Федеральное образовательноеучреждение
Высшего профессионального образования
«Санкт-Петербургского»государственного аграрного университета
Калининградский филиал
Контрольная работа
По дисциплине: Акушерство и биотехникаразмножения сельскохозяйственных животных
На тему: «Замораживание итранспортировка спермы»
Выполнила: студентка V курса
зооинженерного факультета
заочной формы обучения
Пирожок Юлия Викторовна.
Полесск 2011
Замораживание идлительное хранение спермы быка
Широкое применение нашелметод замораживания и длительного хранения спермы быков в жидком азоте (-196°).Замороженную сперму можно доставлять в хозяйства 1—2 раза в год и использоватьее по мере надобности. Один раз в месяц сосуды, в которых содержится сперма,необходимо пополнять жидким азотом. На племпредприятиях (станциях) поискусственному осеменению сельскохозяйственных животных сперму замораживают припомощи специального оборудования (приборов, аппаратов и т. д.) и хранят встационарных емкостях, находящихся в хранилищах станций (филиалов). Отсюда ееотправляют в обслуживаемые хозяйства.
Для замораживания спермына племпредприятиях (станциях) применяют следующие методы: Методдвухмоментного разбавления и трехступенчатого режима замораживания спермы быковпри помощи специальных аппаратов (АХК-4, ПЗСС и др.). К замораживанию допускаютсперму с подвижностью спермиев не ниже 8 баллов и их концентрацией не менее 0,8млрд. в 1 мл. Затем сперму разбавляют глюкозо-цитратно-желточной средой(35—37°) двухмоментно: сначала без глиперина, а спустя 4 ч после охлаждения кразбавленной сперме путем подслаивания добавляют такую же среду, имеющуютемпературу плюс 2—5° и содержащую 16% глицерина. Сперму в глицеринизированнойсреде выдерживают в бытовом холодильнике 6—12 ч при температуре 2—5°. Послеэквилибрации (уравновешивания) проверяют подвижность спермиев (она должна бытьне ниже 7 баллов), расфасовывают в стеклянные или полиэтиленовые ампулы по1—1,2 мл. Ампулы запаивают и вкладывают в емкости, которые помещают в аппаратыдля замораживания. Замораживают сперму по трехступенчатому режиму со следующейскоростью: от 0 до 15° по 0,5° в 1 мин, от 15 до 50° по 2—3° в 1 мин и от 50 до80° по 5—7° в 1 мин, после чего емкости (канистры) переносят в жидкий азот дляхранения.
Метод одномоментногоразбавления и быстрого замораживания спермы в форме гранул. В качестве разбавителей используютсинтетические среды № 1 и №2. К разбавителям добавляют нетоксичный стрептомициниз расчета 1 г на 1000 мл жидкости. Свежеполученную сперму (после оценки)разбавляют средой № 1 в отношении 1:1, при этом концентрация глицерина вразбавленной сперме будет 3,5%; если качество спермы позволяет, еедополнительно разбавляют средой № 2. При определении степени разбавления спермыдля замораживания учитывают, что в одной грануле объемом 0,1 мл послеоттаивания должно содержаться не менее 20—25 млн. подвижных спермиев. Послеразбавления сперму помещают в ванночку с водой, температура которой равнатемпературе спермы, и переносят на 30 мин в холодильник. При этом следят, чтобысперма и вода охлаждались не быстрее 1° в минуту. Затем сперму при температуре5° эквилибрируют в течение 5—6 ч. Для приготовления гранул берут блок сухогольда (двуокись углерода) и на его поверхности специальным нагревательнымприбором (к электроутюгу прикрепляется пластина с выступами) делают лункидиаметром 5—7 мм. В каждую лунку 2-миллиметровым шприцем вносят по две каплиспермы. Величина гранул должна быть 0,1 мл. После 5—10-минутной выдержки наповерхности сухого льда гранулы высыпают в сосуд (кружку) с жидким азотом.Гранулы со спермой разных быков высыпают в отдельные емкости. Сперму быков(замороженную) в гранулах можно расфасовывать в специальные трубочки из белойжести с продольным разрезом или в алюминиевые тубы, на которых записываютспециальным карандашом кличку быка, дату получения спермы и названиеплемпредприятия (станции). Кроме замораживания спермы на сухом льду, внастоящее время широкое применение нашел метод замораживания спермы в формегранул в жидком азоте при помощи специальных пластин.
Замораживание спермы вгранулах в жидком азоте на фторопластовых пластинах. После получения и оценки спермубыков разбавляют лактозо-желточной средой с глицерином следующего состава: водадистиллированная — 100 мл, лактоза — 11,5 г, желток куриных яиц —20 мл,глицерин —5 мл. Для предупреждения развития микрофлоры в сперме к среде добавляютпрепарат спермосан-3. Перед разбавлением среду подогревают до 30—35°. Этойсредой сперму быков разбавляют в 2, 10 раз и более, в зависимости от объемагранул. Если применяют концентрированные гранулы спермы объемом по 0,1— 0,2 мл,то для них требуются меньшие степени разбавлении. Для замораживания спермы вгранулах объемом 0,5—1,0 мл сперму разбавляют в 10 раз и более. Такие гранулыперед осеменением коров не требуют дополнительного разбавления. Длязамораживания сперму после разбавления охлаждают до температуры 2—4° в течение4—5 ч, а затем разливают градуированными пипетками, шприцем или разливочноймашиной в лунки (0,1—0,2 или 0,5 мл) охлажденной в жидком азоте фторопластовойпластины. Пластину со спермой выдерживают над поверхностью жидкого азота на расстоянии5—10 см в течение 1,5—2 мин, а затем погружают ее в жидкий азот на 1—2 мин.После замораживания спермы пластину вынимают из жидкого азота, гранулы спермысобирают в сачок или контейнер, а затем пересыпают их в охлажденные чашки. Напунктах искусственного осеменения гранулы спермы хранят в сосудах Дьюара.Уровень азота в них должен быть значительно выше чашек с замороженной спермой вгранулах.
Метод замораживанияспермы в облицованных гранулах. По этому методу для замораживания используютсвежеполученную сперму, разбавленную средами следующего состава:
Среда № 1. 11%-ныйраствор лактозы или сахарозы 63 мл
Желток куриных яиц 30 мл
Глицерин 7 мл
Среда № 2. Водадистиллированная 100 мл
Лактоза или сахароза 6 г
Натрий лимоннокислыйтрехзамещенный пятиводный 1,4 г
Глицерин 5 мл
Приготовленные средыналивают в стерильные полиэтиленовые емкости по 200—400 мл, которыеподсоединяют к специальному устройству для разбавления спермы. После полученияспермы ее разбавляют средой № 1 в соотношении 1: 1 и выдерживают при комнатнойтемпературе 5—10 мин. Затем проводят дополнительное разбавление спермы средой №2 до требуемой концентрации (20—25 млн. в дозе). Сперму разбавляют с помощьюспециального устройства, позволяющего дозирование вводить среды в отделеннуючасть одноразового полиэтиленового спермоприемника со спермой. Спермоприемниксоединяют с тонкостенной полимерной трубкой и выдавливают в нее разбавленнуюсперму. Заполненную спермой трубку разделяют с помощью автомата АРС-2 наотдельные дозы по 0,33 мл с их герметизацией. Облицованные (герметизированные)гранулы помещают в алюминиевые контейнеры, которые закрывают пробками.Контейнеры закрепляют в обоймы специального устройства для эквилибрации изамораживания спермы. Это устройство помещают в холодильник для охлаждения до2—5°. После 5—6-часовой выдержки при такой температуре обойму аппарата сконтейнерами погружают в емкости с жидким азотом на 8—10 мин.
Замораживание спермы всоломинках (пайеттах). При замораживании используют полипропиленовые или поливинилхлоридныетрубочки длиной 100 мм с внутренним диаметром 2,4 мм, одни конец которыхпредварительно закрывают специальным герметизирующим составом: парафин ГОСТ13577—12,0, пентаэритритовый эфир канифоли — 44,8, тальк — 10,1, каучукнатуральный — 1,5, глицерин ГОСТ 6259—71—8,0, краситель — 0,1. Спермуразбавляют трисбуферной средой, содержащей 6,056 г трисбуфера(трисгидрооксиметиланометан), 3,4 г лимонной кислоты, 2,5 г фруктозы, 166,3 млбидистиллированной воды. Раствор делят на две равные части, к первой добавляют15,8 мл бидистиллированной воды, 25 мл свежего яичного желтка, 100 тыс. ЕДантибиотиков, ко второй— 19,7 мл глицерина, желток и антибиотики в тех жеколичествах. Первый разбавитель добавляют к эякуляту, предварительнодоведенному до температуры 25°. Вторую среду медленно добавляют кпредварительно разбавленной сперме с таким расчетом, чтобы в соломинке(пайетте) содержалось 20—25 млн. подвижных спермиев. После разбавления спермурасфасовывают по 0,4 мл в стерильных условиях вакуумным способом. Для этогонеобходимое количество промаркированных соломинок (от 100 до 500 шт. взависимости от количества спермы) ставят открытыми концами вниз в стеклянную плоскодоннуюпосуду со спермой помещают в анаэростат, из которого насосом вначале откачиваютвоздух до давления 0,95 атм., а затем впускают его. Воздух нагнетает сперму всоломинку. Заполненные спермой пайетты зажимают в специальном держателе, притемпературе 25° погружают в герметизирующий состав и закрывают второй конец.После герметизации соломинки помещают на медное сито (корзинку) и переносят впары жидкого азота стационарного хранилища. Корзинку с соломинками опускают вхранилище до соприкосновения с поверхностью азота. Вскипание азота образует токхолодного газа, который охлаждает и замораживает сперму до 100—130° в течение 5мин. Соломинки с замороженной спермой переносят в стаканчики, помещают вканистры и закладывают в хранилище с жидким азотом. Замороженную в соломинкахсперму перед использованием оттаивают в стерильном полиэтиленовом мешочке,помещенном в теплую воду (38—40°) в течение 12—14 с. Независимо от методазамораживания сперму оттаивают и проверяют на подвижность спермиев сразу послезамораживания, второй раз — через сутки, третий — через 7—10 дней и четвертыйраз — через 14—20 дней. Замороженная сперма для дальнейшего хранениядопускается при подвижности спермиев не ниже 4 баллов. Для оценки оттаяннойспермы в пайеттах (выборочно) производят смешивание ее из одной соломинки сравным количеством изотонического раствора лимоннокислого или бикарбонатанатрия. Для этого один конец соломинки обрезают ножницами и опускают в раствор,а затем этими же ножницами обрезают и второй ее конец. Полученную смесь спермыи раствора перемешивают соломинкой и с ее помощью берут каплю для оценки. Дляосеменения используют сперму не раньше 14—20 дней после замораживания.Оттаявшую сперму вновь замораживать нельзя.
Транспортировка спермы
Для перевозки спермы вхозяйства используют различной конструкции емкости — сосуды Дьюара СДС-5 и др.,термосы для ее сохранения и разные виды транспорта. Обычно со станцииискусственного осеменения сперма производителей доставляется в хозяйства напункты автотранспортом. Сперма высокоценных производителей нередкотранспортируется в различные зоны страны авиа- и железнодорожным транспортом.
Основные требования к транспортировкеспермы в термосах и емкостях — предохранить их от тряски (прокладки из поролонаили других материалов), не допускать повреждения и нарушения температурногорежима. Доставка спермы должна производиться в возможно короткие сроки. Вместесо спермой в хозяйство направляют ордер-накладную (2 экз., один возвращают настанцию), в которой указывают качество спермы. При транспортировке по железнойдороге или самолетом термосы, упаковки со спермой пломбируют и снабжают этикеткамис указанием места назначения и адреса отправителя. Для перевозки спермыпроизводителей в хозяйства и хранения ее на колхозных и совхозных пунктах притемпературе 0—4 и 5—20 °С пользуются термосами разной конструкции(термосы-ящики, бытовые сумки-холодильники). Чаще применяют пищевые термосы —это двустенные стеклянные колбы с безвоздушным пространством между стенками,помещенные в пластмассовый или жестяной футляр. Колбу закрывают корковойпробкой — крышкой. Эти термосы хорошо сохраняют температуру, но они оченьхрупкие. Их удобнее использовать для стационарного сохранения спермы напунктах, а для перевозки спермы лучше использовать более прочные термосы.
Сперму быков ибаранов-производителей при температуре хранения 0—5°С перевозят в широкогорловыхпищевых или пластмассовых термосах. Полиэтиленовый термос (конструкции ВИЖ идр.) — двустенный сосуд из полиэтилена с порошково-вакуумной термоизоляцией;емкость его 3,7 л. Температура 2— 4°С поддерживается в нем в течение 72 ч.Пробирки, ампулы, флаконы со спермой укладывают в вату или специальныепоролоновые амортизаторы, которые с ордером помещают в прозрачныеполиэтиленовые мешочки, и запаивают их, затем укладывают на лед термоса исверху кладут небольшое количество льда или снега, имеющего температуру 0°С(лед или снег, взятый со двора во время сильных морозов, необходимо подержать впомещении до начала таяния и проверить температуру термометром). Притемпературе ниже 0°С спермии погибают.
При транспортировкеспермы зимой следует учитывать, чтобы окружающая температура воздуха была нениже минус 5°С, если она ниже, то принимают меры для утепления термоса.
В южных зонах страны дляперевозки спермы быков и баранов, разбавленной специальными средами притемпературе 10—18°С, используют те же термосы, но заполняют их прохладнойводой, а для поддержания указанной температуры добавляют кусочки льда.
Разбавленную спермухряков транспортируют в термосах различных типов («Харьков ТС-3», поролоновыйтермос, термос-ящик «Полтавский» или бытовые сумки холодильники и др.). Притранспортировке спермы хряка в условиях температуры 10—20°С колбы (бутылочки,флаконы) со спермой плотно закрывают пергаментной бумагой или целлофаном ипомещают в термос. После доставки ее на место необходимо снять с колбырезиновое кольцо и хранить сперму негерметически закрытой.
Сперму жеребцов послеразбавления транспортируют при температуре 0—5 °С в баночках (50—100 мл) илифлаконах из-под антибиотиков с притертыми пробками, фиксируют их резиновымкольцом и погружают в термос со льдом (конструкции ВНИИК. и др.). Чтобы спермаохлаждалась постепенно, сосуды с ней перед этим помещают в полиэтиленовые илимарлевые мешочки, предварительно обернув их тонким слоем ваты. Сверху покрываюттонким слоем льда и закрывают термос крышкой.
При перевозке спермыследует принимать меры, предупреждающие ее взбалтывание и встряхивание в пути(прокладка ветошью, поролоном и др.). Термосы и сосуды, в которых перевозятсперму, нужно помещать в переднюю часть автомашины, где они будут подвергатьсяменьшему встряхиванию. Особенно важно соблюдать все эти правила при транспортировкеспермы по плохим дорогам.
Главное условие притранспортировке замороженной спермы — постоянное поддержание низкой температуры
Замороженнуюсперму перевозят в сосудах Дьюара, в которых ее и хранят.
На пункте хозяйства приполучении сосуда с замороженной спермой прежде всего должно быть выяснено,имеется ли в сосуде достаточное количество хладагента, т. е. покрыты ли ампулыим сверху. Если жидкий азот улетучился, то сперма может быть использованатолько после установления под микроскопом хорошей активности спермиев. Хранитьсперму без хладагента нельзя, оттаянную ее можно использовать только вближайшие часы.
Если в хозяйстве напункте искусственного осеменения имеется сосуд с жидким азотом, где хранитсязамороженная сперма, то кассеты или канистры с гранулами, пакеты со спермой вкапиллярах-соломинках быстро переносят из одного сосуда в другой, соблюдаятехнику безопасности.
Санитарно-гигиеническиеусловия при перевозке спермы включают меры профилактики заразных болезней.Инструменты, термосы и посуду, отправляемые станцией для использования напункте, после обеззараживания возвращают на станцию, где их вновь стерилизуют.Особенно за этим надо следить при обслуживании неблагополучных по инфекционнымболезням хозяйств в данном случае обеззараживание проводят в обособленномпомещении; мягкий упаковочный материал (бумагу, стружку и пр.) немедленносжигают. Контролирует выполнение этих работ ветеринарный персонал.
Список литературы
1. Завертяев Б. П.«Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота»-«Агропромиздат», 1989г.
2. Никитин В.Я.,Миролюбова М.Г. «Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения»М-«Колос» ,2000г.
3. Петров И.А.,Порфирьев И.А. «Акушерство и биотехника репродукции животных» — «Лань»,2009г.