Пенза, 2008 г
Прогресс в изучении протеолитических ферментов мозга, а также других органов и тканей, наметившийся в последние годы, обусловлен тем, что на смену традиционным представлениям о роли пептидгидролаз, как внутриклеточной системе деградации белка, сформировалось новое понимание их биологической роли. При этом, интересы нейрохимиков концентрируются на изучении протеолитических ферментов внелизосомальной локализации, поскольку становится понятным, что многие из этой группы пептидгидролаз имеют непосредственное отношение к физиологическим процессам, лежащим в основе функциональной деятельности нервной системы.
В нервной ткани, как и в большинстве органов и тканей животных, имеется сложная система протеолиза, включающая различные по внутриклеточной локализации и специфичности действия протеолитические ферменты . В настоящее время внутриклеточные ферменты разделяют на две группы в соответствии с локализацией в клетке и их функциональной ролью .
К первой группе относятся пептидгидролазы лизосом, а ко второй – ферменты внелизосомальной локализации. Последние в свою очередь в зависимости от их локализации и специфических функций подразделяют на три подгруппы.
Изначально разделение было основано на представлении о существовании двух путей катабализма белка в клетке – лизосомального и нелизосомального, но исходя из сегодняшних представлений о биологической роли пептидгидролаз нелизосомальной локализации, этот принцип разделения, по-видимому, не является определяющим. На самом деле гидролиз белка в клетке может идти по двум путям – лизосомальному и нелизосомальному, однако, вклад в процесс деградации белка этих путей не равнозначен. Различие определяется прежде всего особенностями внутриклеточной организации систем пептидгидролаз лизосом и нелизосомальной локализации. Надо полагать, что лизосомальный путь белкового катаболизма более эффективный как по скорости, так и по глубине деградации белка, поскольку он обеспечивается различным по специфичности действия комплексом ферментов эндо- и экзопептидазного характера действия одних и тех же компартменов – лизосом. Лимитирующим фактором, определяющим скорость распада белка в данном случае является образование вторичных лизосом. Последующий ход событий характеризуется быстрой деградацией фагоцитируемого белка ферментами лизосом .
Конечными продуктами гидролиза белка в лизосомах являются преимущественно свободные аминокислоты . Протеолитические ферменты лизосомального аппарата, таким образом, осуществляют полный гидролиз белка, оказавшегося внутри лизосом. Потенциальные возможности лизосомального пути внутриклеточной деградации белка, судя по возрастанию количества лизосом при изменении функционального состояния организма и тем более при патологии, достаточно велики, чтобы обеспечить катаболическую фазу белкового обмена в клетке.
Тем не менее, в клетке имеется система протеолитических ферментов нелизосомальной локализации. В нервной ткани эта система представлена большим набором как эндо-, так и экзопептидаз . Для некоторых ферментов установлена локализация их в клетке, изучены особенности регионального распределения. В клетке практически нет компартментов, где бы не были обнаружены протеолитические ферменты.
Надо полагать, что определенная часть белков нервной ткани подвержена действию протеолитических ферментов внелизосомальной локализации, однако, вклад пептидгидролаз этой системы в общий процесс внутриклеточной деградации белка значительно меньший по сравнению с лизосомальной системой . Обусловлено это множеством факторов, которые и определяют особенности системы протеолиза внелизосомальной локализации.
Наиболее существенным фактором является разобщенность в локализации и действии пептидгидролаз. Ферменты нелизосомального пути гидролиза белка большей частью находятся в связанном состоянии с мембранными образованиями различных субклеточных структур . Несомненно, в клетках мозга имеется определенная организация в локализации пептидгидролаз, определяющая их степень и последовательность участия в каталитическом процессе, однако трудно предположить, что в масштабах клетки пептидгидролазы нелизосомальной локализации представляют собой систему непрерывного конвейера, где белок относительно быстро и полно разрушается до аминокислот. Подобный механизм разрушения белка в клетке известен лишь с участием лизосомальных пептидгидролаз. Другие замкнутые системы сообщества пептидгидролаз, близкие к лизосомальным (пептидгиролазы секреторных везикул), содержат ограниченный набор индивидуальных ферментов с ограниченной специфичностью действия . Их протеолитические ферменты участвуют в двух, трех актах гидролиза белка при процессинге секретируемых белков и регуляторных пептидов . В основном же, пептидгидролазы, находящиеся в различных компартментах клетки, естественно, лишены возможности одновременно действовать на белок, подвергая его полному гидролизу. Разобщенность в локализации, таким образом, является одним из эффективных факторов, сдерживающих полную деградацию белка ферментами нелизосомальной локализации и является важнейшим фактором в определении их функций.
И наконец, некоторые специфические свойства пептидгидролаз, например, их относительная лабильность по сравнению с лизосомальными, зависимость от ионов металлов, избирательная специфичность по отношению к внутриклеточным белкам, пептидам ставит ферменты внелизосомальной локализации вне участия в генерализованном протеолизе.
Перечисленные особенности свойств, локализации ферментов нелизосомальной системы, по-видимому, не в полной мере относятся к ферментам гиалоплазмы. В растворимой фракции при гомогенизации различных отделов и структур нервной ткани обнаруживается определенная часть как эндо- так и экзопептидаз . Известно, что растворимая фракция содержит протеасомы, отвечающие за распад белков до коротких пептидов, и большой набор амино-, карбокси-, и дипептидаз с различной специфичностью действия . При этом не исключено, что в неразрушенной клетке имеет место определенная компартментализация этой группы экзопептидаз в виде сообществ (метаболонов?) или надмолекулярных комплексов. Вероятно пептидазы гиалоплазматической локализации по функциональной организации, а значит и по эффективности участия в процессе деградации белка, представляют собой систему менее сходную с системой мембраносвязанных ферментов нелизосомальной локализации и более сходную с системой ферментов лизосом. Более того, многие белки в силу своей субклеточной локализации являются более доступными для действия цитоплазматических пептидаз, чем лизосомальных.
Но отличительным и весьма существенным фактором является как раз то, что в гиалоплазме, в отличие от лизосом, содержится только - эндопептидазы с ограниченной возможностью их участия в генерализованном протеолизе. Это, например, протеасома, кальпаин, эндопептидазы . и . . Экзопептидазы же гиалоплазмы активны в большинстве своем по отношению к низкомолекулярным пептидам, и если биологическая роль этой группы ферментов и заключается в деградации внутриклеточного белка, то их участие важно при этом лишь на заключительных стадиях.
Однако, известно, что, среди экзопептидаз имеются ферменты, которые непосредственно могут участвовать в образовании физиологически активных пептидов – регуляторов и модуляторов функций нейронов, а также в гидролизе (инактивации) нейропептидов . Данное обстоятельство не позволяет все без исключения ферменты гиалоплазматической локализации рассматривать как инструмент деградации.
Встает вопрос о значении системы пептидгидролаз нелизосомальной локализации. В настоящее время он довольно успешно решается. Что касается понимания и установления функций большей части отдельных пептидгидролаз нелизосомальной локализации то далеко не все еще ясно, но в целом биологическая роль этой системы становится понятной.
На сегодня мы имеем множество примеров, убедительно доказывающих образование физиологически активных форм белков, ферментов, гормонов, нейропептидов с участием пептидгидролаз нелизосомальной локализации. И этот путь является важнейшим при образовании физиологически активных форм биомолекул пептидной природы. То есть, назначение части пептидгидролаз нелизосомальной локализации заключается в обеспечении образования биологически активных клеточных компонентов белковой природы из неактивных предшественников.
Исходя из сказанного об особенностях биологической роли протеолитических ферментов нелизосомальной локализации, трудно согласиться с существующим представлением о двух путях катаболизма белка в клетке, если в слово «катаболизм» вкладывать его устоявшееся понятие – деградация. Элемент катаболизма с участием пептидгидролаз нелизосомальной локализации присутствует, поскольку имеет место реакция гидролиза, характерная для процесса распада. Однако здесь в результате реакции появляется пептидный компонент, обязательный для функционирования клетки. В настоящее время для отдельных этапов нелизосомального пути гидролиза белка используют термин «ограниченный протеолиз», подразумевая под этим образование физиологически активного компонента из его предшественника .
В этом случае на наш взгляд адекватным термином был бы «протеолитическая модификация», поскольку термин «ограниченный протеолиз» указывает лишь на то, что свершен акт гидролиза ограниченного числа пептидных связей, и не говорит о том, что этот акт сопровождается образованием новой формы белка (пептида), наделенного специфическими функциями.
Таким образом, если с участием пептидгидролазы осуществлен гидролиз пептидной связи в белковой молекуле и при этом образовался белок с новыми свойствами и функцией, обеспечивающего нормальное функционирование клетки, можно ли в таком случае, говоря о двух путях деградации белка – лизосомальном и нелизосомальном, приравнивать эти пути по функциональному назначению? Можно говорить о взаимосвязи этих путей, поскольку некоторые белки, пептиды, образовавшиеся в реакциях с участием ферментов нелизосомальной локализации, могут быть гидролизованы в лизосомах и наоборот.
Из вышесказанного становится очевидным, что протеолитическая система нелизосомальной локализации в отличие от лизосомальной, где осуществляется генерализованный распад белка, имеет отношение к образованию активных форм молекул пептидной природы, необходимых для функционирования клетки, организма, то есть эти две системы различаются по своему функциональному назначению.
В нервной ткани обнаружены ферменты, участвующие в модификации некоторых нейроспецифических белков, в обмене нейропептидов . Эти и подобные по функциональному назначению пептидгидролазы нелизосомальной локализации представляют исключительный интерес для понимания нейрохимических механизмов функционирования нервной системы. В изучении пептидгидролаз нелизосомальной локализации нервной ткани в последнее время достигнуты значительные успехи. Обзор работ по этим ферментам, который будет представлен ниже, является свидетельством большого интереса к пептидгидролазам нервной ткани нелизосомальной локализации, и вместе с тем это лишь первые шаги в выяснении функциональной роли этой группы пептидгидролаз.
Пептидгидролазы нелизосомальной локализации по сравнению с таковыми лизосом изучены в меньшей степени. Причиной этому было множество факторов, среди которых можно выделить длительное время бытовавшее представление о роли внутриклеточных пептидгидролаз, как аппарате деградации белка и более высокую активность ферментов лизосом по сравнению с другими . Лизосомальные пептидгидролазы были первыми в ряду изучаемых тканевых протеиназ . Этому способствовали и факторы методического характера (доступность субстратов, разработка методов тестирования), и достижения в области биохимии и смежных наук. В частности, открытие Де Дювом лизосом в значительной степени стимулировало изучение лизосомальных ферментов, в том числе лизосомальных пептидгидролаз мозга.
Пептидгидролазы нелизосомальной локализации нервной ткани начали изучаться с некоторым опозданием по сравнению с лизосомальными, но на сегодня идет значительное опережение в выяснении физико-химических свойств и роли ферментов нелизосомальной локализации. Среди пептидгидролаз нервной ткани нелизосомальной локализации в относительно лучшей степени изучены и интенсивно исследуются в наши дни кальций-зависимые протеиназы и ферменты обмена регуляторных пептидов. Интерес к этим ферментам вполне понятен, поскольку они принимают участие в обмене если не нейроспецифических белков и пептидов, то таких, содержание которых в нервной ткани значительно выше по сравнению с другими органами и тканями . В связи с этим, надо полагать, что биологическая роль пептидгидролаз нервной ткани отражает специфику обменных процессов, раскрытие которых необходимо для понимания нейрохимических механизмов деятельности нервной системы.
К эндопептидазам относятся пептид-гидролазы, катализирующие гидролиз пептидных связей внутри белковой молекулы. В настоящее время в нервной ткани обнаружено несколько эндопептидаз нелизосомальной локализации. Следует отметить, что в цитоплазме обнаружено только две эндопептидазы, способные катализировать гидролиз высокомолекулярных белков (кальпаин и мультикаталитический протеиназный комплекс), остальные эндопептидазы цитоплазмы и плазматической мембраны (эндопептидазы ., ., ., пролилэндопептидаза) способны расщеплять лишь сравнительно короткие пептиды, длина которых, как правило, не превышает - аминокислотных остатков . В секреторных везикулах содержится достаточно много эндопептидаз, способных расщеплять высокомолекулярные белки, однако практически все они обладают строгой субстратной специфичностью и способны расщеплять только субстраты, содержащие пары остатков основных аминокислот . Ниже приведена характеристика наиболее важных и относительно хорошо изученных эндопептидаз нервной ткани нелизосомальной локализации.
Сигнальные пептидазы удаляют сигнальный пептид от препробелка и играют центральную роль в секреторном пути, а также в доставке белков в межмембранное пространство митохондрий . Каталитический механизм расщепления препробелков и физико-химические свойства ферментов, осуществляющих его, малоизучен . Однако полагают, что существует несколько сигнальных пептидаз, принадлежащих к новому семейству сериновых протеаз, обладающих специфичностью к определенной последовательности гидрофобных аминокислот и проявляющих максимальную активность при нейтральных значениях pH .
К семейству прогормонконвертаз (фуриновых эндопептидаз) в настоящее время относят ряд субтилизиновых эндопептидаз, локализованных в секреторных везикулах различных тканей. Эти ферменты расщепляют различные пропептиды по парам основных аминокислот . Они имеют сходные физико-химические, каталитические и иммунологические свойства, но отличаются по значениям молекулярной массы, связанными с отличиями в строении С-концевого домена . Они проявляют максимальную активность при pH,-,, активируются ионами Ca+
, ингибируются ЭДТА .
В тканевом, региональном и клеточном распределении различных ферментов данного семейства обнаружены существенные отличия. Так, фурин широко распространён во всех тканях организма, тогда как PC/ и PC локализованы, в основном, в эндокринных и нейроэндокринных клетках, а PC обнаружена в семенниках . В нейрональных клетках, осуществляющих процессинг ПОМК, экспрессируется PC, но не PC/ .
В субстратной специфичности указанных ферментов также обнаружены некоторые отличия. Так, PC расщепляет хроматогранин A, а PC/ – нет, PC/ расщепляет проинсулин преимущественно при Arg-Apr, а PC – при Lys-Arg .
В настоящее время не вызывает сомнений, что прогормонконвертазы вовлекаются в процессинг предшественников биологически активных пептидов и секретируемых белков . Эти ферменты не являются пептид-специфичными, но отличия в их субстратной специфичности могут способствовать образованию различных продуктов из одних и тех же предшественников в разных тканях .
Ca+
-активируемая нейтральная протеиназа (CANP, кальпаин, Ca+
-зависимая нейтральная протеиназа, (К.Ф....)) впервые обнаружена в головном мозге крысы Guroff . Фермент выделен и очищен из головного и спинного мозга, а также других тканей различных видов животных.
CANP из различных источников имеет оптимум pH при pH,-, с максимумом при pH,-,, он является метал-зависимой тиоловой протеиназой и требует для проявления активности присутствия восстанавливающих реагентов. Фермент ингибируется хелатирующими агентами; N-этилмалеимидом, ПХМБ, ПХМФС, иодуксусной кислотой; ингибиторами тиоловых протеиназ лейпептином, антипаином и мерсалилом; N,a-тозил-L-лизин хлорметилкетоном; додецилсульфатом натрия; мочевиной; и полифосфатами АТФ, АДФ, ИТФ и специфичным дипептидным ингибитором кбз-Val-Phe . L-тозиламид---фенилэтилхлорметилкетон, пепстатин, апротинин, ФМСФ, бестатин, фосфорамидон, ингибиторы трипсина из сои и лимы не влияют на активность кальпаина.
Кальпаин является Ca+
-зависимым металлоферментом. По чувствительности к ионам Ca+
выделяют три формы фермента:
а) CANP I (mCANP) – кальпаин, активируемый микромолярными концентрациями кальция, проявляет половину максимальной активности при концентрации ионов Ca+
около мкМ, максимальную – около мкМ ;
б) CANP II (mCANP) – кальпаин, активируемый милимолярными концентрациями кальция, проявляет половину от максимальной активности при концетрации кальция - мкМ, максимальную – - мМ ;
в) CANP III – проявляет максимальную активность при концентрации Ca+
мкМ, подвергается быстрому автолизу, после чего проявляет максимальную активность в присутствии, мкМ Ca+
.
Пептидное картирование трёх форм кальпаина с различной чувствительностью к ионам Ca+
показало, что все три формы состоят из общих пептидов, достоверных отличий между этими формами не обнаружено. Моноклональные антитела, полученные к CANP II, в одинаковой степени реагируют и с CANP I и III .
CANP также активируется ионами Sr+
и Ba+
, ионы Cu+
, Pb+
и Zn+
ингибируют его, другие двухвалентные ионы не влияют на активность фермента .
И m- и mCANP могут быть представлены как одиночной полипептидной цепью с молекулярной массой около кДа, так и гетеродимерами, состоящими из одной большой субъединицы с молекулярной массой около кДа и - кДа и малой субъединицы, причём молекулярная масса малой субъединицы в зависимости от источника и способа выделения может колебаться от кДа до кДа . Кроме того, имеются сообщения об обнаружении трёх высокомолекулярных форм CANP с молекулярной массой в области - кДа и низкомолекулярной формы (- кДа) . Все формы имели очень близкие, но не идентичные иммунологические свойства. В присутствии ионов Ca+
все формы CANP подвергаются быстрому автолизу . По-видимому, такая гетерогенность CANP может быть обусловлена не только существованием всех этих форм in vivo но и появлением их в результате автолиза при очистке. Следует также отметить, что для активации CANP II и III необходимы концентрации Ca+
, значительно превосходящие физиологические, поэтому в организме эти формы являются, фактически, проферментами.
И кальпаин I, и кальпаин II в нервной ткани обнаруживаются как в растворимой, так и в связанной с мембранами и цитоскелетом формах, причём если на долю мембраносвязанной mCANP приходится -% от общего количества mCANP в клетке, то на долю мембраносвязанной mCANP приходится около % от общего количесва mCANP . Мембраносвязанная форма CANP ассоциирована преимущественно с миелином, но обнаруживается и в синаптических мембранах .
CANP обнаружена практически во всех тканях млекопитающих. Её содержания в ЦНС достаточно высокое . Наибольшая активность кальпаина обнаруживается в спинном мозге, несколько меньше – в амигдале, среднем мозге и белом веществе мозжечка. Активность фермента в коре больших полушарий и сером веществе мозжечка достаточно низкая . То есть, наиболее высокое содержание кальпаина наблюдается в богатых миелином областях. Фермент обнаружен как в нейронах, так и в глии . Он локализован преимущественно в нейронах неокортекса и пирамидных нейронах гиппокампа, идентифицирован в перикарионе и проксимальных дендритах этих нейронов .
CANP расщепляет большинство белков цитоскелета и нейрофиламентов, белки микротрубочек, основной белок миелина, глиальный фибриллярный кислый белок, тубулин, спектрин, миофибриллярные белки и окисленную B цепь инсулина, виментин, рецептор фактора роста эпидермиса, быстро транспортируемые белки, cdk активатор белка p, эукариотический фактор инициации G . Кальпаин также активирует кальций-активируемую фосфолипид-зависимую протеинкиназу, осуществляет ограниченный протеолиз фодрина . Имеются сведения о том, что CANP расщепляет предшественник киоторфина, динорфин -, BAM-P, a- и b-неоэндорфины, ангиотензин I и нейротензин, а также синтетические субстраты Suc-Leu-Met-NHMec, Suc-Leu-Tyr-NHMec, Boc-Val-Leu-Lys-NHMec, Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-NHMec, Boc-Leu-Thr-Arg-NHMec .
Активность фермента подавляется эндогенными ингибиторами тиоловых протеиназ цистатинами, кининогенами, ингибиторами тиоловых протеиназ из плазмы крови . Кроме этих неспецифичных ингибиторов, в различных тканях животных, в том числе и мозге, обнаружены специфичные ингибиторы CANP – кальпстатины, не влияющие на активность других протеиназ. Ингибиторы из разных тканей имеют несколько отличающиеся свойства, их молекулярная масса колеблется от кДа до кДа. Однако высокомолекулярные кальпстатины, имеющие несколько ингибиторных центров, могут подвергаться протеолизу, при этом образуются фрагменты, сохраняющие ингибиторную активность, но обладающие меньшим числом связывания с ферментом. Молекулярная масса самого короткого фрагмента, сохраняющего ингибиторную активность, составляет кДа . То есть, все многообразные формы кальпстатинов, обнаруженные в различных тканях, могут, вероятно, образовываться из одного предшественника в результате его протеолитического расщепления различной глубины. При взаимодействии кальпстатина с CANP происходит протеолиз кальпстатина, при этом образуются связанные с ферментом фрагменты, подавляющие его активность. Распределение ингибитора CANP в ЦНС соответствует таковому CANP, в особенности mCANP .
В различных тканях обнаружен эндогенный активатор CANP. Активатор CANP из мозга представляет собой термостабильный гомодимер с молекулярной массой кДа, он повышает активность только микро-кальпаина примерно, но при этом не изменяет сродства фермента ни к субстрату, ни к ионам Ca+
. Активатор кальпаина связывается с каталитической кДа субъединицей фермента, вызывая диссоциацию гетеродимера фермента, а затем усиливает автолиз каталитической субъединицы, что и приводит к активации кальпаина . В мозге обнаружены растворимая и связанная с мембранами (цитоскелетом) формы активатора .
Исходя из способности CANP с высоким сродством гидролизовать многие белки микротрубочек и белки цитоскелета, представляется, что основные функции кальпаина нервной системы состоят в ограниченном протеолизе этих белков, что может приводить к изменению физико-химических и функциональных свойств данных белков в зависимости от потребности клетки . Фермент, вероятно, может участвовать в регуляции концентрации различных рецепторов на поверхности клеточных мембран как путём их прямого протеолиза, так путём протеолиза фодрина . Кроме того, CANP активирует кальций-активируемую фосфолипид-зависимую протеинкиназу, вовлекающуюся во внутриклеточный ответ на воздействие некоторых гормонов, и гидролизует эукариотический фактор инициации G . Таким образом, ограниченный протеолиз кальпаином специфичных белков может быть частью внутриклеточного механизма действия некоторых гормонов. CANP также вовлекается в процессы димиелинизации и клеточного апоптоза .
Синаптическая локализация CANP, его участие в гидролизе некоторых нейропептидов, вызывает соблазн предположить возможность её участия в обмене биологически активных пептидов, однако кальпаин локализован на внутренней, а не на внешней поверхности синаптической мембраны и поэтому вряд ли может вовлекаться в деградацию нейропептидов in vivo.
Эндопептидаза . (NEP, нейтральная эндопептидаза, энкефалиназа, энкефалиназа A, неприлизин, CALLA) – интегральный трансмемранный белок плазматических мембран, катализирующий расщепление пептидных связей внутри низкомолекулярных пептидов с N-конца остатков гидрофобных аминокислот. Она выделена и очищена из почек, семенников, гипофиза, мозга, стриатума различных видов животных. Фермент из различных источников имеет очень близкие иммунологические и физико-химические свойства, но отличается степенью гликозилирования . Поэтому молекулярная масса фермента из различных органов и тканей варьирует в пределах от кДа до кДа. Имеется единичное сообщение об обнаружении формы NEP с Mr около кДа, однако наличие этой формы может быть обусловлено агрегацией молекул фермента посредством дисульфидных мостиков . Различия в степени гликозилирования могут обуславливать и колебания pI от, до, .
NEP проявляет максимальную активность при pH около, и является Zn+
-зависимой металлоэндопептидазой. Она сильно ингибируется о-фенантролином, ЭДТА, дитиотреитолом, химостатином, фосфатом и NaCl, специфичными ингибиторами тиорфаном и фосфорамидоном и другими синтетическими ингибиторами . N-этилмалеимид, ПХМБ, ФМСФ, апротинин, пуромицин, бацитрацин, ингибиторы АПФ каптоприл, SQ, SQ не влияют на её активность . Активность фермента подавляется некоторыми биологически активными пептидами и их фрагментами: Leu-энкефалином (IC мкМ), Met-энкефалином (IC мкМ), ангиотензинами I и II (IC мкМ), брадикинином (IC мкМ), Tyr-Gly-Gly-Phe (IC мкМ) . Не исключено, что in vivo вышеперечисленные пептиды могут участвовать в регуляции активности фермента.
Нейтральная эндопептидаза расщепляет низкомолекулярные пептиды (с молекулярной массой, как правило, не более Да, единственное исключение интерлейкин b), состоящие не менее чем из аминокислотных остатков с N-конца гидрофобных аминокислот. Наиболее специфичным субстратом для фермента следует считать дансил-Gly-pNOPhe-bAla (Km
мкМ), однако не исключено, что и он может расщепляться отличными от NEP эндопептидазами. Эндопептидаза . in vitro расщепляет различные биологически активные пептиды и их фрагменты с Km
порядка - мкМ .
NEP широко распространена в тканях млекопитающих. Максимальное количество фермента содержиться в почках, примерно в раза меньшее – в семенниках, ещё в раза меньшее – в лимфатических узлах. Содержание фермента в различных отделах кишечника составляет -%, в поджелудочной железе, надпочечниках, аденогипофизе и спинном мозге – около % от такового в почках. В отделах головного мозга содержание фермента в - раз меньше, чем в спинном мозге. Максимальная активность NEP обнаружена в стриатонигральном пути, в - раз ниже (в порядке убывания) – в мозжечке, коре больших полушарий и таламусе .
В нервной системе NEP обнаружена в нейронах, Шванновских клетках периферических нервов, формирующих миелин, гонадотропных клетках гипофиза . Фермент локализован на пресинаптической и постсинаптической мембранах и мембранах терминалей аксонов . На мембранах дендритов и клеток глии он не обнаруживается . В стриатонигральном пути фермент связан с афферентными волокнами . Показана локализация молекул NEP вблизи m- и/или d-опиоидных рецепторов и рецепторов вещества P .
Полагают, что биологическая роль NEP в ЦНС заключается в генерализованной деградации нейропептидов после связывания последних с рецепторами и модуляции нейропептидов после их секреции из пресинаптической мембраны . Однако NEP не является ферментом, отвечающим за деградацию одного какого-то определённого нейропептида или группы нейропептидов, а вовлекается в деградацию большого числа нейропептидов .
Эндопептидаза . (КФ ...) – цинк-зависимый металлофермент, состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой от кДа до кДа, проявляет максимальную активность при pH около,, активируется дитиотреитолом. Он ингибируется ЭДТА, ЭГТА,-фенантролином, N-этилмалеимидом, гидроксимеркурийбензоатом и специфическим ингибитором N-[-(R,S)-карбокси--фенилпролил]-Ala-Ala-Phe-п-аминобензоатом . ФМСФ не влияет на его активность .
Наиболее высокое содержание фермента обнаружено в мозге, семенниках и гипофизе, в остальных тканях содержание фермента очень низкое . В мозге наиболее высокая активность фермента найдена в клетках Пуркинье мозжечка, клетках зубчатой извилины гиппокампа и отдельных ядрах гипоталамуса . Эндопептидаза . обнаружена как в нейронах, так и в клетках глии . Около % фермента находится в растворимой форме и % связано с мембранами .
Эндопептидаза . превращает некоторые проэнкефалин и продинорфин-происходящие пептиды в энкефалины и деградирует различные биологически активные пептиды: брадикинин, нейротензин ангиотензины I и II, рилизинг фактор лютеинизирующего гормона расщепляет человеческий белок-предшественник амилоида .
Специфический ингибитор фермента N-[-(R,S)-карбокси--фенилпролил]-Ala-Ala-Phe-п-аминобензоат блокирует образование Leu-энкефалина из динорфина -, a- и b-неоэндорфинов и Met-энкефалина из Met-энкефалин-Arg-Gly-Leu, вызывает антиноцепцию и сильное снижение артериального давления .
В настоящее время не вызывает сомнений, что эндопептидаза . вовлекается в обмен биологически активных пептидов, в частности образование энкефалинов из коротких предшественников, в деградацию брадикинина и рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона .
Эндопептидаза . (нейролизин, КФ ...) обнаружена в растворимой и в мембранной фракциях мозга и почек, показано, что фермент присутствует в астроцитах . Обе формы фермента обладают очень близкими свойствами, имеют молекулярную массу около кДа, pI,-,, состоит из одной полипептидной цепи и не является гликопротеином. Фермент проявляет максимальную активность при pH,, ингибируется дитиотреитолом, ЭДТА и N-(фенилэтилфосфонил)-Gly-L-Pro-L-аминогексановой кислотой; ингибиторы АПФ и эндопептидаз . и . не влияют на его активность . Фермент расщепляет нейротензин, брадикинин, вещество P, ангиотензины I и II, люлиберилин, динорфины - и - и a-неоэндорфин . Динорфин - является мощным ингибитором (IC =, мкМ) эндопептидазы . и не расщепляется ею, поэтому Barelli et al. считают, что динорфин - участвует в регуляции концентрации нейропептидов in vivo посредством ингибирования активности эндопептидазы .. Считают, что in vivo фермент вовлекается в обмен биологически активных пептидов, но он не является пептид-специфичным, как можно подумать из его названия – «нейролизин» .
Пролилэндопептидаза (КФ ...) расщепляет пептидные связи с С-конца пролина . Фермент мозга имеет Mr кДа, проявляет максимальную активность при рН,, ингибируется диизопропилфторфосфатом и кбз-Pro-пролиналом, активируется дитиотреитолом . Наиболее высокая активность фермента в мозге обнаружена в коре больших полушарий, стриатуме и гиппокампе, перепады уровней активности фермента в мозге не превышают - раз . Он гидролизует пептиды, содержащие от до аминокислот, расщепляет тиролиберин, ангиотензин, брадикинин, нейротензин, вещество P . Вероятно, биологическая роль фермента заключается в гидролизе пролин-содержащих пептидов.
Динорфин-превращающий фермент – тиол-зависимая эндопептидаза, расщепляющая пропептиды по одиночным остаткам основных аминокислот . Имеет молекулярную массу примерно кДа, оптимум pH между, и,, ингибируется ПХМБ . Высокая активность фермента обнаружена в гипофизе, надпочечниках и мозге Региональное распределение фермента соответствует таковому динорфина . Фермент локализован в секреторных везикулах .
Он расщепляет динорфин B- с образованием динорфина B- и динорфина B-, превращает АКТГ - в АКТГ - и динорфин A в Leu-энкефалин, Leu-энкефалин-Arg и Leu-энкефалин-Arg-Arg . На основании cовпадения регионального распределения фермента с распределением динорфина B- предполагают, что физиологическая роль динорфин-превращающего фермента заключается в образовании динорфина B-, однако не исключено, что он может вовлекаться в образование и других нейропептидов.
Тиоловая прогормон-конвертаза
Прогормон тиоловая протеаза – тиоловая эндопептидаза секреторных везикул, расщепляющая пептидные субстраты по моно- и диосновным сайтам процессинга с обеих сторон (N- и C-) . Представляет собой одноцепочечный кДа гликопротеин с pI, и оптимумом pH,. Для проявления активности требует ДТТ, ингибируется иодацетамидом, п-гидроксимеркурийбензоатом, хлоридом ртути, цистатином C, (D-Tyr)-Glu-Phe-Lys-Arg-CHCl, кбз-Leu-Val-Gly-NH и кбз-Arg-Leu-Val-Gly-NH . Расщепляет предшественники энкефалина BAM-P, пептиды E и F по ди- и моноосновным остаткам, образуя в конечном итоге Met-энкефалин .
Полагают, что PTP является основным ферментом процессинга, вовлекаемым в превращение предшественников энкефалина, отличающимся от других эндопептидаз процессинга, включая субтилизиновые прогормон-конвертазы и проопиомеланокортин-превращающий фермент.
Мультикаталитический протеиназный комплекс ( S протеасома) впервые выделен в г. из гипофиза быка . В дальнейшем было обнаружено, что комплекс проявляет активность только по отношению к убиквитированным белкам и для своей активации требует АТФ . Комплекс имеет молекулярную массу кДа, состоит примерно из субъединиц двух типов с молекулярной массой - кДа. a-субъединицы являются структурными, не обладают ферментативной активностью и играют важную роль в сборке комплекса . Комплекс содержит несколько подсемейств b-субъединиц, обладающих пептидазной активностью . S протеасома проявляет химотрипсиноподобную, трипсиноподобную и постглутамил-гидролазную активность при нейтральных и слабощелочных значениях pH, активируется ДТТ, ингибируется N-этилмалеимидом и ДФФ .
В свободном виде протеолитическая активность S протеасомы незначительна . Начальным этапом распада белка при участии мультиферментного комплекса является его убиквитирование, протекающее при участии АТФ. Затем в результате АТФ-зависимого процесса S протеасома соединяется с S регуляторным комплексом. При этом образуется S протеасома, быстро гидролизующая убиквитированный белок при участии АТФ в основном до октапептидов .
В мозге S протеасомы локализованы преимущество в цитоплазме нейронов, но обнаруживаются и в ядрах .
Предполагают, что начальным этапом деградации большинства цитоплазматических белков является АТФ, убиквитин-зависимый протеолиз
Литература:
1. Азарян А.В. Пептидгидролазы нервной системы и их биологические функции // Ереван. – Айастан. – 1989. – 208 с.
2. Ашмарин И.П., Каменская М.А. Нейропептиды в синаптической передаче // ВИНИТИ. Сер. физиолог. чел. жив. – 1988. – 34. – 184 с.
3. Гомазков О.А., Григорьянц О.О. Регуляция биосинтеза энкефалинов: биохимические и физиологические аспекты // Усп. совр. биол. – 1989. – 108, № 1 (4). – С. 109-124.
4. Елисеева Ю.Е., Орехович В.Н. Выделение и изучение специфичности карбоксикатепсина // Докл. АН СССР. – 1963. – 153. – С. 954-956.
5. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир, 1979. – 190 с.
6. Палладин А.В., Белик Я.В., Полякова Н.М. Белки головного мозга и их обмен.– Киев: Наукова думка, 1972.– 316 с.
7. Adams E., Smith E.L. Proteolytic activity of pituitary extracts // J. Biol. Chem. – 1951. – 191, N 3. – P. 651-658.
8. Панченко Л.Ф., Фирстова Н.В., Митюшина Н.В., Генгин М.Т. Регуляторные пептиды и ферменты их обмена при стрессе // Нейрохимия. – 2000. – 17, № 2. – С. 83-92.
9. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: в 2-х томах. – М.: Мир, 1993. – 795 с.
10. Нерохимия / Под ред. Ашмарина И.П. и Стукалова П.В. – М.: Инст. Биомед. химии РАМН, 1996.– 469 c.
| ! |
Как писать рефераты Практические рекомендации по написанию студенческих рефератов. |
| ! | План реферата Краткий список разделов, отражающий структура и порядок работы над будующим рефератом. |
| ! | Введение реферата Вводная часть работы, в которой отражается цель и обозначается список задач. |
| ! | Заключение реферата В заключении подводятся итоги, описывается была ли достигнута поставленная цель, каковы результаты. |
| ! | Оформление рефератов Методические рекомендации по грамотному оформлению работы по ГОСТ. |
| → | Виды рефератов Какими бывают рефераты по своему назначению и структуре. |