Введение
Под трансплантацией зародышей понимают перенос зародышей изполовых органов животных-доноров в половые органы животных-реципиентов. Приэтом в организме реципиентов наступает нормальная беременность с развитиемзародышей, а затем и плодов (А.П. Студенцов, 1999).
Современное сельскохозяйственное производство базируется на ииспользовании высокоэффективных технологий производства молока мяса,обеспечивающих получение прибыли. В связи с этим необходимо ускоренное созданиеновых пород, линий, семейств высокопродуктивного скота с качествами,удовлетворяющими требованиям конъюнктуры рынка. Мощным средством реализациипоставленных задач наряду с искусственным осеменением, является методтрансплантации эмбрионов, позволяющий значительно снизить генерационныйинтервал и ускорить оценку матерей быков, обеспечить размножение животных свысокой генетической ценностью и малочисленных пород (М.И. Прокофьев, 1998).
В связи с необходимостью совершенствования скота черно-пестройпороды в 70-е годы прошлого столетия осуществлялся завоз животных голштинскойпороды. Их помеси на территории Российской Федерации интенсивно Результатомиспользовались в условиях промышленной технологии скрещивания и длительнойработы с помесными стадами первого-четвертого поколения к 2005 году вчерно-пестрой породе были апробированы 6 типов: «Ирменский», «Уральский»,«Ленинградский», «Непецинский», «Московский», «Барыбинский». Это позволилосоздать новую племенную базу черно-пестрой породы и обеспечить возможностьразведение скота при ограниченном импорте племенного материала из-за рубежа. Внастоящее время эти типы сформировали современную структуру породы. При этомобеспечивается выведение высокоценных племенных быков, которые поддерживаютсформированную генетическую структуру породы.
В настоящее время, несмотря на то, что численностьвысокопродуктивных коров с удоем свыше 7000 кг молока за лактацию в отдельныхстадах нашей страны возросла, обеспечить систематическое и достаточноевоспроизводство ремонтных быков от полновозрастных коров затруднительно. Этосвязано с малой подготовленностью кадров, территориальным удалениемнедостаточным племенных заводов от научных центров, государственнойматериальной и обеспечением информационной поддержки мероприятий потрансплантации эмбрионов. Поэтому одной из первейших задач в нашей странедолжна стать разработка системы воспроизводства высокоценного племенногоматериала с помощью трансплантации эмбрионов. В настоящее время в мировойпрактике около 80% быков, находящихся на племенных предприятиях и используемыхв системе искусственного осеменения, получены путем трансплантации эмбрионов. Внашей стране работы по пересадке эмбрионов и совершенствованию аспектов самогометода, начатые в 70-х годах прошлого века, широкого внедрения в практикуплеменного скотоводства пока не получили. Однако, в связи с переходом на новыесоциально-экономические отношения и необходимостью дальнейшегосовершенствования крупного рогатого скота, интерес к современным технологиямразведения, кормления и содержания животных возрастает. Одним из путейповышения эффективности отрасли, совершенствования скота на региональном уровнеи отдельных хозяйств является воспроизводство и селекция высокопродуктивныхживотных (И.Р. Чернева, 2007).
1. Перспективы внедрения трансплантацииэмбрионов
На современном этапе одним из основных методов совершенствованиямолочного скота является искусственное осеменение. Однако оно не обеспечивает вдостаточной мере ускоренного выведения животных с высокими показателямипродуктивности.
В сложившейся ситуации метод трансплантации эмбрионов открываетогромные возможности в разведении и воспроизводстве крупного рогатого скота какс целью повышения эффективности племенной работы, так и увеличения производстваговядины за счет получения двоен (И.Р. Чернева,2007).
Трансплантация эмбрионов открывает огромные перспективы ускорениятемпов селекционного прогресса в животноводстве.
С внедрением в практику разведения животных метода искусственногоосеменения резко возросли масштабы использования высокоценных племенныхпроизводителей для получения потомства, между тем как влияние маточногопоголовья на селекционный процесс осталось прежним. Так, от коровы за всю еежизнь получают 3–6 потомков, между тем как потомство от быков – улучшателейисчисляется десятками и сотнями тысяч голов.
Однако биологические возможности маточного поголовья длявоспроизводства также велики, если учесть, что яичники содержат огромноеколичество потенциальных яиц.
Современная технология трансплантации эмбрионов позволяет получитьот коровы – рекордистки за ее жизнь несколько десятков телят. В США от однойкоровы голштинской породы с выдающейся молочной продуктивностью получили 131теленка. В одном из фермерских хозяйств США за 6 сборов от пяти коров заморозили201 эмбрион, получили 113 телят.
Трансплантация эмбрионов расширяет возможности обмена генетическимматериалом между странами и континентами. Транспортировка эмбрионовнесравненно проще и дешевле, чем животных; к тому же отпадают ветеринарныепроблемы, поскольку прочная оболочка непроницаема как для бактерий, так и длявирусов.
США, Канада, Англия, Новая Зеландия осуществляют экспорт эмбрионовв десятки стран мира. В Оренбургской области уже много лет функционируетсмешанная англо – российская фирма по заготовке и экспорту эмбрионоворенбургских пуховых коз.
В молочном скотоводстве крупномасштабное воздействие методаэмбриопересадок на генетических прогресс достигнуто путем комплектованияцентров и станций исскуственного осеменения быками – трансплантатами, полученнымиот наиболее выдающихся родителей плановых пород. Так, уже в 1986 г. вцентрах искусственного осеменения США и Канады было свыше 100 быков – трансплантатов.
Расчеты показывают, что трансплантация эмбрионов усиливаетежегодный генетический прогресс в животноводстве на 3%.
Метод трансплантации эмбрионов в перспективе может бытьиспользован для создания генофонда редких и исчезающих пород животных.
Разработка техники культивирования ооцитов позволяет получитьпотомство от животных, выбывших из эксплуатации.
Уже в настоящее время трансплантация эмбрионов становитсянеотъемлемой составной частью селекционных программ (Н.И. Полянцев, 2001).
Целью настоящей работы является разработка путей разведениякрупного рогатого скота молочных пород с использованием трансплантацииэмбрионов, совершенствование признаков селекции широко распространенных иисчезающих пород скота. Обоснование подходов, направленных на выведение иоценку коров и быков с высокой племенной ценностью, ускоренное размножениеперспективных родственных групп, разработка элементов системы МОЭТ то естьпрограммы множественной овуляции и эмбриотрансплантации. Первая такая программабыла разработана в Великобритании F.W. Nicholas, С. X. Smith в 1983 году. Она предусматриваларазведение ядра по форме закрытой популяции, но в последующем, по предложениюТНЕ Meuwissen, схема была изменена и принято разведение по форме открытойпопуляции. Коровы-доноры приобретались из других хозяйств, а само стадополучено пересадкой эмбрионов от высокоценных доноров и производителей изСеверной Америки. Подобные программы в последующем были разработаны в Германии,Австрии, Франции и других странах с целью получения маток для использования вкачестве матерей быков-производителей.
Разработан и обоснован метод ускоренной оценки племенной ценностибыков – трансплантатов. Предложена техника проведения маркированиядостоверности и семейного анализа при паспортизации генетического и контролеПоказаны происхождения животных – трансплантатов. возможности ускоренногосоздания семейств коров методом трансплантации эмбрионов; разработаны иадаптированы к условиям РФ элементы системы МОЭТ. Практическая проведенныезначимость работы заключается в том, что исследования позволили разработатьспособы ускорения темпов разведения высокоценного скота черно-пестрой породыметодами трансплантации эмбрионов. Предложены искусственного способы осемененияи иммунной племенной ускоренной оценки ценности быков – трансплантатов,позволяющие значительно раньше начать использование семени молодых быков – трансплантатов,в полтора раза сократить сроки создания высокоценных семейств коров-доноровэмбрионов (И.Р. Чернева, 2007).
2. Отбор доноров
Донор – это высокоценное, выдающееся животное, от которого послегормонального вызывания полиовуляции и осеменения спермой проверенногопроизводителя – улучшателя получают несколько зародышей. Отбирают только техживотных, которые обладают способностью к множественной овуляции и дают втечение длительного срока их использования большое количество зародышей, пригодныхк пересадке. В качестве доноров лучше использовать здоровых коров в возрасте от4 до 5 лет с хорошо развитой молочной железой, пригодной к машинному доению, иу которых не было каких-либо осложнений родов и послеродового периода. Перваястадия возбуждения полового цикла после родов должна быть синхронной иполноценной, с ярко выраженными феноменами: течки, полового возбуждения иохоты.
Операция пересадки зародышей экономически выгодна только в томслучае, когда в качестве доноров берут выдающихся в племенном отношенииживотных. В некоторых случаях для получения зародышей рекомендуют использоватьценных в племенном отношении коров в заключительные сроки их продуктивнойжизни, чтобы получить от них больше потомков (А.П. Студенцов, 1999).
В большинстве случаев в качестве коров-доноров отбирают матерейпотенциальных племенных быков. Благодаря этому обеспечивается высокийселекционный дифференциал. Оценка и отбор коров-доноров, выделенных в группуматерей быков, проводят в два этапа. На первом этапе племенная ценность донораоценивается по главным признакам молочного скота – по уровню молочной продукциии жирномолочности. На втором этапе, когда отобраны доноры с высокой племеннойценностью по главным признакам, число признаков в зависимости от цели селекциирасширяется. К ним относят форму вымени и сосков, свойства молокоотдачи,резистентность, крепость костяка и копыт, тип и воспроизводительные качества.
Нужно иметь в виду, что оценка коровы-донора по родословной исобственной продуктивности является не окончательной, так как в этом случае неучитывается эффект расщепления и рекомбинации генов. Поэтому окончательнооценивать корову-донора можно только при получении и оценке ее потомства.
Высокие затраты на получение телят путем трансплантации эмбрионовобусловливают необходимость отбирать таких доноров, от которых регулярно можнополучать большое количество эмбрионов. Предпочтение следует отдавать коровам,сохранившим в течение трех отелов стабильную воспроизводительную способность.Исследованиями установлено, что потенциальные коровы-доноры с хорошими иустойчивыми воспроизводительными способностями отличаются предрасположенностьюк воспроизводству эмбрионов, которые можно регулярно получать через каждые двамесяца.
Межотельный период является интегральным показателемвоспроизводительной способности коров. Его составные части: сервис-период ипериод стельности.
Сервис-период более точно и намного раньше, чем интервал междуотелами, выявляет потенциальные возможности воспроизводительной функции укоров. Он тесно связан с межотельным периодом (коэффициент корреляциисоставляет 0.9). Оптимальный сервис-период не должен превышать 80 дней. Однакоанализ сервис-периода, проведенный в ведущих племенных стадах черно-пестройпороды, показал, что данный показатель воспроизводительной функции коров имеетвысокий коэффициент изменчивости, который составил 61%.
Сервис-период в основном зависит от интервала между отелом ипервым осеменением, и интервала между первым и последним, т.е. эффективнымосеменением. Высокопродуктивных коров следует осеменять на втором месяце посленормального отела. Это обусловлено тем, что первый половой цикл проявляетсяслабо, половая охота клинически плохо определяется или вовсе не обнаруживается.
Первое осеменение коров на втором месяце после отела не удлиняетсервис – и межотельный период. При оптимальном сервис-периоде до 80 дней послепервого и второго осеменений средняя оплодотворяемость коров составляет 95–98%,а продолжительность межотельного периода не превышает одного года.
Для оценки воспроизводительных способностей коров, отобранных вкачестве потенциальных доноров, необходимо анализировать такие параметры какоплодотворяемость от первого осеменения и индекс осеменения. При правильнойтехнике осеменения и своевременном определении половой охоты оплодотворяемостькоров от первого осеменения должна составлять в среднем 60%.
Важным показателем воспроизводительной способности коров являетсяиндекс осеменения, т.е. количество осеменений на одно оплодотворение. Индексосеменения характеризуется высокой степенью изменчивости – коэффициентвариабельности может достигать 70%. Существенное влияние на изменчивостьиндекса осеменения оказывают такие факторы, как продолжительность периода ототела до первого осеменения, своевременное выявление коров в половой охоте,оплодотворяющая способность спермы быка и др. Индекс осеменения коров,выделенных в группу потенциальных доноров, не должен превышать 1.5. Укоров-доноров при всех отелах должны отсутствовать осложнения(мертворождаемость, задержание последа, послеродовые заболевания половыхорганов).
Через 15–20 суток после отела ветеринарный специалист методомректальной пальпации контролирует у потенциальной коровы-донора состояниеполовых органов, чтобы исключить такие нарушения воспроизводительной функциикак киста яичника, гипофункция, воспаление яичниковой связки, эндометриты (Б.П. Завертяев,1999).
3. Суперовуляция
Важным звеном в трансплантации эмбрионов крупного рогатого скотаявляется гормональное вызывание суперовуляции у коров-доноров. В группу доноровпереводят только тех коров, которые положительно реагируют на введениегормонов. Для стимуляции множественной овуляции используют гонадотропин СЖК всочетании с простагландинами и другими биологически активными веществами. Этотспособ, как показывает практика, позволяет вызвать суперовуляцию примерно у 70%коров.
Одним из существенных недостатков этого способа суперовуляцииявляется крайне высокая степень вариабельности числа овуляций, даже прииспользовании одной и той же концентрации гонадотропина СЖК. Она составляет от0 до 50 овуляций на одну корову-донора. Оптимальным результатом суперовуляцииявляется выход из яичника в воронку яйцепровода 10–20 яйцеклеток.
По современному представлению реакция коров на суперовуляцию взначительной степени определяется количеством и качеством фолликулов яичниковво время их стимуляции гонадотропинами. Экспериментально было доказано, что вовремя суперовуляции для получения хорошей реакции необходимо наличиеопределенного количества малых антральных фолликулов, чувствительных кгонадотропной стимуляции. Недостаток таких фолликулов, или напротив, наличиебольших по размеру фолликулов снижают уровень реакции или она вообщеотсутствует. Это может свидетельствовать об интраовариальном регулированиипроцесса суперовуляции. Поскольку фолликулы растут асинхронно, то в каждыйпериод инъекция гонадотропинов будет оптимальной лишь для ограниченного числафолликулов.
Кроме размера фолликула, на реакцию введения гонадотропиновсущественное влияние оказывает интенсивность митотического индекса, которая унормального фолликула повышается при формировании полости. Установлено чтовысокий митотический индекс неатретических фолликулов положительно коррелируетс интенсивностью суперовуляции.
Имеются данные, свидетельствующие о том, что на реакциюгонадотропинов отвечают только те малые антральные фолликулы, размеры которыхне превышают 2 мм. Установлено что такие фолликулы гормонально активны ибыстро овулируют.
Атретические фолликулы с высоким митотическим индексом, напротив,не овулируют, а после прохождения фазы лютеинизации подвергаются её воздействиюи имитируют наличие жёлтого тела.
Следовательно, для эффективной суперовуляции решающим являетсяфизиологическое состояние фолликулов в лютеальной фазе яичника.
Анализ работы станций по пересадке эмбрионов показал, что хорошимидонорами можно считать коров, которые после многократных суперовуляций имеютхорошую реакцию яичника и производят большое число пригодных для пересадкиэмбрионов за одно вымывание. Однако лишь небольшая часть доноров обнаруживаетповторную реакцию яичников после вызывания суперовуляции. В основном жекоровы-доноры нерегулярно отвечают на повторную гормональную обработку, поэтомуколичество овуляций и выход эмбрионов не являются стабильными.
Для оценки предрасположенности, или потенциальной изменчивостикоров на пригодность в качестве доноров, были рассчитаны варианты признаков, наоснове которых был определен коэффициент повторяемости. Рассчитанныекоэффициенты повторяемости признаков предрасположенности коров в качестведоноров колебались в пределах 17.3–23.3%. Это свидетельствует о том, что поитогам оценки за первое вымывание эмбрионов надежность повторного результатасоставит лишь 20%. Следовательно, по оценке признака пригодности за первоевымывание эмбриона невозможно достоверно судить о пригодности коровы в качестведонора.
Изменчивость пригодности коров в качестве доноров включаетнаследственные и ненаследственные факторы. Причем вклад ненаследственныхфакторов значительно выше вклада факторов генетических.
Отмечено, что прекращение кормления донора после обработкигонадотропинами достоверно уменьшает реакцию яичника на введение гормонов. Длясуперовуляции и получения биологически полноценных эмбрионов необходимообеспечить полноценное кормление донора, сбалансированное не только по основнымпитательным веществам, но особенно по аминокислотам и микроэлементам. Кормлениедоноров должно быть таким, чтобы они находились в хорошем физиологическомсостоянии.
Для получения суперовуляции наиболее широкое распространение вомногих странах мира получил ГСЖК с простагландинами.
Хороших результатов суперовуляции можно ожидать, когда к моментуинъекции гонадотропина в яичниках коровы функционирует желтое тело диаметром1.5 см. При наличии в одном из яичников развитого фолликула диаметром 10 ммполиовуляция снижается. Интенсивность множественной овуляции также снижается,когда кроме хорошо развитого желтого тела в яичнике находится развитыйфолликул, фолликулярная или лютеиновая киста. Следовательно, эффективностьсуперовуляции в большой степени определяется физиологическим состояниемяичников.
На число овуляций существенное влияние оказывает интервал междувременем введения ГСЖК и началом половой охоты. Определен оптимальный интервал,во время которого можно получить наибольшее количество овуляций, он составляет4–7 суток. При уменьшении этого срока до 1–3 суток число овуляций существенноснижается, а при увеличении свыше 7 суток, хотя число овуляций возрастает, ноформируются. (М.И. Прокофьев, 1998)
Для вызывания суперовуляции у крупного рогатого скота используютсягонадотропные препараты (гонадотропин сыворотки жеребых кобыл – ГСЖК ифолликулостимулирующий гормон – ФСГ – гипофиза животных), для синхронизацииполовых циклов – аналоги простагландина Ф2-альфа (эстрофан, магэстрофан,клопростенол, суперфан, ремофан, клатрапростин, эстуфалан и др.). ПрепаратыГСЖК обладают комплексной фолликулостимулирующей и лютеинизирующей активностью.Период полураспада экзогенного ГСЖК у коров составляет около 6 дней.Соотношение ФСГ и ЛГ в различных партиях неодинаковое, что сказывается нарезультативности суперовуляции. Стимуляция роста фолликулов препаратами ГСЖКсопровождается, как правило, увеличением массы яичников, образованием послеовуляции разного числа и величины желтых тел. Из-за длительного распада ГСЖК вкрови животных накапливаются повышенные концентрации гормонов. Изменениеэндокринного статуса при индукции суперовуляции может оказывать неблагоприятноедействие на оплодотворяемость яйцеклеток, развитие зародышей, а также на физиологическоесостояние половых органов (в частности, наблюдается кистозное перерождениеяичников). Для исключения длительной стимуляции роста фолликулов применяетсяанти-СЖК. Обработка антисывороткой в день проявления охоты нейтрализуетциркулирующую в крови животных ГСЖК и тем самым прекращает дальнейшуюстимуляцию роста фолликулов в яичниках. Это создает более благоприятный фон дляовуляции, оплодотворяемости яйцеклеток и последующего развития зародышей. Впрактике используются стандартные гонадотропные препараты высокой степениочистки: сергон (Чехия), фоллигон (Голландия), прегмагон (Германия). Этипрепараты инъецируют донорам на 11–12-ый день полового цикла, однократно, вдозе 50 И.Е. на 100 кг живой массы животного. Применение этих гонадотропиновобеспечивает вызывание множественной овуляции у 75–78% животных и получение всреднем 3,5–4,0 жизнеспособных эмбриона на донора.
Опыт работы по вызыванию суперовуляции у коров-доноровсывороточными и гипофизарными препаратами показал, что при использованиигипофизарных гормонов (ФСГ-п, ФСГ-супер, фолликотропин, фоллитропин) получаютсяболее стабильные и высокие результаты суперовуляции и эмбриопродукции. Так,процент коров-доноров, реагирующих на обработку сывороточными гонадотропинами,составил 75,0–78,3%, гипофизарными препаратами – 85,3–88,8%, число овуляций надонора – соответственно 8,3–9,7 и 10,2–12,0, количество пригодных эмбрионов – 3,5–4,0и 5,5–6,1 (Б.П. Завертяев, 1999).
эмбрион корова трансплантация осеменение
4. Осеменение коров-доноров
Результаты суперовуляции определяются эффективным осеменениемкоров-доноров. Проблема оплодотворения яйцеклеток и получения биологическиполноценных эмбрионов все ещё остается открытой. Как показывают результатыисследований, только 60–65% эмбрионов пригодны для трансплантации, остальныеяйцеклетки, образовавшиеся в результате гормональной обработки гонадотропинами,оказываются либо неоплодотворенными, либо после оплодотворения отстают вразвитии или дегенерируют. Причина этих нарушений остается неизвестной (Н.И. Полянцев,2001).
Для их осеменения берут сперму выдающихся быков-производителей,проверенных по качеству потомства и признанных улучшателями продуктивности.Имеются доказательства, что при использовании некоторых быков достигается болеевысокая степень оплодотворяемости коров – доноров, поэтому следует оцениватьбыков и по данному показателю. Отбор быков и работу со спермой проводят ссоблюдением ветеринарно-санитарных правил и согласно действующей инструкции поискусственному осеменению коров и телок. После гормональной обработки доноров уних с помощью быков-пробников выявляют половую охоту не менее двух раз в день.Примерно у 10 – 12% животных признаки стадии возбуждения полового цикла непроявляются. Осеменение животных, у которых обнаружена охота, проводят несколькораз с 12-часовыми интервалами до ее окончания, иногда его повторяют 3–4 раза. Вкаждой дозе спермы должно быть не менее 40–50 млн живых подвижных спермиев.Чаще используют способ осеменения с ректальной фиксацией шейки матки, спермувводят в ее канал.
Некоторые зарубежные авторы предлагают вводить сперму в полостьтела матки. Имеются также рекомендации вводить одну порцию спермы в левый, авторую – в правый рог матки. Свежие спермии сохраняют жизнеспособность вполовых путях самок дольше, чем замороженные и оттаянные. Поэтому прииспользовании свежей спермы в течение охоты можно проводить 1–2 осеменения. Приэтом достигается более высокая степень оплодотворяемости. Нецелесообразноосеменять доноров в отдаленные сроки после окончания охоты, поскольку в дальнейшемэто может оказывать вредное влияние на степень извлечения пригодных к пересадкезародышей (А.П. Студенцов 1999).
5. Извлечение и оценка эмбрионов
Оплодотворение яйцеклеток происходит в яйцепроводе. Образовавшиесязиготы подвергаются дроблению, и большинство из них у крупного рогатого скотапопадают в матку на 4-й день. Зародыши целесообразно извлекать у коров на 7–8-йдень после первого осеменения (до освобождения зародыша из прозрачнойоболочки). Для извлечения зародышей используют 2 способа: не хирургический ихирургический.
При не хирургическом способе извлечения зародыше животныхфиксируют в станке. Прямую кишку освобождают от содержимого и проводяттщательное ректальное исследование. Определяют, сколько желтых тел находится вкаждом яичнике. Хвост с помощью тесемки фиксируют. Проводят туалет идезинфекцию наружных половых органов и промежностей. Для прекращенияперистальтики прямой кишки эпидурально вводят 10 мл 2%-ного раствора новокаина.Для вымывания зародышей из матки применяют различные инструменты. Используютгибкий одноходовой катетер Фолея с упругим мандреном и надувным баллончиком.Инструмент должен быть стерильным. Сначала катетер вводят во влагалище поверхнему его своду и проводят под ректальным контролем через канал шейки матки врог матки. Для более полного извлечения зародышей нужно, не травмируя слизистуюоболочку, как можно глубже ввести инструмент в рог матки после того как катетердостигнет в роге матки необходимого положения, мандрен удаляют и в баллончиккатетера накачивают 10–15 мл воздуха. При этом катетер фиксируется в роге маткии промывная жидкость не вытекает мимо катетера.
Закрепив катетер, промывают полость рога матки с помощью шприцаЛюэра вместимостью 50–60 мл. В рог матки в зависимости от его величины вводятпорциями от 40–60 мл промывной жидкости, затрачивая на промывание каждого рогане более 500 мл. Наполнение матки промывной средой и степень ее оттокаконтролируют ректально.
Для более полного извлечения зародышей верхушку рога маткиприподнимают и выпрямляют. Некоторые авторы рекомендуют яйцепровод вблизиверхушки рога матки осторожно зажать большим и указательным пальцами. При этомпредотвращается поступление в брюшную полость жидкости, содержащей зародыши. Нопрактика показывает, что поступление в брюшную полость жидкости из рога маткиотмечается только при наличии большого давления в матке, поэтому яйцепроводможно не зажимать. Перед извлечением катетера следует удалить воздух избаллончика. Таким же образом промывают и второй рог.
В качестве среды для промывания используют фосфатно-буферныйсолевой раствор (ФБС) Дюльбекко.
Раствор готовят на тридистиллированной воде. Первые 4 веществарастворяют 800 мл, а 5-е и 6-е каждый отдельно в 100 мл. в итоге получают трираствора которые автоклавируют, а затем смешивают. В таком виде их можнохранить при 4 градусах до 2 недели. Непосредственно перед употреблением в ФБСвводят следующие компоненты (в расчете на один литр): альбумин бычьей сыворотки– 4г; глюкоза – 1г; натрий-пироват – 0,036г; пенициллин – 100 тыс. ЕД.
Собранную в цилиндр промывную жидкость отстаивают 20–35 мин.при температуре 20–37 градусов, чтобы зародыши опустились на дно, после чеговерхний слой удаляют с помощью сифона. Нижний слой жидкости порционно по 20–30мл для обнаружения зародышей исследуют в больших часовых стеклах или чашкахПетри под бинокулярной лупой при 10–50-кратном увеличении. Найденных зародышейпри помощи пастеровской пипетки переносят в среду для кратковременного хранения(среда Дюльбекко с добавлением 20% фетальной сыворотки теленка). После оценкизародышей их культивируют при 37 градусах до момента пересадки или оставляют дляхранения.
Хирургическим способом зародышей извлекают при общем или местномобезболивании. Разрезают брюшную стенку по белой линии или чаще в областиголодной ямки справа или слева, подтягивают рог матки к поверхности раны,делают разрез вблизи его основания и вставляют специальный катетер. Затем черезиглу, введенную в полость рога у его верхушки, или через канюлю, вставленную вяйцепровод, вводят специальную среду, которую вместе с зародышами собираютчерез катетер. При этом методе получают до 70% жизнеспособных зародышей. Укоровы можно извлекать зародышей непосредственно из яйцепровода (в течениепервых 4 дней после осеменения). Но хирургический способ, по мнению многихспециалистов, имеет лишь научное значение. Он трудоемок, требует, большихрасходов, и поэтому его применяют только у мелких животных (овец, коз и др.)после операции у животного значительно снижается уровень молочнойпродуктивности, имеется риск потери высокоценного донора при общемобезболивании. Его нельзя часто повторять, так как в послеоперационный периодобразуются спайки, из-за чего возникают трудности в извлечении зародышей, азатем могут развиваться необратимые изменения, приводящие к бесплодию доноров (А.П. Студенцов,1999).
Оценка эмбрионов. Оценка эмбрионов крупного рогатого скотапроизводится несколькими методами. Наибольшее распространение получилморфологический метод. Установлено, что результаты имплантации эмбрионовзависят от того, насколько полно оценена способность оплодотворенных яйцеклетокк развитию.
По морфологическим признакам и эмбриональной стадии развития,эмбрионы можно классифицировать на пригодные и непригодные к трансплантации.При морфологической оценке эмбрионов основное внимание обращают на формулузиготы, состояние её зоны пеллюцида, число бластомеров, равномерностьдробления, выраженность эмбриобласта и трофобласта.
Кроме морфологической, дается оценка эмбрионов по адсорбционнымсвойствам оболочек и цитоплазмы бластомеров к различным красителям. Дляулучшения морфологической оценки используют флюоресцентную окраску, позволяющуюотличить живые эмбрионы от погибших. В частности, этот метод наиболее пригодендля оценки жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота после ихкультивирования и замораживания. С помощью флюоресцентных красящих веществ FDAи DAP1 через 3–10-минутный период возможно быстрое и достаточно надежноеопределение способности эмбрионов к развитию в ранних стадиях. Живые эмбрионы идаже живые бластомеры ярко флюоресцируют после инкубации в FDA, но нефлюоресцируют после инкубации в DAP1. У погибших эмбрионов или бластомеровреакции обратные. Эти методы позволяют более точно определять жизнеспособностьэмбрионов под микроскопом.
Ряд авторов предлагает использовать синьку Эванса. В живыхэмбрионах при температуре 37 градусов ею окрашивается только зона пеллюцида,которую затем обесцвечивают в растворе Рингера. В мертвых же эмбрионах краскапрочно фиксируется на бластомера.
Однако следует учитывать, что флюоресцентная окраска лишьдополняет и улучшает основной метод оценки эмбрионов – морфологический.Наиболее важными морфологическими признаками при оценке жизнеспособностиэмбрионов служат объем, окраска, расположение клеток, величинаперивиталлинового пространства и вид неповрежденной зоны пеллюцида. Идеальныйэмбрион должен быть компактным, сферической формы, с однородной окраской, склетками одинаковой величины, с гладкой, плоской и равномерно сформированнойзоной пеллюцида, без включений в перивителлиновом пространстве.
Важнейшим критерием для оценки качества эмбрионов являетсяинтенсивность развития стадий. Эмбрионы с замедленным развитием не используютсядля пересадки, замораживания и других манипуляций.
При оценке качества эмбриона в нашей стране принята 5-балльнаяшкала с учетом следующих показателей: соответствия стадии развития эмбриона еговозрасту; правильности формы прозрачной оболочки и ее целостности;равномерности дробления бластомеров, состояния цитоплазмы; прозрачностиперивителлинового пространства.
Наиболее пригодными для трансплантации являются эмбрионы,извлеченные из матки коровы-донора на 7–8 сутки после первого осеменения. Какпоказывают результаты исследований и практика, в это время нормально развитыеэмбрионы, пригодные для трансплантации реципиентам, находятся в стадии позднейморулы или бластоцисты. Эти эмбрионы используют для пересадки гормональноподготовленным коровам-реципиентам.
Выбраковке подлежат дегенерированные неоплодотворенные яйцеклетки(ооциты), которые можно обнаружить при извлечении эмбрионов. Морфологическинеинтактные, непригодные для трансплантации эмбрионы имеют дефектную морулу,или бластоцисту, признаками которых являются дефекты прозрачной оболочки,распад бластомеров, разная величина бластомеров, нарушение межклеточной связи.
В стадии поздней бластоцисты непригодные для трансплантацииэмбрионы характеризуются деформацией и ослаблением бластомеров, разрывоммежклеточных связей и целостности зоны пеллюцида (И.Р. Чернева, 2007).
6. Пересадка эмбрионов реципиентам
В качестве реципиента отбирают гинекологически здоровых коровпосле двух-трех нормальных половых циклов. Для отбора реципиентов основнымпоказателем является отсутствие гинекологических отклонений, а продуктивные,племенные и породные качества большой роли не играют. Вместе с тем, уреципиентов с плохой упитанностью, низкой оплодотворяемостью после первогоосеменения, могут плохо приживаться эмбрионы. В среднем на каждого донораотбирают 5–6 реципиентов. Большинство специалистов считает, что в качествереципиентов наиболее пригодны полновозрастные телки с хорошими племеннымикондициями.
Основным условием хорошего приживления эмбрионов служитсинхронность проявления половой охоты у доноров и реципиентов.
Разница во времени в проявлении половой охоты не должна превышать24 ч, оптимальные же результаты получаются при разнице не более 12 часов.При современном уровне техники трансплантации рекомендуется пересаживатьэмбрионы сразу после их извлечения из рогов матки донора и оценки.
В настоящее время пересадка эмбрионов реципиентам производитсяхирургическим и нехирургическим способами. При пересадке нужно точно знатьместонахождение эмбриона в половых путях коровы. Это связано с переходомпредимплантационного периода, в котором находится эмбрион до пересадки, в новыйпериод эмбрионального развития – имплантационный.
При естественном течении эмбрионального периода зародыш на стадииморулы или бластоцисты находится в верхнем отделе рога матки, поэтому инаиболее благоприятным местом для его аппликации является верхняя часть рогаматки реципиента. Установлено, что пересадка эмбрионов глубоко в рог маткиреципиента лучше всего обеспечивается хирургическим способом. Принехирургической же пересадке, которая происходит в период диэструса, местоаппликации эмбриона в роге матки контролируется менее точно. Эффективностьхирургического способа пересадки эмбриона составляет 60–70%, а число телят – 3–4на донора. Хирургический способ использовали в основном до середины 70-х годов.Однако он требует больших затрат средств. Кроме того, широкое применениехирургического метода сдерживается сложностью проведения операций впроизводственных условиях, получением травм вследствие резекции мышц, иневозможностью многократного использования реципиента. Поэтому последние 10–15 летпересадку эмбрионов в основном осуществляют нехирургическим способом. Принехирургической пересадке основным достоинством, кроме простоты иэкономичности, является возможность многократного использования реципиента.Разработано несколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Однако всеони основаны на одном принципе – введении эмбриона в рог матки через шейку,вследствие чего этот способ назван также цервикальным.
После пересадки эмбрионов проводят тщательный контроль зареципиентами, обращая особое внимание на возможное проявление у них повторнойполовой охоты. Для установления стельности у коров-реципиентов используютнесколько методов: визуальный; по уровню прогестерона в крови или молоке;клинический, главным образом путем ректальной пальпации.
Важным звеном селекционно-племенной работы является достоверностьустановления истинного происхождения телят, полученных при трансплантацииэмбрионов от генетически ценных родителей. Истинное происхождение можноустановить по группам крови и типам белков крови. Пробу крови берут у теленка ввозрасте от 4 недель до 4 месяцев.
Существенной причиной, снижающей эффективность нехирургическойпересадки эмбрионов, является возможное повреждение эндометрия при введениикатетера. В то же время обобщение результатов исследований по нехирургическойпересадке эмбрионов показывает, что эффективность пересадки в большей степенизависит не от того, как глубоко будет введен катетер в рог матки, а от того,насколько правильно выполнено введение.
Однако на этот счет имеется и другая точка зрения: что конструкцияприборов существенно не влияет на результаты извлечения и пересадки эмбрионов.Эти результаты более связаны с типом гонадотропина, квалификацией оператора,качеством и стадией развития эмбрионов. В целом же следует отметить, чтонехирургический метод пересадки эмбрионов обеспечивает аппликацию зародышей всреднем 50–60%, а применение маточных релаксантов перед пересадкой – до 75%.Это существенно выше, чем при хирургическом методе. Технология нехирургическогометода трансплантации сходна с искусственным осеменением коров и продолжается 3–5минут, или 15–20 пересадок в час. Особого внимания заслуживает приём,заключающийся в нехирургической пересадке двух эмбрионов, по одному вкаждый рог матки, что еще больше повышает эффективность трансплантации. Этотприём может быть применен для повышения частоты рождения разнояйцевых(дизиготных) двоен. Он позволяет получить двойные отелы у коров, особенномясных пород, намного быстрее, чем генетическим путем (т.е. селекцией).Результаты проведенных исследований показывают, что нехирургическая пересадкадополнительного эмбриона во второй рог матки дает возможность увеличить выходноворожденных телят на 30%. При пересадке двух эмбрионов в каждый рог маткичастота двоен составляет в среднем 55–60%, вместо 2% при естественноммногоплодии коров. Можно пересаживать (подсаживать) эмбрион и оплодотвореннойкорове, но в контрлатеральный по отношению к желтому телу в яичнике рог матки.Средняя приживляемость эмбриона осемененной корове при нехирургической подсадкесоставляет 50%. Обобщая результаты экспериментов по нехирургическому методупересадки эмбрионов, можно
придти к заключению, что пересадка двух эмбрионов в два рога матки реципиентаили подсадка одного предварительно осемененному реципиенту в контрлатеральныйрог матки являются эффективными и перспективными методами в биотехнологиитрансплантации эмбрионов (П.Б. Завертяев, 1999).
7. Хранение эмбрионов
После оценки на жизнеспособность эмбрионы дважды промывают вфосфатном буфере Дюльбекко с добавлением антибиотиков, засасывающих вминипайету вместе с небольшим количеством среды. Для пересадки используют впервые 2–4 ч после извлечения из половых путей донора.
Необходимость сохранения жизнеспособности эмбрионов болеепродолжительное время возникает в случаях: отсутствия достаточного количестваподходящих реципиентов; сомнительного качества вымытых эмбрионов; созданиебанка эмбрионов для осуществления долгосрочных селекционных программ; обменагенофондом между странами и континентами на коммерческой основе.
Существует несколько способов хранения эмбрионов: кратковременноевне организма, кратковременное в организме, долговременное в сжиженных газах.
При разработке способа кратковременного хранения эмбрионов внеорганизма был использован опыт культивирования тканей и клеток. Наиболееподходящей средой оказалась ТСМ 199 с добавлением 20% эмбриональной сывороткикрови оленей. Эмбрионы хранят в атмосфере обогащенной углекислым газом, припостоянной температуре 37 градусов. В таких условиях они остаютсяжизнеспособными 24–48 ч. Имеются сообщения о том, что снижение температурыдо 10 градусов позволяет продлить их жизнеспособность до 5–6 суток.
На протяжении 3–4 суток эмбрионы можно хранить в яйцепроводахкрольчих, выживаемость составляет в средне 73%. В настоящее время этот способне применяется.
На сегодня известно 2 способа глубокого замораживания эмбрионов: впрограммируемом режиме (ступенчатое замораживание); одномоментный(витрификация).
При замораживании по первому способу отобранные эмбрионы (отличногои хорошего качества) последовательно проводят через растворы криопротектера(глицерин или диметилсульфоксид) возрастающих концентраций, приготовленные нафосфатно-буферном солевом растворе Дюльбекко с добавлением 20% фетальнойсыворотки. После этого эмбрионы переносят в пробирки или ампулы (по 1–4 вкаждую) вместе с 0,3 – 0,4 мл среды с криопротектором. Емкости с эмбрионамигерметизируют (пробирки закрывают фольгой, ампулы запаивают) и помещают вкамеры замораживателя, где охлаждают до -7 градусов в режиме 1 градус в минуту.После достижения указанной температуры вызывают кристаллизацию среды. Для этогов жидком азоте пинцетом касаются стенки пробирки(ампулы) в зоне верхнего краястолбика среды. Дальнейшее охлаждение (до -28 градусов или -35) ведут соскоростью 0,5 градуса в минуту, затем скорость уменьшают до 0,1 градус вминуту; через 10 минут доводят до конечной температуры погружением в жидкийазот.
Одномоментное замораживание (витрификация) – отвердение причрезвычайно высокой вязкости среды, что ведет к образованию стекловидныхструктур. Это возможно при высокой концентрации криопротектора и быстромохлаждении.
Замораживают быстрым методом в минипайетах емкостью 0,25 мл впайету, последовательно засасывают 0,5 М раствор сахарозы, воздух, 1,0 М растворглицерина с эмбрионом, воздух, 0,5 М раствор сахарозы. Концы закрывают с обеихсторон пластиковыми пробками. После эквилибрации пайету, содержащую эмбрион,выдерживают 5 мин в парах жидкого азота, затем опускают в сосуд с жидкимазотом (Н.И. Полянцев, 2001).
Эффективность трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота вомногом определяется условиями хранения зигот. Самым эффективным и перспективнымметодом консервации эмбрионов является их глубокое замораживание(криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 градусов. Разработкаметода долговременного хранения криоконсервированных эмбрионов значительнорасширяет возможности трансплантации. Только в этом случае она может бытьнадежной биотехнологической основой селекционной программы.
Долговременное хранение глубокозамороженных эмбрионов имеет рядпреимуществ. Отпадает необходимость в содержании больших стад или группреципиентов, так как пересадки могут быть проведены в любое время независимо отсроков взятия эмбрионов от доноров, что существенно повышает рентабельностьтрансплантации. Кроме того, криоконсервация эмбрионов позволяет создаватьэмбриобанки от генетически ценных животных, а также сохранять генофонд редких иисчезающих пород и транспортировать эмбрионы в любые страны мира. По оценкеспециалистов криоконсервация эмбрионов экономически оправдана, она исключаетгенетический дрейф, т.е. изменение частоты генов в популяции, вызванныеслучайными причинами.
При соблюдении правильной биотехнологии выживаемость эмбрионовсоставляет 90%, а стельность коров-реципиентов после нехирургической пересадкинаходится в пределах 50–55%. Однако нередко в производственных условиях принесоблюдении технологии замораживания-размораживания выживаемость эмбрионовуменьшается, что существенно снижает рентабельность криоконсервации.Обосновано, что использование метода криоконсервации эмбрионов впроизводственных условиях является рентабельным только в том случае, есливыживаемость эмбрионов после размораживания будет не менее 80%, а процентстельности коров-реципиентов составит 55–60%.
По принятой в России технологии, эмбрионы замораживают сприменением автоматических устройств, обеспечивающих регулирование скоростиохлаждения в заданных режимах. После герметизации емкости с эмбрионами ампулыили пробирки маркируют, затем охлаждают с 20 до -6 градусов со скоростью 1градус в минуту, проводят кристаллизацию, охлаждение со скоростью 0.3 градуса вминуту и погружают в жидкий азот. Применяется также и другой режим: охлаждениеот -7 до -35 градусов со скоростью 0.3 градуса в минуту; от -35 до -38 градусовсо скоростью 0.1 градус в минуту и погружение в жидкий азот. Оттаиваниеэмбрионов производится на водяной бане с температурой 25 или 37 градусов втечение 10–12 секунд. Для хранения и транспортировки замороженных эмбрионовиспользуют сосуды Дьюара различных типов.
Практика криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скотасвидетельствует о том, что на выживаемость эмбрионов существенное влияниеоказывает не только технология глубокого замораживания и оттаивания, но и ихкачество и стадия развития. Для успешной криоконсервации следует отбиратьэмбрионы без морфологических нарушений, находящиеся на стадиях поздней морулыили ранней бластоцисты.
Необходимость отбора эмбрионов диктуется еще и темобстоятельством, что у 10% из них обнаруживается неправильное развитие, а прикриоконсервации повреждаются в среднем еще 25% клеток бластоцисты. Такиеэмбрионы испытывают большую редукцию интактных бластомеров, вследствие чегопереживаемость и дальнейшее развитие после замораживания и оттаиваниясущественно нарушаются.
Таким образом, соблюдение правильной биотехнологии криоконсервациии пересадки эмбрионов позволит обеспечить стельность реципиентов на том жеуровне, что и при пересадке свежеполученных эмбрионов. Вместе с тем метод криоконсервациив будущем может быть существенно упрощен, или вообще можно будет отказаться отудаления криопротектора и пересаживать эмбрионы реципиентам непосредственнопосле оттаивания без дальнейших манипуляций. По прогнозу специалистов,криоконсервированные эмбрионы могут храниться десятки и сотни лет (И.Р. Чернева,2007).
Заключение
Разведение крупного рогатого скота молочных пород с помощью
трансплантации эмбрионов позволяет: обеспечить размножение
высокоценных племенных быков-производителей; формировать поголовье
заводских семейств; усилить давление по отбору быков-производителей,
дочерей – трансплантантов, повысить генетический тренд по селекционным
признакам.
Сравнение молочной продуктивности дочерей быков – трансплантантови их сверстников, полученных путем искусственного
осеменения показало, что удой первых оказался более
высоким по сравнению с дочерьми быков от искусственного осеменения.
Применение метода трансплантации эмбрионов в заводских
семействах от высокоценных коров-доноров сокращает сроки их
формирования в 1,5 раза по сравнению с искусственным осеменением за счет
получения большего числа потомков.
Применение элементов системы МОЭТ дает возможность
увеличения численности полученных путем трансплантации высокоценных
ремонтных быков за одинаковые воспроизводительные циклы
быко – воспроизводящих коров и увеличить число быков, получающих
племенные категории после проверки по качеству потомства в 4 раза. В
закрытом нуклеусном стаде сокращается срок воспроизведения животных
через лучшую его часть поголовья почти в 3 раза.
Расчет затрат на получение одного высокоценного ремонтного быка
методом трансплантации из отечественных эмбрионов показал, что они в 2,2
раза больше по сравнению с расходами на искусственное осеменение, но
меньше в 5,4 раза, чем на покупку быка из-за рубежа и в 3,5 раза, чем наприобретение эмбрионов за пределами страны (И.Р. Чернева, 2007).
Список литературы
1. Завертяев Б.П. Биотехнология в воспроизводстве иселекции крупного рогатого скота. – Л.: «Агропромиздат», 1999.
2. Полянцев Н.И., Подберезный В.В. Ветеринарноеакушерство и биотехника репродукции животных. Ростов н/Д.: Феникс, 2001. – 480 с.
3. Прокофьев М.И. Регуляция размножениясельскохозяйственных животных. – Л.: «Наука», 1998.
4. Студенцов А.П., Шипилов В.С., Никитин В.Я. Ветеринарноеакушерство, гинекология и биотехника размножения. – 7-е изд., перераб. и доп. –М.: Колос, 1999. – 495 с.
5. Чернева И.Р. Лекции по биотехнологии и пересадкеэмбрионов. Московская ветеринарная академия им. Скрябина, 2007.