Диагностика стафилококковых инфекций

ВладивостокскийГосударственный Медицинский  Университет
Кафедра микробиологии,вирусологии и иммунологии
РЕФЕРАТ
Диагностика стафилококковыхинфекций
Выполнил: Новак А.Л.
301 гр., л/ф
Владивосток, 1998.
Предисловие
Несмотря на то, чтостафилококки принадлежат к числу наиболее легко обнаруживаемых и распозна­ваемыхмикроорганизмов, не требующих сложных диагностических приемов для их выявления,в прак­тической работе микробиологи до сих пор испыты­вают определенныетрудности при установлении их причинной роли в ряде различных заболеваний. С од­нойстороны, присутствие патогенных стафилококков, обнаруживаемое в исследуемомматериале, не всегда является убедительным доказательством их этиоло­гическогозначения. С другой, учитывая большое разнообразие проявлений биологическойактивности этих микробов, зависящее от разных, не всегда под­дающихся учетуфакторов, широкую их изменчивость под влиянием лекарственных веществ и самого мак­роорганизма, довольно сложно бывает определить ихпотенциальную патогенность. Наконец, третья причи­на связана с тем, чтостафилококки являются пред­ставителями нормальной микрофлоры из группы условнопатогенных микроорганизмов и, наряду с не­патогенными, патогенные представителиобитают в организме людей, распространяясь при этом весьма неравномерно наразные участки человеческого тела.
Если выделение патогенногостафилококка, из кро­ви больных людей и различных полостей, которые принятосчитать стерильными, в подавляющем боль­шинстве случаев может служитьдоказательством его роли как возбудителя болезни, то присутствие ста­филококковна слизистых зева, носа и т. д. даже при явном болезненном состоянии их требуетбольшой осторожности исследователя в выводах об этиологии данных заболеваний.
Поэтому, естественно, неможет быть общих ре­комендаций,как при диагностикеразличных стафи­лококковых инфекций, так и при микробиологических исследованияхучастков тела человека и разных объ­ектов внешней среды. Широкий обмен мнениями междумикробиолога­ми научных учреждений и практических лаборато­рий, осуществляемыйна съездах и конференциях, посвященных проблемам стафилококковых инфекций, атакже при личных контактах, казалось бы,должен был привести копределенным взглядам на различ­ные методы исследования, предлагаемые для выде­ленияи идентификации стафилококков. Однако боль­шое число запросов, поступающих излабораторий СЭС и лечебных учреждений, свидетельствует о яв­ных затруднениях,которые возникают у исследова­телей при решении разных вопросов микробиологи­ческойдиагностики стафилококков, а в ряде микро­биологических учреждений бытуют ещенекоторые устаревшие методы и приемы, приводящие к непра­вильным оценкам и дажедосадным недоразумениям.
Важным условиемэффективности лабораторной диагностики является сочетанное определение каче­ственныхи количественных критериев содержания патогенных стафилококков в исследуемомматериале. Исходя из этого, я считаю необходимым изложить ряд методов основныхмикробиологических исследо­ваний, наиболее простых и доступных для каждойпрактической и научной лаборатории, которыми мы пользуемся в течение многихлет.
ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВ
Предварительная диагностикастафилококков мо­жет основываться на бактериоскопическомизучении препаратов — мазков, окрашенных по Граму.Пато­генные стафилококки, помимо гроздевидного распо­ложения,характеризуются правильной сферической формой клеток. Обнаружениестафилококков, нахо­дящихся внутри клеток, позволяет дать ответ о на­личиистафилококковой инфекции. В большинстве же случаев для точного установленияпатогенности об­наруженных стафилококков требуется выделить эти микроорганизмыв чистой культуре путем посева исследуемого материала на плотные питательныесреды.
В настоящее времяассортимент дифференциаль­ных, элективных и накопительных сред, предложен­ныхдля выделения патогенных стафилококков, весь­ма значителен и продолжаетрасширяться. Многие исследователи на основе знания основных биохими­ческиххарактеристик и питательных потребностей патогенных стафилококков при конструированиисред стремятся повысить их высеваемость и обеспечитьвозможность осуществлять их количественный учет, получить надежный способотличать потенциально болезнетворные стафилококки от сапрофитов.
Употребление жидкихнакопительных сред для первичного выделения стафилококков нецелесообраз­но, таккак лишает исследователя возможности количественной оценки содержания микробовв об­следуемых объектах, а при случайных загрязненияхспособствует ошибкам. Особенно это относится к та­ким исследованиям, какобнаружение носительства патогенных стафилококков, где доказательством яв­ляетсялишь массивный рост, либо определение этио­логической роли этих микроорганизмов«при пищевых отравлениях или наружных воспалительных процес­сах. Если жеречь идет об исследовании крови, а так­же о тех немногих случаях, когда бываетнеобходимо выявить даже единичные жизнеспособные особи этих микробов, напримерпри контроле эффективности дезинфекции, проверке на стерильность или титрационных посевах, то в подобных случаях ис­пользованиенакопительных сред вполне оправ­дано.
Из большого числаразнообразных питательных сред, опробованных для первичного выделения ста­филококков,в практике оправдал,;1' себя немногие. Обычный питательный агар(рН 7,2 7,4), приготов­ленный путем добавления 2% агар-агара к мясопептонномубульону или к триптическому перевару Хоттингера, может быть использован при исследова­нииэкссудатов из закрытых полостей. Стафилококки вырастают через 18—24 ч инкубациипри 37° С в виде гладких блестящих с ровными краями непрозрачных и слегкавыпуклых колоний. Характер пигмента вы­является лучше после дополнительногосуточного выдерживания чашек при комнатнойтемпературе (20° С) на свету. Если в исследуемом материале при­сутствуетпосторонняя флора, то по внешнему виду колонии стафилококков могут быть трудно отличимы.
Употребление кровяного агара дает возможность, кроме выявления пигмента,определить и гемолитическую активность стафилококков.При этом необхо­димо помнить, что гемолитическаяспособность, определяемая на чашках с кровяным агаром,зависит от многих факторов — вида крови, ее концентрации, наличия в нейантитоксинов, толщины слоя среды, содержания углекислого газа в атмосферекультиви­рования, густоты посева, присутствия и характера со­путствующей флорыи т. д.
При отборе колоний скровяного агара необходи­мо отвивать как гемолитические, так и не дающие гемолиза,особенно если исследование проводится на среде с человеческой или лошадинойкровью, а от­сутствие гемолиза на таких средах непозволяет за­ключить об отсутствии вообще гемолитическойактив­ности. Поэтому использование кровяного агарадля первичного посева целесообразно только при обсле­довании объектов, несодержащих посторонней мик­рофлоры, и желательно добавлять в питательную средукровь кролика или барана.
Если же проводитсяисследование гноя открытых ран или отделяемого язв или свищей, то следуетпользоваться элективно-дифференциальной средойдля  стафилококков — желточно-солевым  агаром (ЖСА) Г. Н. Чистовича. Элективность этойсреды обеспечивается высоким содержанием хлористого натрия, а добавленныйяичный желток позволяет вы­являть лецитовителлазную   активность,  которая является одним из показателей патогенности стафило­кокков и всилу этого ЖСА более четко дифференци­рует патогенных представителей, чемкровяной агар. Приготовление ЖСА несложно.
Заготовляют впрок истерилизуют в автоклаве при 120 °С» в течение 20 мин питательный агар (МПА или Хоттингера) рН 7,2—7,4, содержащий 10% поваренной соли. Передупотреблением солевой питательный агар растапливают,остужают до 45—50 °С и добавляют к нему 20% по объему стерильной желточной взве­си(1 желток куриного яйца на 200 мл физиологического рас­твора). Для лучшего эмульсирования желательно иметь колбы со стекляннымибусами. После тщательного перемешивания среду разливают по 20—25 мл в чашки,которые могут храниться в хо­лодильнике в течение нескольких дней.
Следует производитьмассивный посев исследуе­мого материала на чашки с ЖСА, а инкубацию вести втечение 2 суток при 35—37° С. Посторонняя флора резко подавляется, стафилококкиже на ЖСА выра­стают практически в чистой культуре. Непосредст­венно припросмотре чашек вокруг колоний отме­чается образование радужных венчиков имутной зоны — лецитовителлазная  реакция. Такие колонии, не менее двух из каждого посева, отвивают на скошенный мясо-пептонный агар для последую­щейпроверки выросших культур в реакции плазмо-коагуляции.
Чтобы избежать ошибок вопределении желточ­ной реакции, необходимо иметь в виду, что иногда наблюдаетсяпомутнение среды без радужного обод­ка, в этом случае проба на лецитовителлазу считает­ся отрицательной. Если же колонии,выросшие на ЖСА, не дают лецитовителлазной реакции,т. е. не окружены радужным венчиком, но имеется рост ста­филококков, то их тожесчитают подозрительными и также отвивают не менее двух из каждого такого посевана чашки с простым питательным агаром пятнамидиаметром 5—10 мм. После суточного инкубирования при37° С полученные макроколонии про­веряют в реакции плазмоагглютинации, для чего микробную массу размешиваютпетлей на стекле в каплях цитратной кроличьей или человеческой плаз­мы,разведенной 1 :4. Образование хлопьев учиты­вают в течение 30с—1 мин. Приналичии плазмоаг­глютинации такие штаммы считаютподозрительными и отвивают на скошенный агар длядальнейшего изу­чения в коагулазной реакции. Притаком отборе число пропускаемых штаммов патогенных стафило­кокков человеческогопроисхождения невелико, куль­туры же, выделенные от животных, требуется прове­рятьв реакции плазмокоагуляции.
Коагулазнаяпроба является основнымпризнаком, определяющим болезнетворность стафилококков, по­этому ее постановкатребует к себе максимального внимания. Для выявления коагулазнойактивности у стафилококков, выделенных от людей, можно поль­зоваться какцельной кровью, так и плазмой кроли­ков или человека. Можно использовать такжекровь или плазму, взятую непосредственно от человека. Консервированная плазмаили кровь, используемые для переливания, непригодны для реакции, так как к нимчасто добавляются консерванты, которые пре­пятствуютжизнедеятельности стафилококков, прояв­лению коагулазнойактивности. Не следует приме­нять кровь животных или людей, переносящих стафи­лококковыезаболевания, в особенности затяжные, так как она может оказаться нестерильной и содержать антикоагулазу.При работе со стафилококками, выде­ленными от рогатого скота, можнопользоваться бы­чьей кровью.
Асептичновзятую кровь стабилизируютс помощью 1—4% цитрата или 0,1% оксалата. Дляполучения плазмы нитратную кровь центрифугируют или отстаивают на холоду. Но,как уже говорилось, можно пользоваться и цельной кровью. Затем кровь разводятстерильным физиологическим раствором в соотношении 1: 3 или 1: 5 и разливаютпо 0,2—0,3 мл в стерильные пробирки, которые перед стерилизацией должны бытьтщательно вымыты, так как остатки химических веществ могут влиять на результат плазмокоагуляции.
Испытуемые агаровые культурыстафилококков вносят пет­лей в плазму и хорошо перемешивают. Бульонные культурывно­сят пипеткой в объеме 0,1 мл В каждом опыте необходимо ста­вить контроль скультурами заведомо патогенных стафилококков, дающих коагулазнуюреакцию, и штаммами коагулазоотрицатель-ныхмикроорганизмов. Кроме того, часть пробирок с разлитой плазмой следуетоставлять не засеянной микробами и выдержи­вать в термостате на протяжениивсего срока опыта. В случае наступления коагуляции хотя бы в одной из них весьопыт нужно переставить с новой порцией крови. Пробирки с исследуемымикультурами выдерживают в термостате при 37 °С в течение су­ток. Учетрезультатов проводится обязательно дважды: через 2—3 ч и 24 ч. Учитываютсвертывание плазмы и образование сгустков. Обычно культуры, активнопродуцирующие коагулазу, дают положительную реакциюуже через 2—3 ч. а если они обла­дают и выраженной фибринолитическойактивностью, то перво­начально образовавшиеся сгустки могут подвергнуться расплавлению к концу суток. Слабокоагулирующиештаммы могут давать положительную реакцию в поздние сроки—к концу суток. Опыты,давшие сомнительный результат, необходимо повторить.
Некоторые исследователи, получивотрицательный или сомни­тельный результат, оставляют пробирки на столе. Этогоделать нельзя, так как свертывание плазмы в более поздние сроки мо­жет носитьне специфический характер и его не следует прини­мать во внимание.
Стафилококки, дающие положительнуюкоагу­лазную пробу, должны рассматриваться как потен­циальнопатогенные, независимо от наличия или от­сутствия у них гемолитическихсвойств и характера пигмента, их относят к видуSt.aureusи в дальней­шем подвергают фаготипизациии проверке на чув­ствительность к антибио­тикам.
Углубленное изучениестафилококков показало, что основной признак па-тогенности— коагулазная реакция может под­вергаться   изменчивости при воздействии различ­ныхфакторов (Г. Н. Чистович, 1961; Е. М. Паде­рина, 1966), поэтому в ряде случаев, при выде­лении коагулазонегативных стафилококков в мо­нокультуре изпатологи­ческих очагов, целесооб­разно изучить у них дру­гие признакипотенциаль­ной болезнетворности и прежде всего — способ­ность ферментировать маннит в анаэробных условиях. Известно, что среди коагулазоотрицательных часть культур обладает способностьюрасщеплять маннит в анаэробных условиях (8,4% —поданным А. А. Ака­това и М. Л. Хатеневер,1974).
Определение ферментации маннита в анаэробных условиях технически очень просто иосуществляется путем посева уколом исследуемых культур в пробирки с высокимстолбиком полу­жидкого агара Хоттннгера,содержащего 1% маннита и 0,004% индикатора бромкрезолпурпура или бромтимолблау(рН == 7,2). Эту среду перед посевом «регенерируют»,т. е. кипятят в водяной бане, быстро охлаждают, а после посева заливают слоемсте­рильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 5 дней.Однако в значительном числе случаев результаты могут быть учтены уже черезсутки.
Наряду с реакцией плазмокоагуляции, большое значение приобрела еще однаважная способность стафилококков, характеризующая их потенциальнуюпатогенность, —дезоксирибонуклеазная   активность. Многие исследователи сообщают овысокой корреля­ции этого признака с коагулазнойактивностью и токсигенностью изучаемых культур;отмечают, что стафилококки, выделенные из патологического мате­риала, какправило, обладают ДНК-азой. Коагула-зопозитивныештаммы, полученные от носителей, могут не иметь этого фермента, и обычноотсутствие дезоксирибонуклеазной активностисочетается с низ­кой биохимической способностью и атоксигенностьютаких культур стафилококков.
По наблюдениям некоторыхисследователей, сре­ди коагулазонегативных штаммовстафилококков, но обладавших другими признаками патогенности, вы­деленных вряде случаев от больных с различными гнойными инфекциями, дезоксирибонуклеазнуюак­тивность проявляли от 10 до 29% таких культур (И. И. Панышеваи сотр., 1967;Franklinи соавт., 1966;LierdиGolde,1970).
В настоящее время этот тестможет служить на­дежным дифференциальным признаком между пато­генными инепатогенными стафилококками и в то же время может помочь в дифференциациистепени патогенности коагулазопозитивных штаммов и,без­условно, привлечет внимание к коагулазонегативным,но обладающим этим ферментом культурам ста­филококков и в ряде случаев позволитотнести по­следние к болезнетворным формам с большей уве­ренностью.
Методика определения дезоксирибонуклеазной активности не­сложна, в основу ееположен метод Джеффриса. Готовят впрок 2% МПА (рН—8,6), содержащий ДНК (2 мг/мл среды), разли­вают пофлаконам и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин. Перед разливом в чашки ксреде добавляютCaCIa(0,8 мг/мл). На подсушеннуюсреду засевают суточные культуры стафилокок­ков. После инкубации в течение18—20 ч при 37°, на поверхность среды наливаютINраствор НС1 и через 7—10мин учитывают зоны просветления, которые оценивают крестами (Н. Б. Морд­винова и соавт., 1967).
Нами предложен болееэкономичный метод для обнаружения ДНК-азы у микроорганизмов. Этот спо­соб,помимо уменьшения в 2 раза расхода ДНК на каждый опыт, позволяет использоватьболее деше­вую низкополимерную нуклеиновую кислоту,изго­товляемую Олайнским заводом химических реакти­вов.Предлагаемая методика широко апробирована на кафедре микробиологии ЛСГМИ и покачеству результатов не уступает общепринятой. Поэтому мы приводим ее подробноеописание.
Для приготовления рабочегораствора ДНК, навеску нуклеи­новой кислоты из расчета 10 мг/мл помещают вдистиллирован­ную воду, добавляют 0,5 мл 0,2% (или 0,8%) раствораNaOHна каждые 10 мл воды. Для лучшего растворения ДНКсмесь либо нагревают до кипения в водяной бане при постоянном перемеши­ваниистеклянной палочкой, либо оставляют на ночь при 37 °С в термостате. Красплавленному и остуженному до 50 °С МПА добавляют рабочий раствор ДНК израсчета 1 мг/мл (на 9 мл МПА—1 мл раствора ДНК), перемешивают, разливаютпо10л(л в пробирки, стерилизуют текучим паром в течение 30 мин или в автоклавепри 0,5 атмосферы в течение 20 мин. Срок хранения— 1—2 мес.
При постановке опытастолбики агара с ДНК растапливают, в водяной банедобавляют 0,1 мл официнального стерильного 10% р-ра СаСЬ, перемешивают ивыливают на слой хорошо под­сушенного питательного агарав чашки Петри и вновь подсуши­вают. Суточную агаровую культуру засеваютмаленькими бляш­ками (диаметр равен 2—2,5 мм) или штампом-репликатором не более20—25 бляшек, во избежание слияния зон деполимериза­ции ДНК. После18—20-часовой инкубации поверхность агара за­ливают 5млINраствора НС1 и через 3—5 мин учитывают зоны просветления. Реакцииоценивают в крестах.
При этом следует учесть, чтоинтенсивность зоны деполиме­ризации на плотной среде не всегда совпадает сколичеством про­дукции этого фермента у исследуемых стафилококков в жидких средах.
Для обнаружения фибринолизина исполь­зуют несколько усовершенствованныйметод Кристи с сотр.
Среда Кристи—Чепмена имеетследующий состав: мясной экстракт—0,45 г, пептон—0,75 г, хлористый натрий—1,2г, агар—2,75 г, вода—130 мл, рНсреды == 7,0. Стерилизуется в автоклаве и сохраняется впрок.
Перед опытом средурастапливают, остужают до 50 °С и до­бавляют 15—20% стерильной цитратнойчеловеческой плазмы. Смесь прогревается в водяной бане при 65—70°С в течение 2—5 мин до появления ясной мути, а затем разливается в чашки. Испытуемые культурызасевают «пятнами» по 15—20 на чашку.                                            Посевы инкубируют при 37 °С. Учитывается образование зон про­светлениявокруг колонии первоначально через 14 ч, затем через 24 и 48 ч, так как реакцияу различных культур течет неодина­ково быстро и у ряда штаммов она развиваетсяв более поздние сроки.
Фибринолитическийтест мы считаем весьма при­годнымдля определения потенциальной болезнетворности стафилококков, но оцениваемтолько в комп­лексе с другими признаками активности.
Гиалуронидазнаяактивность опреде­ляется   по методу Мак-Клинав модификации М. Ш. Могилевского и Л. С. Коган (1949).
Раствор гиалуронатадающий в присутствии 2 N уксусной кислоты типичный сгусток, разливается по 0,5мл в стерильные пробирки. Добавляется 0,5 мл суточной культуры стафилококка в пептонной воде. Контролями служат: гиалуропат+ дистилли­рованная вода и гиалуропат + незасеяннаясреда. Смеси встря­хиваются и выдерживаются при 37 °С 15—20 мин. Затем в каж­дуюпробирку добавляется по две капли 2 N раствора уксусной кислоты ивстряхивается. В контролях должен образоваться сли­зистый комочек. В опыте приналичии гиалуронидазы он отсут­ствует, чтосвидетельствует о деполимеризации гиалуроновой кис­лотымикробным ферментом.
Для изучения токсигенности стафи­лококков удобно пользоваться методом,предло­женным Илеком и Леви (1950), позволяющим опре­делитьтипы гемолизинов.
С этой целью готовятся чашкис питательным агаром, содер­жащим 5% отмытыхфизиологическим раствором эритроцитов барана, кролика и человека.
На поверхность питательнойсреды по диаметру помещают стерильную полоску фильтровальной бумаги, смоченную альфа-антитоксической сывороткой. Отступив 1—2 мл от краяполоски, перпендикулярно к ней засеивают штрихами исследуемые куль­туры. Посевыинкубируют при 37 °С в течение суток, после чего учитывают результаты.
Альфа-гемолизпроявляется в виде полногопросветления среды вокруг штриха культуры и нейтрализуется альфа-антиток­сическойсывороткой. Он выявляется на средах с кроличьими и бараньими эритроцитами
Бета-гемолизна агарес бараньей кровью дает частичное просветление, зона которого имеетбуровато-пурпурный оттенок. Это «тепло-холодовый»токсин и лучше выявляется после до­полнительного суточного выдерживаниячашек в холодильнике при температуре +4 °С по характерному послойному гемолизу бараньих эритроцитов и не централизуется альфа-антитоксиче­ской сывороткой. На кроличьих эритроцитахон не активен. Дельта-гемолизин определяется по узкойполоске гемолиза бараньих и кроличьих эритроцитов, ненейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой.Однако образование дельта-гемоли-зина на этих чашкахможет быть замаскировано действием аль­фа-токсина ипоэтому его следует проверять на средах с эритро­цитами человека или лошади.Таким образом, для определения всех 3 типов гемолизиновдостаточно использовать эритроциты барана и человека или лошади.
Для определениявирулентности ста­филококков существуют несколько различных методов заражениябелых мышей.
Наиболее простым являетсявведение 0,1 мл суточной бульон­ной культуры испытуемого стафилококка вхвостовую вену. Учет гибели животных осуществляется в течение 10 суток,регистри­руют наличие абсцессов в почках.
Удобно пользоваться способомBadenskiи сотр. (1958), Су­точнаябульонная культура центрифугируется при 3000 об/мин — 30 мин. Полученный осадокресуспендируется в половинном объ­еме декантата и в количестве 0,05 мл вводится 6 мышам позадиглазного яблока в окологлазничную клетчатку. Культуру, вызы­вающую гибельполовины и более зараженных мышей в течение 6 дней, считают вирулентной.
При этих методах заражениявирулентной куль­турой у животных развивается общин септический процесс спреимущественным поражением почек. Основная гибель мышеи происходит на 3—5-йдень после заражения.
Другие способы заражениябелых мышей (внутрибрюшинный и интраназальный)требуют в десятки
раз большей заражающей дозы,максимум гибели мышей приходится на 1—2-е сутки, что характери­зуетпреимущественно токсический компонент про­цесса (С. А. Анатолий, И. И. Антоновская, 1967).
В то же время рядисследователей отдают пред­почтение более простому технически внутрибрюшинномуспособу заражения мышей, который одновре­менно позволяет изучать клеточные игуморальные механизмы развития инфекции.
Сопоставление вирулентностистафилококков для белых мышей с отдельными факторами их патогенности показало,что вирулентность штаммов, по дан­ным большого числа исследователей, коррелирует с уровнем альфа-гемотоксина.Что касается других признаков патогенности и их корреляции с вирулент­ностью,то получены разноречивые сведения. Так, по данным С. А. Анатолия (1969),вирулентность штам­мов коррелировала с продукцией бета-гемолизина, летального фактора, лецитовителлазы,гиалуронидазы и коагулазы.А. К. Акатов (1968) не отмечает кор­реляциивирулентности с коагулазной, лециговител-лазной,фибринолитической активностью, не установ­ленакорреляция с дельта-токсигенностью.
Для сравнения вирулентностистафилококковых культур можно использовать их способность вызы­вать дермонекротическую реакцию у кроликов.
Готовят 4-миллиардную взвесьсуточной агаровой культуры стафилококка в физиологическом растворе, а изполученной гу­стоты делают разведения, чтобы получить 2- и 1-миллиардныевзвеси. Из каждого разведения в объеме 0,1 мл, что составляет 100, 200, 400миллионов микробных тел, вводят кролику в вы­стриженную или депилированнуюнакануне кожу. На одном кро­лике можно одновременно поставить до 8 внутрикожныхпроб. Ежедневно отмечают проявления дермонекротическойреакции, а окончательно на 4-е сутки. За минимальную дермонекротиче­скуюдозу принимают то наименьшее количество культуры, кото­рое дает некроз на 4-есутки (Г. В. Выгодчиков, 1963).
Список использованнойлитературы
1.     А.М.Смирнова,А.А.Трояшкин, Е.М.Падерина: микробиология ипрофилактика стафилококковых инфекций– «Медицина», 1977.
2.     Стафилококковые инфекции:российский сб. науч.тр. – С.-П.,1991.
3.     А.М.Смирнова: вопросыиммунологии и микробиологии стафилококковых и стрептококковых инфекций –Ленинград, 1975.
4.     Лекция по теме.
    5.  Методическая разработкакафедры.