ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МУТАЦИЙ И ЭВОЛЮЦИЯ.

ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МУТАЦИЙ И ЭВОЛЮЦИЯ. О.В. Мосин Нуклеиновые кислоты являются генетиче¬ским материалом клеток. Первичная структура молекулы нуклеиновой кислоты определяется последовательностью нескольких тысяч нуклеотидов четырех различных типов. Эта последовательность специфична для каждого вида нуклеиновой кислоты и не обнаруживает какой-либо правильной периодичности или других простых закономерностей.

Таким образом нуклеиновые кислоты со¬держат большое количество информации, накопленной в одно¬мерной статической форме, аналогичной письменным данным цивилизации. Из вышесказанного следует, что мутагенные реакции связаны с измене¬ниями в последовательности нуклеотидов. Эти изменения могут быть замещением одного или нескольких нуклеотидов другими, удлинением, вычленением, обменом или другими перестройками в последовательности.

В то время как некоторые изменения явля¬ются летальными, другие могут приводить к образованию жиз¬неспособных мутантов. При этом простейшее возможное изменение, вызванное заме¬щением всего лишь одного нуклеотида другим внутри неизмененной молекулы является часто мутагенным. Это процесс может быть вызван искусственно или самопроизвольно про¬исходит в природе. Наиболее известной мутацией является превращение нуклеотида в один из трех других естественно встречающихся

нуклеотидов. Химическая реакция этого типа изве¬стна в рибонуклеиновой кислоте (РНК), где цитозин посредством дезаминирования может быть превращен в урацил [1] (рис. 1). Рис. 1. Дезамииирование нуклеотидов азотистой кислотой Можно ожидать закрепления такого изменения при молекулярной редупликации. Менее прямой путь получения мутаций — из¬менение нуклеотида в производное, которое не встречается в

естественной нуклеиновой кислоте, но которое при редуплика¬ции ведет к включению естественного нуклеотида, отличающегося от исходного. Этот тип мутации определяется механизмом реду¬пликации. В нем участвуют как энзиматические реакции, так и структурные отношения между матрицей и продуктом редупли¬кации. Относительно связанной с этим энзиматической специфич¬ности известно очень мало, и поэтому трудно предсказать, какие химические изменения нуклеотидов могли бы тормозить редупли¬кацию.

С другой стороны, структурное отношение между матри¬цей и продуктом редупликации определено для дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в схеме спаривания оснований по Уотсону и Крику [2] (рис. 2). Следовательно, если редупликация как возможно предсказать, какие изменения будут происходить как таковая не тормозится, то иногда возможно предсказать, ка¬кие изменения будут происходить как следствие данной реакции, особенно если один нуклеотид замещен близким аналогом дру¬гого.

Например, в ДНК цитозин, превращенный в урацил посред¬ством дезаминирования, может вызвать при редупликации вклю¬чение тимина на его место, а аденин, превращен¬ный в гипоксантин, может приводить к включению гуанина (см. рис. 2). Рис. 2. Нуклеотидные пары в ДНК, с участием естественно встречающихся оснований — аденина, гуанина, цитозина и тимина и продуктов их дезаминирования — урацила и гилоксантина (см. рис. 1) Реакции, ведущие к образованию аналогов естественных оснований, могут также быть мутагенными, если

они не тормозят редупликацию. В этих случаях специфичность спаривания оснований уменьшается и при редуплика¬ции в последовательность вносится неопределенность. Депуринизация при кислых значениях рН [4] представляет пример такого рода. Мутации могут быть вызваны не только химическими изменениями нуклеиновой кислоты, но также включением в ДНК нуклеотидных аналогов, таких, как 5-бромурацил и 2-аминопурин. Эти аналоги приводят к образованию мутантов вследствие того, что специфичность редупликации понижается

[4, 5]. Дезаминирование нуклеиновых кислот in vitro также может быть мутагенным [6]. Это явление было обнаружено для вируса табачной мозаики (ВТМ) и некоторых других систем. Рис. 3. Лист табака через несколько дней после заражения вирусом табачной мозаики А — 0,3x10-4 г/мл обычного штамма ВТМ. На листе видно много хлоротических повреждений: Б — 0,7x.10-6 г/мл обычного штамма ВТМ, обработанного 1М нитритом натрия в течение 20 мин. при рН 4,2.

Кроме хлоротических повреждений, образуются 6 некротических (указаны стрелками), свидетельствующих о мутациях Вирус табачной мозаики содержит одну молекулу РНК, образующую единую цепь из 6400 нуклеотидов. Молекула изолированной РНК обладает инфекционностью, причем её активность зависит от це¬лостности молекулы, а не от пространственной структуры РНК. Поэтому генетические свойства вируса определяются главным образом линейной последовательностью 6400

нуклеотидов [7]. Инкубация вирусной РНК с азотистой кислотой приводила к дезаминированию гуанина, цитозина и аденина, в то время как сама молекула РНК оста¬ется неповрежденной. Дезаминирование вызывало инактивацию, причем инфекционность уменьшалась экспоненциально со време¬нем обработки азотистой кислотой. Эта кинетическая зависимость первого порядка показывает, что дезаминирование единичных нуклеотидов происходит летально для клетки.

Корреляция скорости инактивации со ско¬ростью химического дезаминирования свидетельствует, что один из двух отдельных актов дезаминирования является летальным. Иследователи пришли к выводу, что по крайней мере некото¬рые из нелетальных актов дезаминирования могут приводить к жизнеспособному потомству с измененной нуклеиновой ки¬слотой и, вследствие этого, измененными генетическими свойст¬вами. Образование мутантов в результате дезаминирования было показано в экспериментах

с местными некротическими повреждениями на яванском табаке [6]. На этом виде растений обычный штамм ВТМ дает хлоротические повреждения в виде диффузных пятен на листьях, тогда как некоторые спонтанные мутанты дают некротические повреждения. При этом случайные спонтанные мутанты или возникающие при заражении этим штаммом дава¬ли только два-три некротических повреждения на 1000 хлоротических.

Однако если РНК обработана азотистой кислотой, то образуется зна¬чительно больше некротических повреждений (рис. 3). В то время как общее число повреждений уменьшается со временем обра¬ботки, вследствие инактивации, относительное количество некро¬тических повреждений возрастает линейно до 25%. Абсолютное количества некротических повреждений, образуемых постоянным количе¬ством РНК, вначале также возрастает линейно со временем обработки, затем достигает максимума, после чего уменьшается

вследствие инактивирующего действия азотистой кислоты на му¬танты. Количество некротических повреждений возрастало в 20 раз по сравнению с уровнем их спонтанного образования, то¬гда как общая инфекционность понижалась при этом в 2,7 раза (до 37%). Кинетика и линейное возрастание мутантных инфек¬ций в начале реакции, показывает, что дезаминирование одного единственного нуклеотида может быть мутагенным.

Кроме мутантов, производящих некротические повреждения на яванском табаке, учёными было обнаружено множество других мутантов, дающих различные симптомы на растениях-хозяевах. Полученные данные свидетельствуют, что дезаминирование любого одного нуклеотида приблизительно из 1000 нуклеотидов приводит к образованию мутантов, причем 100—200 из них являются мутантами, вызывающими некротические повреждения ткани листа. Осо¬бый интерес представляет изучение действия дезаминирования

РНК на структуру вирусного белка. Учёные [12, 13] изучили му¬танты, обнаруживаемые по симптомам, продуцируемым на рас¬тениях-хозяевах. При среднем количестве около шести дезаминированных групп на молекулу РНК приблизительно половина му¬тантов имеет неизмененный белок, а другая половина обнаруживает отличия в структуре белка. Отличие было ограничено заме¬щением одной или в редких случаях двух аминокислот. Из этого сделан вывод, что только часть молекулы РНК является генети¬ческим материалом для вирусного

белка, в то время как другие участки имеют функции, заключающиеся в синтезе клеточных ферментов или ингибиторов. Исследование естественно существующих мутантов и штаммов приводит к подобным результатам: близкородственные мутанты мало отличаются по аминокислотному составу. Некоторые замены аминокислот в молекуле белка (например, аспарагина в аланин) наблюдались как для спонтанных, так и для индуцированных азотистой кислотой мутантов.

Дальнеродственные штаммы могут отличаться многими аминокислотами [13]. Общепризнано, что большинство мутантов, возникающих из обычного штамма ВТМ, обладают меньшей жизнеспособностью чем сам ВТМ. Штамм, который сравним с ВТМ по жизнеспособности, «BTM-dahlemensc» [14], является довольно отдаленным и сильно отличается по структуре белка [13]. Кроме

ВТМ, мутагенное действие азотистой кислоты было изучено для вируса полиомиелита [15], фагов Т2 [16], Т4 [4, 17], лямбда-Х174[37], и бактерий [19]. У фага Т2 образование бляшек интактным фагом, обработанным азотистой кислотой, указывало на образование мутаций. Возрастание количества мутантов со временем обра¬ботки показывает, что единичные акты дезаминирования мутагенны. Поскольку ни один из продуктов дезаминирования не является естественным нуклеотидом

ДНК, очевидно, образование аналогов может вызвать мутацию. Согласно схеме редупликации Уотсона и Крика, дезаминирование гуанина в ксантин не может быть мутагенным, в то время как дезаминирование цитозкна и аденозина может приводить к образованию мутантов (см. рис. 1 и 2). Эта концепция была проверена экспериментально учёными [20, 21]. Наблюдались различия в зави¬симости скоростей дезаминирования от рН для трех указанных оснований.

Если соотношение скоростей при рН 4,2 и 5,0 для гуанина равно 35, -для аденина и цитозина оно достигает. 90. Соотношение скоростей мутаций равно при этом 90, как для ско¬ростей дезаминирования аденина и цитозина. Дезаминирование гуанина не мутагенно, в то время как дезами¬нирование цитозина или аденина может приводить к образованию мутантов [20]. Другие исследователи [22] открыли, что азотистой кислотой могут вызываться как прямые, так и обратные мутации. Согласно схеме спаривания оснований, превращение цитозииа в урацил

в одном тяже, ведущее к тимину, может быть обращено превраще¬нием комплементарного аденина в гипоксантин в другой цепочки молекулы РНК, -что приведет к гуанину, и наоборот (см. рис. 2). Дезаминирование как цитозина, так и аденина мутагенно. Кроме того, первоначальное химическое изменение одного нуклеотида приво¬дит при редупликации к замещению только одного нуклеотида. Дезаминирование фага лямбда

XI74, содержащего одноцепочечную ДНК, мутагенно [17], что доказано появлением на хозяине ряда бляшек. По кинетике это — также реакция первого порядка. Для трансформирующего начала инактивирующее действие дезаминирования было изучено Замснхофом [23] еще в 1953 г. Мутагенные эффекты были описаны Литманом и Эфрусси-Тейлор [18]. Если исходную ДНК пневмококков обработать азотистой кислотой, то она обнаруживает устойчивость

по отношению к таким агентам, как аминоптерин. Хотя уровень трансформации значительно выше, чем в необработанных контролях, кинетика оказывается более сложной, чем простой тип однозамещённой реакции для БТМ, Т2 и 0X174, и эти результаты в настоящее время не объяснены окончательно. Имеется более чем один механизм, посредством которого последовательность нуклеотидов в генетическом материале определяет биохимические свойства клетки.

Известно, что в то время как некоторые гены определяют структуру белков, другие ответственны за синтез ферментов или ингибиторов, определяющие количества и условия синтеза белка [24]. Наиболее основательно изучена структура кодируемых белков. Каждая аминокислота определяется специфической последовательностью нуклеотидов. Эта основная гипотеза кодирования подтверждается результатами, полученными по изучению мутаций и показывающими,

что изменение одного нуклеотида может вести к замещению в белке одной аминокислоты на дру¬гую. Специфичность такого замещения продемонст¬рирована трехбуквенным кодированием. Каждая аминокислота определяется последовательностью трех нуклеотидов из четырех различных типов: аденина (А), гуанина (Г), цитозина (Ц) и урацила (У). При этом воз¬можно существование 64 таких нуклеотидных триплетов (рис. 4). Дезаминирование может вызывать превращение

Ц в У и, возможно, А в Г. Конечно, не все 380 замен между 20 аминокислотами могут быть вызваны дезаминированием. Ведь код может быть «вырожденным», когда несколько триплетов определяют одни и те же аминокислоты. В этом случае может существовать до 96 возможных замен аминокислот. Если код не вырожденный, то только 20 из всех возможных триплетов определяют по одной аминокислоте каждый, тогда как остальные 44 триплета не имеют смысла, так как переходы, дающие в результате эти трипле¬ты,

препятствовали бы образованию белка. Если выбор 20 триплетов произведен наугад, то возможно примерно 9 переходов. Рис. 4. Замены, полученные посредством дезаминирования, в триплетных кодах А — аденин; Г — гуанин; Ц — цитозин; У — урацил. Стрелки указывают переходы, вы¬званные дезаминврованием отдельных нуклеотидов, при допущении, что дезаминиройание дает в результате замещение ЦУ и АГ. Характер замен, являющихся результатом изменения отдельных нуклеотидов специфическими мутагенами

специфичен для каждой схемы кодирования. Все вышесказанное ограничивалось мутациями, возникающими вследствие замещения единственного нуклеотида в генетическом материале. Эти мутации, вызывающие определенные изменения в первичной структуре белков играют существенную роль в процессе эволюции. Однако мало¬вероятно, что только эти мутации ответственны за эволюцию того великого множества белков, которое существует в клетке. Трудно себе представить, что крупный функциональный белок

мог возникнуть в результате отдельных несвязанных изменений беспорядочной последовательности нуклеотидов. Точно так же трудно себе представить, что беспорядочное одновременное изменение многих нуклеотидов в гене могло бы привести к образованию нового функционального белка. Современные исследования показали, что это возможно. Сейчас представляется вероятным, что изменения, возникающие в результате мутаций составляют важные

эволюционные процессы на молекулярном уровне. ЛИТЕРАТУРА 1 Н Schuster, G. Schramm. Z. Naturlorsch 1958, 13b, 697. 2. J. D. Watson, F. H. C. Crick. Nature, 1953, 171, 737. 3. M. J. В e s s m a n, I. R. L e h m a n I. A d 1 e r, S. B. Z i m mermann, E. S. Simms, A. Kornberg. Proc.

Nat. Acad. Sci. U. S. A 1958, 44, 633. 4. E. Frees e. Brockhaven Sympos. in Biology, 1959, 12, 63. 5 E. Ф p и 3. Труды V Международного биохим. конгресса. М Изд-во АН СССР, 1962. 6 К- W. Mundry, A. Gierer. Z. Vererbungslehrc, 1958, 89, 614; 7 A. Gierer, К.

W. Mundry. Nature, 1958, 182, 1457. 8 A. Gierer. Progr. Biophys 1960. 10, 300; Nature, 1957, 179, 1297. 9 K. W. Munrdy. Z. Vercrbungslehre, 1957, 89, 614. 10 F. C. Bawd en. Nature, 1959, 184, 27. 11 K. W. Munrdy. Virology, 1959, 9, 722. 12 A Anderer, H. Uh1ig, E.

Weber, G. Schramm. Nature, 1960, 186, 922. 13 G. Melchers. Naturwissenschaften, 1942, 30, 48. 14 W. Vielmetter, С. M. W i e d e r. Z. Naturforsch 1959, 14b, 312. 15 I. T e s s m a n. Virology, 1959, 9, 375. 16 R. M. Liitnran, H. Ёphrussi-Тау1оr. Acad. sci 1959, 249, 838. 17

F. Kaudewltz. Z. Naturforsch 1959, 14 b, :528. 18 W. Vielmetter, H. Schuster. Z. Naturforsch I960, 15, 304. 19 H. Schuster. Z. Naturlorsch I960, 15, 298. 20 S. Zamenhof, H. E. A 1 ex a n d e r, G. L e i d y. J. Exp. Med 1953, 98. 373. 21 A. B. Partiее, F. Yасоb, J. Mоnоd. J. Molecular Biol 1959, 1, 165. 22

F.H.C. Crick, J. S. Griffith. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A 1957, 43, 416. 23 G. Brannitzer, B. L i e b о 1 d, R. M u 11 e r, Z. phys. Chem 1960, 320, 170; см. также Труды V Международного биохим. конгресса. М ИЗД-ВО АН СССР, 1962. 24 V. M. Ingram. Biochim. et biophys. acta,

1958, 28, 539.