові тварин.
продолжение
--PAGE_BREAK--