|
Оптическая спектрометрия с использованием эффекта плазмонного резонанса позволяет изучать белки, обладающие оптической плотностью в видимом диапазоне электромагнитного излучения (хромопротеины) с помощью измерения поглощения света на определённых («характеристических» для конкретных молекул) длинах волн. Однако для таких измерений требуются довольно высокие концентрации белкá, да и пространственное разрешение этого метода весьма низкое (обычно изучают растворы молекул, находящиеся в спектрометрических кюветах, и речи о том, где именно в клетке расположены изучаемые молекулы, просто не идёт).
Гораздо большей чувствительностью обладают методы, основанные на измерении флуоресценции. Вместе с конфокальной микроскопией они позволяют определять месторасположение молекул внутри живой клетки, но тут необходимо модифицировать изучаемые молекулы специальными молекулами-метками, что не всегда желательно и возможно.
Другой часто используемый в биологии метод — спектроскопия ядерного магнитного резонанса — также требует довольно больших концентраций белка и часто — изотопного мечения объекта, сложного в условиях живых систем.
Методика с использованием плазмонного резонанса основана на введении в живые клетки наночастиц металла определенного размера (20–30 нм). При этом электроны на поверхности частиц из таких металлов как золото или серебро коллективно осциллируют в ответ на облучение светом определённой длины волны. Резонансные частоты этих наночастиц зарегистрировать намного легче, чем слабый (из-за очень низких концентраций) оптический сигнал от биологических молекул, что и позволяет проводить измерения.
Измерения основаны на явлении, называемом миграцией энергии плазмонного резонанса(МЭПР), которое заключается в том, что молекулы белка, адсорбирующиеся на поверхности золотых частиц, как бы «оттягивают» на себя часть энергии плазмонного резонанса, что достаточно легко зарегистрировать по специфическим «провалам» в спектрах рассеяния, «снимаемых» с этих частиц.
Главным условием этого эффекта является перекрывание частоты плазмонного резонанса и частот оптического поглощения белка, — требование, аналогичное тому, которое накладывается и в более широко известном методе резонансного переноса энергии флуоресценции. Именно этим условием и определяется то, что частицы состоят из золота, и их размер определяет пик плазмонного резонанса в области 530–580 нм, перекрывая диапазон поглощения цитохрома (с), который был выбран для исследования.
В установке, приведенной на рисунке 12.5, наночастицы золота освещаются под определённым углом через фазовоконтрастный конденсор. Изучаемым параметром является светорассеяние (на величину которого как раз и влияет плазмонный резонанс), регистрируемое цветной камерой и анализируемое с помощью спектрофотометра.
«Тушение» плазмонно-резонансного спектра, обусловленное миграцией энергии на адсорбирующиеся на поверхности наночастиц биомолекулы, проявляется в виде специфических «провалов» на спектрах рассеяния в диапазонах длин волн, совпадающих с пиками оптического поглощения молекул белка (рис. 1.17г). Для эффективного переноса энергии необходимо, чтобы спектры рассеяния и поглощения перекрывались. Поскольку такая резонансная миграция является прямым переносом, и, следовательно, происходит быстрее и эффективнее, чем оптическое поглощение, спектры МЭПР могут быть зарегистрированы обыкновенной оптической системой, что было бы невозможно при использовании «обычной» оптической спектроскопии.
Рис. 1.17 Явление «тушения» плазмонного резонанса вследствие миграции энергии на биомолекулы. А. Схема установки. Б. Типичный спектр рэлеевского (упругого) рассеяния наночастиц золота. В. Типичный спектр оптического поглощения белка.
Характерные пики и провалы на приведенных графиках (Г): для окисленной формы Fe III (530 нм); для восстановленной Fe II (525 нм и 550 нм); провалы на спектре плазмонного резонанса (рассеяния) вызванны миграцией энергии на биомолекулу в диапазонах длин волн, соответствующих пикам оптического поглощения белкá.
Для исследований не обязательно использовать именно золото: аналогичные эксперименты были проведены и на серебрянных наночастицах, взаимодействующих с гемоглобином. Если же использовать другие металлы, то можно изучать аналогичный эффект в ультрафиолетовой или ближней инфракрасной областях спектра, например, чтобы идентифицировать взаимодействие с нуклеиновыми кислотами или большинством белков, не поглощающих свет в видимой области.
Исследователи считают, что наиболее перспективная область использования нового метода (учитывая его беспрецедентную чувствительность и возможность применения в живой клетке) — это генетический анализ молекул РНК и продуктов экспрессии генов, редко включающихся в «нормальных» условиях и про работу которых почти ничего не известно. Кроме того, можно будет определять белки-спутники различных форм рака, токсины и вирусные частицы.
|