«Тонкослойнаяхроматография остаточных концентраций пестицидов в пищевых продуктах»
Содержание
Введение
Глава1.Основы планарной (тонкослойной) хроматографии
Глава 2.Состояние и перспективы использования современных инструментальных методованализа пестицидов
Глава 3. Методические указанияпо определению хлорорганических пестицидов в воде, продуктах питания, кормах итабачных изделиях хроматографией в тонком слое
Глава 4. Современноеаппаратурное оформление
Литература
Введение
Химикаты (инсектициды,гербициды, фунгициды) используются для удобрения почвы, борьбы с сорняками,насекомыми и грызунами, для защиты урожая от плесени и грибков. С их помощьюповышают урожайность, увеличивают срок хранения растений, улучшают внешний видфруктов, овощей и зерна. Сегодня предлагается выбор из 5000 видов пестицидов и700 химических ингредиентов. По сравнению с началом 40-х гг., когда быливпервые использованы пестициды, их потребление в сельском хозяйстве возросло вдесятки раз, а потери урожая из-за насекомых за последние 50 лет увеличилисьвдвое. Эта статистика ставит под сомнение «эффективность» пестицидов.Интересно, что применение пестицидов привело к развитию 650 видов вредителей,устойчивых к некоторым из этих ядов.
Каждый день в мире около 3000 человек отравляются пестицидами. Это болеемиллиона отравлений в год химическими веществами, загрязняющими воздух, почвы,воду и продукты. Отдельно по Европе эти цифры не менее шокирующие. Только в2005 году страны ЕС начали пытаться ввести единые стандарты в оценке опасностихимических веществ, попадающих в продукты питания, и единую маркировку дляпродуктов питания. Известно, что многие пестициды опасны для здоровья иобладают канцерогенными свойствами, однако до сих пор покупатель не может поэтикетке определить, насколько же насыщен покупаемый продукт этими неполезнымивеществами. В развитых странах у потребителя, в принципе, существует выбор — покупать «органическую» (выращенную без химикатов) продукцию, илиобычную. Разница в цене весьма существенна, и выбор «органических»продуктов не столь велик, как обычных.
Организация по защитеокружающей среды допускает, что из 320 пестицидов, разрешенных к применению вагрономии, по меньшей мере, 66 -
предполагаемые канцерогены. Многие из этих пестицидов смешиваются с 1200нейтральными ингредиентами, состав которых производители не обязаны разглашать,ссылаясь на «коммерческую тайну». Для 800 из них до сих пор неустановлены уровни токсичности, они предположительно являются канцерогенами,поэтому необходимо использовать методы идентификации пестицидов в продуктахпитания.
ГЛАВА1. ОСНОВЫ ПЛАНАРНОЙ (ТОНКОСЛОЙНОЙ) ХРОМАТОГРАФИИ
Планарная (тонкослойная)хроматография
Тонкослойная (планарная)хроматография занимает одно из ведущих мест в качественном и полуколичественноманализе сложных природных, фармацевтических, медикобиологических и химическихобъектов. Среди других хроматографических методов планарную хроматографиюотличают следующие достоинства и особенности:
— это единственныйхроматографический метод, позволяющий проводить полный анализ неизвестнойсмеси, поскольку исследователь имеет возможность проверить, не остались ли настарте неэлюированные компоненты;
-по производительностипревосходит газовую и
высокоэффективнуюжидкостную хроматографию, по крайней мере, на порядок; использует более простоеи дешевое оборудование;
— обладает высокойселективностью, которую легко варьировать, подбирая состав подвижной фазы; вотличие от ВЭЖХ нет ограничений в выборе растворителей;
— дает возможностьодновременного разделения нескольких образцов; использования однократного илимногократного элюирования (при различных условиях), а также одновременногоразделения компонентов одного и того же образца с помощью различных элюентов;
— возможна оптимизацияразрешающей способности
хроматографическойсистемы при разделении сложной смеси только для интересующих компонентов, чтопозволяет экономить время;
— возможно детектированиесоединений с высокой
чувствительностью иселективностью, которые легко варьировать подбором проявляющего реагента;полученные результаты разделения легко оценить визуально;
можно сохранять хроматограммыдля последующего
детектирования иосуществлять спектральную идентификацию
хроматографических зонпосле разделения в любом диапазоне длин волн, включая ИК.
у планарной хроматографииесть и некоторые недостатки:
— ограниченнаяразделяющая способность из-за сравнительно небольшой длины разделяющей зоны(3-10 см);
— чувствительность ниже,чем в случае ВЭЖХ;
— зависимость результатованализа от окружающей среды: относительной влажности, температуры, а такженаличия загрязняющих веществ в воздухе;
— трудности в работе собразцами, имеющими высокую летучесть, а также с веществами, чувствительными кдействию кислорода воздуха или света.
Классическая, наиболеепростая и широко используемая методика тонкослойной хроматографии включаетпроведение следующих основных операций:
1)нанесение анализируемойпробы на слой сорбента;
2)разделение компонентовпробы на отдельные зоны в потоке подвижной фазы;
3) обнаружение зон наслое сорбента (часто реагентом, образующим с разделенными веществами окрашенныесоединения);
4) количественная оценкаполученного разделения, включая определение величины удерживания и определениесодержания вещества в зонах на хроматограмме.
Положение зоны веществана хроматограмме характеризуется величиной Rf, которая равнаотношению расстояния от стартовой линии до центра зоны вещества к расстоянию отстартовой линии до линии фронта. Значение Rf — величина постояннаядля данного соединения в данной истеме и зависит от ряда условий: способаэлюирования, качества и активности сорбента, толщины слоя, качестварастворителей, количества нанесенного вещества, длины пробега растворителей,положения стартовой линии и почти не зависит от температуры. По этой величинепроводят идентификацию компонентов в смеси.
На качество разделениякомпонентов смеси в планарной хроматографии влияет большое число факторов: типразделительной камеры; предварительное насыщение камеры и слоя сорбента парамиподвижной фазы; стартовый размер пятна; расстояние от старта до нижнего краяпластинки; относительная влажность воздуха лабораторного помещения; среднийдиаметр частиц и их форма; толщина и равномерность нанесения слоя сорбента;наличие микроповреждений слоя; тип вещества, связывающего сорбент; скоростьэлюирования; объем растворителя в камере; наличие примесей в элюенте; конвекцияв газовой фазе внутри камеры.
Для разделения смесейвеществ в тонком слое сорбента применяют адсорбционную, распределительную иионообменную хроматографию, отличающиеся, прежде всего характеромвзаимодействий между растворенными веществами и твердой или жидкой фазами, скоторыми они соприкасаются. На практике эти взаимодействия почти никогда непротекают изолированно, и разделение веществ обусловлено несколькимивзаимодействиями. При выборе подходящего варианта хроматографии в первуюочередь следует обратить внимание на строение разделяемых веществ. При помощиадсорбционной и распределительной хроматографии разделяются вещества, строениекоторых различается природой, числом и характером полярных и неполярныхзаместителей. При хроматографировании в тонком слое сорбента чаще всегоприменяют адсорбционную хроматографию, которая проще по выполнению, болееэффективна, а результаты анализа более воспроизводимы.
Сорбенты в тонкослойнойхроматографии
В качестве сорбентов вТСХ применяют материалы, которые отвечают следующим требованиям: образуютхимически и физически стабильные слои; не образуют ковалентных связей сразделяемыми веществами; не растворяются в подвижной фазе или перемещаютсявместе с ней по пластинке; не содержат компонентов, мешающих разделению или детектированию;не имеют собственной окраски; не набухают и не сжимаются под действиемподвижной фазы.
В качестве подложки длясорбента используется стекло, алюминиевая фольга, полимерные пленки(полиэтилентерефталат). Для придания стабильности слоя сорбента на подложкеиспользуются различные связующие вещества: гипс (5-10%), силиказоль, силикатыщелочных металлов, полиакриламид, полиакриловый эфир, крахмал. К адсорбентучасто добавляют флуоресцентный индикатор для детектирования веществ,поглощающих в УФ-области спектра. С этой целью используют: смесь силикатовцинка и магния; смесь сульфидов цинка и кадмия; вольфраматы щелочноземельныхэлементов.
Большое значение,особенно для эффективности разделения, имеют такие характеристики сорбентов,как диаметр частиц, среднее распределение частиц по размерам и размер пор. Вклассической тонкослойной хроматографии для производства пластинок используютсячастицы с размером 5 — 20 мкм. Для высокоэффективной тонкослойной хроматографии(ВЭТСХ) необходим сорбент, диаметр частиц которого составляет 5 — 7 мкм.Сравнение характеристик пластинок для ТСХ и ВЭТСХ приведено в таБЛ.22.Монолитные сорбенты представляют собой новое поколение стационарных фаз,которые могут быть использованы и в планарной хроматографии получают прямой сополимеризациейметакриловых полимеров, например, сополимера глицинметакрилата иэтилендиметакрилата. Монолитные стационарные фазы не содержат частиц, а рольразделительного пространства выполняют поверхность и объем проточных каналов(пор). Макропористая структура монолитных сорбентов содержит как минимум двавида пор: макро- и мезопоры. Преимущества таких носителей заключаются взаметном повышении скорости и эффективности разделения, так как для нихотсутствуют обычные диффузионные ограничения межфазного массообмена.
Таблица 1. Сравнениехарактеристик пластинок для классической (ТСХ) и высокоэффективной (ВЭТСХ)тонкослойной хроматографии.Характеристики ТСХ ВЭТСХ Средний размер частиц, мкм 5 -20 5-7 Толщина слоя, мкм 250 100,200 Количество проб 12 36 -72 Длина пробега фронта растворителя, мм 100 — 150 30 — 50 Время разделения, мин 30 — 200 3 -20 Количество растворителя, мл 50 5 -10 Предел детектирования, нг поглощение 100 — 1000 10 — 100 I I флуоресценция 1 — 100 0,1 — 10 I
Основные типы сорбентов,используемых в ТСХ
Силикагель
полярный адсорбент,содержит активные силанольные и силоксановые группы, его применяют дляразделения соединений различной полярности.
Оксид алюминия
полярный адсорбент сгетерогенной поверхностью, содержит активные ОН-группы, обладает заметновыраженными протоноакцепторными свойствами; его применяют для разделенияароматических углеводородов, алкалоидов, хлоруглеводородов, стероидов
Флоросил — основнойсиликат магния, занимает промежуточное положение между оксидом алюминия исиликагелем; удобен для разделения флаваноидов, стероидов и ацетилированныхуглеводородов
Полиамиды — группаполярных сорбентов со смешанным
механизмом разделения:карбоксамидная группа ответственна за адсорбционный механизм, метиленовыезвенья — за распределительный механизм. Эти сорбенты применяют для разделенияпищевых красителей, флаваноидов, танинов, нитрофенолов, спиртов, кислот.
Модифицированныесиликагели с привитыми группами (амино, циано, диол-, C2-,Cg-,C1g-), отличными по полярности.
Важной характеристикойсорбента является его активность, она зависит от содержания воды и понижаетсяпри увеличении содержания воды в сорбенте.
Для успешного разделениясмесей веществ большое значение имеет выбор сорбента. В первую очередь нужноисходить из свойств разделяемых соединений: их растворимости (гидрофильности,гидрофобности), содержания и характера функциональных групп. Насыщенныеуглеводороды адсорбируются слабо или совсем не адсорбируются на силикагелях иоксиде алюминия. Введение двойных связей, особенно сопряженных, увеличиваетадсорбционную способность соединений.
Функциональные группы веще большей степени усиливают способность веществ к адсорбции. Адсорбционнаяспособность функциональных групп возрастает в следующем порядке:
СН=СН
Для количественной оценкисодержания вещества в хроматографическux зонах используют различные методы:
1. Определение судалением хроматографической зоны с пластинки можно проводить двояким образом:переносом хроматографической зоны вместе с сорбентом либо экстрагированиемхроматографической зоны со слоя сорбента.
2. Определение соединенийнепосредственно на пластинке методом визуального сравнения размеров площадейпятен и их окраски с соответствующими параметрами пятен стандартных образцов
3. Метод денситометрии,повышающий точность результатов определения, основан на сканированиихроматограмм в видимом и УФсвете с помощью «хроматографическихспектрофотометров» денситометров. Денситометры позволяют измерять поглощениесвета веществом на хроматограмме в режиме пропускания или отражения, а такжефлуоресценцию и ее тушение. Режим пропускания доступен, если только исследуемоевещество имеет полосу поглощения в видимой области спектра. В У Ф-областирегистрацию в режиме про пускания осуществить нельзя из-за собственногопоглощения силикагеля и подложки хроматограммы.
4. Методвuдеоденсuтометрuu — сравнительно новый метод для количественной обработкихроматограмм. Принцип метода заключается во введении изображения хроматограммыв компьютер с помощью видеокамеры или цифровой камеры с последующим сравнениеминтенсивностей пятен стандартных и определяемых соединений. Видеоденситометрвключает осветительный блок, видеокамеру с платой видеоввода или сканер,персональный компьютер с установленной операционной системой Windows исоответствующим программным обеспечением. В России такие комплексы производятНТЦ «Ленхром» (г. С.-Петербург) — денситометр «ДенСкан-О4» и «Сорбполимер» (г.Краснодар) денситометр «Сорбфил». Программа обработки хроматографических данныхпозволяет выполнять следующие функции: вводить изображения хроматограмм исохранять их с высоким качеством и разрешением; выделять на введенномизображении хроматограммы рабочий участок, на котором будет производитьсядальнейшая обработка изображения; производить
автоматический или ручнойпоиск пятен; проводить обработку пятен, переводить их в формухроматографических пиков, рассчитывать значения Rr и площади пиков;измерять содержание вещества в анализируемых пятнах (в относительных единицах);вводить значения концентраций для построения градуировочных зависимостей:линейной интерполяцией; линейной аппроксимацией более чем, через две точки;квадратичной интерполяцией; автоматически вычислять содержание вещества ванализируемых пятнах по введенным калибровочным значениям; представлятьрезультаты в виде печатных документов. [1-3]
Количественную обработкупятна в видеоденситометрии проводят по двум характеристикам: по площади пятна иего «объему» в пространстве, при этом в качестве третьей координаты используютяркость (интенсивность окраски пятна) (рис. 1).
/>
Рис. 1. Вид пространственногораспределения яркости в области пятна:
Ai,j — значение уровняяркости точки пятна; Bi,j- значение уровня яркости точки на базовойповерхности.
5. Денсuтометрuя спланшетным сканером с программным обеспечением для обработки хроматограммпрактически не отличающимся от стандартных программ, применяемых длявидеоденситометров, но существенно меньшей стоимости. При этом сканированиедает более четкое изображение хроматографических зон, что можно объяснить пониженнымвлиянием неравномерности освещения анализируемых объектов, чем в случаевидеоденситометра.
Прuменение для решенияпрактическux задач. Применение тех особенно эффективно для предварительногоразделения (по классам, группам, видам веществ) компонентов сложных смесейорганических загрязнителей воды, почвы и воздуха. Индивидуальная идентификацияс помощью одной лишь тех затруднена из-за отсутствия высокочувствительных иселективных детекторов, кроме того, определение целевых компонентов менееточно, чем в случае ГХ и ВЭЖХ. Часто ТСХ применяют на первом этапе анализа дляразделения сложных и многокомпонентных смесей органических соединений наотдельные более простые группы, и уж потом проводят более детальноеисследование этих групп «более тонкими» методами (ГХ, ВЭЖХ, ЯМР, ИК илимасс-спектрометрией).
Использование ТСХ прианализе загрязненной пресной и морской воды открывает широкие возможности дляпрепаративного разделения, предшествующего другим методам, разделения искомыхпримесей и дополнительной идентификации. ТСХ используют для обнаружения и
полуколичественногоопределения веществ разной природы: поверхностно-активных веществ,углеводородов, ПАУ, фенолов, пестицидов.
Для определения неионныхПАВ в сточных и речных водах используют пластинки со слоем силикагеля илиКизельгеля о. На пластинку наносят хлороформенный экстракт ПАВ и разделяют ихпри использовании в качестве подвижной фазы смесей этилацетат: вода: уксуснаякислота. Обнаруживают пятна при опрыскивании смесью: реактив Бургера: фосфорнаякислота: этанол 5% раствор BaCI2.2H20 (10:1:10:5). ПАВпроявляют в виде розовых пятен. Метод позволяет определить в воде от 0,1 до 1,0мг/л неионогенных ПАВ. Из сточных вод в этих условиях экстрагируются ионныеПАВ, но они движутся вместе с фронтом растворителя и не проявляются.
Предложено много методикопределения фенолов. Хлорфенолы разделяют на пластинках с оксидом алюминия примногократном элюировании бензолом или на силикагелевых пластинках приэлюировании смесью бензола и петролейного эфира (1: 1). Определяют фенолыпроявлением 2% раствором 4-аминоантипирина (предел обнаружения 0,5 мкг/л) илипо флуоресценции при 254 нм (до 0,5 мкг фенолов). Второй вариант определенияфенолов — разделение в виде: антипириновых, 4-аминоантипириновых производныхили с п- нитрофенилазокрасителями.[4-6]
ГЛАВА 2.СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СОВРЕМЕННЫХ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДОВАНАЛИЗА ПЕСТИЦИДОВ В УКРАИНЕ
Увеличениемасштабов и ассортимента применения пестицидов в сельскохозяйственной практикепродолжает стимулировать разработку и использование методов аналитической химиималых концентраций токсических органических веществ для анализа объектовокружающей среды, сельскохозяйственного сырья, кормов и продуктов питания.Определение остатков пестицидов в этих средах не имеет самостоятельногозначения, но является необходимой частью общей информации для достиженияадекватной оценки риска, связанного с применением пестицидов. Оценка риска впрошлом была связана главным образом с безопасностью человека, и по этой причинеопределение остатков пестицидов было сосредоточено, главным образом, насельскохозяйственном сырье и продуктах питания. В последние годы увеличениевнимания к влиянию пестицидов не только на человека, но и на его окружение,требует значительно большей информации по остаточным количествам не толькоприменяемых пестицидов, но и продуктов их разрушения и метаболизма в различныхсредах. Изучение остатков пестицидов теперь включает все видысельскохозяйственного сырья, кормов и продуктов питания, воду, воздух и почву.Это в сочетании с внедрением в сельскохозяйственные технологии пестицидныхпрепаратов с низкими нормами расхода (
Принимаяво внимание объем необходимой информации, который должен быть получен врезультате анализа различных матриц и сред, методика выполнения измерений (МВИ)остатков пестицидов должна отвечать большинству или всем следующим требованиям:
—обеспечивать достоверное отделение анализируемого вещества от мешающихпримесей;
—обеспечивать однозначную идентификацию анализируемого вещества;
—иметь низкий предел количественного определения;
—иметь короткое время анализа;
—иметь низкую стоимость;
—обеспечивать разумную степень точности и правильности результатов;
—обеспечивать надежность получаемых результатов.
Стремлениеразработчиков методик как можно полнее удовлетворять этим требованиям являетсяодним из основных стимулов в совершенствовании МВИ. Современная МВИ, основаннаяна инструментальных методах анализа, подразделяется на следующие стадии:
—экстракция анализируемых пестицидов и их метаболитов;
—очистка полученного экстракта;
—возможное получение производных анализируемых пестицидов и продуктов ихразрушения и метаболизма;
—хроматографическое разделение
—определение (детектирование) анализируемых веществ.
Способэкстракции, который используется в МВИ, должен обеспечивать количественное иселективное извлечение определяемых веществ, т. е. максимально извлекать изанализируемой матрицы определяемые вещества на фоне как можно меньшегоизвлечения коэкстрактивных (мешающих) веществ. В противном случае потребуетсяболее сложная стадия очистки полученного экстракта, что неизбежно приведет кпотерям определяемых веществ и увеличению общей ошибки анализа. В связи с этимв настоящее время проявляется общая тенденция в анализе остатков пестицидовиспользовать способы экстракции, которые легко поддаются автоматизации,уменьшают число операций, выполняемых вручную, и количества используемыхорганических растворителей и обеспечивают возможность анализа большого числапроб. Этим требованиям отвечает твердофазная экстракция (ТФЭ), которая являетсяальтернативой традиционной экстракции в системе жидкость-жидкость и котораяпозволяет объединить отбор проб с концентрированием. Использование готовыхкоммерчески доступных патронов (картриджей) для ТФЭ значительно упрощаетпроцедуру подготовки проб к анализу по сравнению с традиционными способами. ТФЭиспользуется не только в анализе воды, но также в анализе почвы, фруктов,овощей и других пищевых продуктов. Из экстрактов этих матриц, полученных сиспользованием малополярных и неполярных органических растворителей, пестицидызатем концентрируют на молекулярных сорбентах за счет диполь-дипольныхвзаимодействий или образования водородных связей. Для этих целей используюткартриджи, заполненные силикагелем, флоризилом или оксидом алюминия. Намипроведены систематические исследования процесса динамической сорбции следовыхколичеств пестицидов различных классов на макросетчатом «сверхсшитом»сополимере стирола с дивинилбензолом (полисорб. В результате этих исследованийразработан сорбционный способ концентрирования с использованием пластмассовыхпатронов-концентраторов, заполненных полисорбом, который позволяет проводитьэкспресс-определение пестицидов в воде на 1-2 порядка ниже значений ПДК.Интересно отметить, что в совместном проекте SMT4-CT96-2142 семи Европейскихисследовательских центров Франции, Бельгии, Германии, Нидерландов, Испании иПортугалии, который стартовал в 1997 году и предметом которого являласьразработка метода определения множественных остатков пестицидов в питьевой водес помощью ТФЭ, позволяющего контролировать пестициды в воде на уровне 0,1 мкг/л(в соответствии с требованиями Европейской Директивы по питьевой воде80/778/EEC), были исследованы девять сорбентов различных фирм на основеС18-обращенной фазы и SDB-1 [10]. В результате этих исследований былоустановлено, что наиболее подходящим сорбентом для ТФЭ пестицидов из водыоказался SDB-1 — сорбент на основе сополимера стирола с дивинилбензолом,эффективность которого для этих целей была нами установлена еще в начале 80-хгодов прошлого столетия.
Впоследние годы для извлечения пестицидов из различных матриц находит применениесферхкритическая флюидная экстракция (СФЭ), которая рассматривается какальтернатива обычной жидкостной экстракции в аппарате Сокслета. В качествесверхкритических флюидов используются диоксид углерода, оксид азота и смесидиоксида углерода и оксида азота с метанолом и толуолом. При сверхкритическихусловиях (температура 40 °С, давление 300 атм) сольватирующиесвойства диоксида углерода подобны таковым фреонов или гексана. Одно изосновных преимуществ СФЭ заключается в том, что при этом из анализируемыхматриц извлекаются остатки различных пестицидов и продуктов их разрушения иметаболизма, которые не экстрагируются традиционными методами, даже припроведении экстракции в аппарате Сокслета. Аппаратурное оформление ТФЭ позволяетполностью автоматизировать этот процесс. Украинским химикам-аналитикам,работающим в области анализа пестицидов, еще только предстоит знакомство с этиммощным средством извлечения остатков пестицидов из почвы, растительногоматериала и животных тканей, позволяющим проводить экстракцию большогоколичества проб. Особенно впечатляет эффективность ТФЭ для анализа такихсупертоксикантов, как полихлорированные дибензодиоксины и полихлорированныедибензофураны.
Вкачестве способа очистки экстрактов в анализе остатков пестицидов в настоящеевремя часто применяется гель-хроматография либо как самостоятельный способ, иликак ступень в многостадийной операции очистки. Особенно эффективен этот способочистки при анализе матриц, содержащих большое количество липидов. Наибольшееиспользование для этого способа очистки получили гели, работающие в средеорганических растворителей. Разработаны автоматизированные установки,позволяющие очищать большое количество проб без какого-либо внимания со стороныперсонала лаборатории. Эффективность этого способа очистки была впервыепродемонстрирована нами в отечественных исследованиях для очистки экстрактов изриса, содержащих гербициды сатурн и префикс, при использовании гелей,образованных слабосшитыми сополимерами стирола с дивинилбензолом, хорошонабухающими в малополярных и неполярных органических растворителях.
Гель-хроматографияявляется обязательной стадией многоступенчатой операции очистки при разработкеи использовании так называемых методик определения множественных остатков(multiresidue) пестицидов. Увеличение числа применяемых пестицидов и источникових поступления в объекты окружающей среды, сельскохозяйственное сырье ипродукты питания обусловливает значительное увеличение объемахимико-аналитических исследований. Естественно, что использовать дляопределения каждого пестицида в каждой анализируемой матрице отдельную МВИэкономически невыгодно и неудобно. Значительно более привлекательны такиеметодические подходы, которые позволяют охватить все количество применяемых всельскохозяйственной практике пестицидов несколькими МВИ. Такой подход имеетряд важных преимуществ: во-первых, общее время анализа существенно сокращается;во-вторых, общее число пестицидов и их метаболитов, которые могут бытьопределены этими методиками, резко увеличивается и, в третьих, эти методикимогут быть при необходимости быстро адаптированы к новым анализируемым матрицами к новым пестицидам. В настоящее время за рубежом для контроля за содержаниемпестицидов используются только методики определения множественных остатковпестицидов, которые позволяют проводить определение в одной пробесельскохозяйственного сырья, пищевого продукта, воды, почвы или воздухапрактически всех пестицидов, которые используются в сельскохозяйственнойпрактике. Так, например, методика определения множественных остатковАОАС 990.06 позволяет проводить определение в одной пробе питьевой воды 29хлорорганических пестицидов. Методика определения множественных остатковАОАС 991.07 предназначена для определения 44 азот- и фосфорорганическихпестицидов в одной пробе питьевой воды. Методика определения множественныхостатков Министерства здравоохранения Германии S 8 предназначена дляопределения в одной пробе фруктов или овощей 91 хлор-, фосфор- и триазиновыхпестицидов. Методика определения множественных остатков S 19 (Германия)позволяет проводить определение в одной пробе почвы 220 хлор-, фосфор- иазотсодержащих пестицидов. Методика Европейского проекта SMT4-CT96-2142позволяет определять в одной пробе питьевой воды 38 пестицидов, являющихсяприоритетными для стран-разработчиков методики.
Ксожалению, в Украине до настоящего времени при разработке МВИ, предназначенныхдля контроля за содержанием остатков пестицидов, используется подход, которыйбыл сформирован в недрах Государственной комиссии по химическим средствамборьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками бывшего СССР, изаключающийся в необходимости разработки отдельной методики для каждогопестицида и каждой анализируемой матрицы. В основу такой разработки кладутсяметодики, которые представляет фирма-разработчик пестицидного препарата вместес отчетом о валидации представляемых методик независимой лабораторией ирезультатами полевых испытаний по определению остатков пестицидов всельскохозяйственных культурах, почве, воде и воздухе рабочей зоны. Этиметодики фирма-разработчик пестицидного препарата представляет только дляпрохождения процедуры государственной регистрации пестицида в Украине для того,чтобы показать, что данные по остаткам пестицида в сельскохозяйственныхкультурах, почве, воде и воздухе рабочей зоны, которые представляет фирма,получены с помощью валидированных методик. Таким образом, МВИ, представляемыефирмой-разработчиком пестицидного препарата, служат только для целейгосударственной регистрации пестицида и не являются МВИ, с помощью которых встране-разработчике пестицидного препарата осуществляется контроль засодержанием остатков пестицидов в сельскохозяйствнном сырье, продуктах питанияи объектах окружающей среды. Прерогатива разработки МВИ, предназначенных дляконтроля за содержанием остатков пестицидов в различных средах, за рубежомзакреплена не за фирмами-производителями пестицидных препаратов, а заминистерствами и ведомствами, которые ответственны за ту или иную областьконтроля. Например, в США это Агенство по охране окружающей среды (EPA) иАдминистрация по контролю пищевых продуктов и лекарственных препаратов (FDA).
Такимобразом, для разработки современной стратегии использования МВИ для определенияостатков пестицидов в Украине необходимо четко разграничить МВИ, которыенеобходимы для целей государственной регистрации пестицидов, и МВИ, которыепредназначены для государственного санитарно-эпидемиологического надзора заприменением пестицидов. Для целей государственной регистрации пестицидовэкономически и методически оправдан следующий подход к разработке МВИ: одинпестицид — одна сельскохозяйственная культура/среда — одна МВИ. В основуразработки таких МВИ кладутся методики, которые представляют фирмы-разработчикипестицидных препаратов. Разработанные таким образом МВИ используются приопределении остатков пестицидов в сельскохозяйственном сырье, почве, воде ивоздухе рабочей зоны только при проведении предрегистрационных государственныхиспытаний пестицидов. Для целей государственного санитарно-эпидемиологическогонадзора за применением пестицидов конечно же необходимы МВИ, в основуразработки которых положен принцип определения множественных остатковпестицидов в одной пробе. Использование таких МВИ значительно удешевит как ихразработку, так и последующее проведение санитарно-эпидемиологического надзораза применением пестицидов. В настоящее время рассматривается вопрос овозобновлении функционирования системы мониторинга пестицидов, которая в своевремя (1984-1991 гг.) была разработана во ВНИИГИНТОКС (теперь Институтэкогигиены и токсикологии им. Л.И.Медведя) и внедрена в практику работысети санэпидстанций МЗ Украины. В основе такого мониторинга должны лежатьтолько методики определения множественных остатков пестицидов. Нами проанализированыхимико-аналитические аспекты функционирования в прошлом унифицированной системыконтроля за остаточными количествами пестицидов в сельскохозяйственном сырье,продуктах питания и объектах окружащей среды, намечены пути для модернизацииэтой системы и методические подходы для разработки методик определениямножественных остатков пестицидов в фруктах, овощах и воде.
Хроматографическиеметоды продолжают оставаться основным инструментом аналитической химиипестицидов. По темпам развития среди них первые места занимают капиллярнаягазовая хроматография (ГХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) ихромато-масс-спектрометрия (ГХ/МС, ЖХ/МС). Капиллярная ГХ не имеет альтернативыпри разработке методик определения множественных остатков пестицидов.
Рядпестицидов, используемых в сельском хозяйстве Украины, не может быть подвергнутнепосредственному газохроматографичекому определению вследствие их низкойлетучести или недостаточной термической стабильности. Для того, чтобы сделатьвозможным определение этих соединений с помощью ГХ их превращают в различныепроизводные. Такая операция обычно повышает летучесть и уменьшает адсорбциюхроматографируемых соединений на твердых носителях, увеличивает ихтермостойкость и улучшает разделение. В некоторых случаях при этом достигаетсятакже и значительное увеличение чувствительности детектирования полученныхпроизводных. Все это является предметом реакционной газовой хроматографии. Намивпервые в отечественных исследованиях была показана эффективность использованияреакционной газовой хроматографии в анализе пестицидов на примере определенияостаточных количеств гербицидов — производных феноксиалканкарбоновых кислот(2,4-Д, 2,4-ДМ) в продуктах питания. С тех пор метод реакционной газовойхроматрографии широко используется в лабораториях Института при проведениигосударственных испытаний пестицидов и осуществлении государственнойсанитарно-гигиенической экспертизы.
МетодВЭЖХ продемонстрировал определенные преимущества при совместном определениипестицидов и их метаболитов в одной пробе. Это в особой степени касается техпестицидов, которые невозможно определять с помощью ГХ вследствие ихтермической нестабильности, высокой полярности и низкой летучести.Использование ВЭЖХ в анализе пестицидов позволяет обойтись без трудоемкойоперации получения производных. Институт одним из первых в Украине началиспользование этого метода для определения пестицидов. В настоящее время ВЭЖХ —рутинный метод анализа во многих лабораториях Института. Особенно широко этотметод используется при проведении государственной санитарно-гигиеническойэкспертизы пищевых продуктов.
Перечисляяхроматографические методы, которые используются в анализе остатков пестицидов,нельзя не упомянуть и метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), который былоткрыт в 1938 г. украинскими учеными Н.А.Измайловым и М.С.Шрайбер.Полуколичественный вариант ТСХ является и в настоящее время недорогим иэффективным методом разделения, идентификации и полуколичественного определенияостатков пестицидов. Именно полуколичественный вариант ТСХ сыграл большую рольв становлении химико-аналитической службы Министерства здравоохранения Украиныдля контроля за содержанием остатков пестицидов в продуктах питания и объектахокружающей среды, когда методы ГХ и ВЭЖХ еще не были доступны для широкогоиспользования. Во многом это произошло благодаря работам, выполненным в стенахИнститута. В настоящее время ТСХ в анализе остатков пестицидов в основномиспользуется как альтернативный аналитический метод для подтверждения правильностиидентификации пестицидов, полученной с помощью методов ГХ и ВЭЖХ. ТСХнезаменимый инструмент и в анализе остатков пестицидов, когда требуетсяпроверить очень большое число проб пищевых продуктов или объектов окружающейсреды на наличие пестицидов. В таких случаях обычно применяется методологияскрининга. Все пробы, давшие «положительную» реакцию, далее исследуюткаким-то более специфическим инструментальным методом (ГХ, ВЭЖХ, ГХ/МС, ЖХ/МС),в то время как все отрицательные результаты скрининга принимают какокончательные без какой-либо проверки. Институт распологает комплектомоборудования для количественной ТСХ (фирма КАМАГ, Германия). Тем не менееперспективы дальнейшего использования ТСХ в анализе пестицидов прежде всегоследует связывать с полуколичественным вариантом этого метода. Альтернативыэтому нет.
Каждыйэтап применения пестицидов в мировой сельскохозяйственной практике с конца 40-хгодов прошлого столетия и до настоящего времени может быть охарактеризовансвоими собственными химико-аналитичесчкими проблемами. Однако одна проблема ванализе остатков пестицидов остается неизменной — необходимость постоянногоснижения пределов количественного определения (limit of quantitafication, LOQ)пестицидов. Достижение очень низких пределов количественного определения прииспользовании МВИ сопровождается уменьшением уровня достоверности (надежностиидентификации) результата анализа. Часто для того, чтобы достичь очень низкихпределов количественного определения необходимо использовать сложнуюмногостадийную процедуру очистки и стадию получения производных для того, чтобыможно было использовать высокоселективные и высокочувствительные детекторы(ЭЗД, ТИД). Однако это неизбежно сопровождается потерями анализируемоговещества в ходе этих операций, что приводит к увеличению ошибки анализа. Кромеэтого свой вклад вносит также непостоянство состава анализируемой матрицы отпробы к пробе. В связи с этим химик-аналитик не всегда может удовлетворитьжелание гигиениста и токсиколога иметь МВИ с очень низкими пределами количественногоопределения вследствие технических возможностей используемых приборов иметодических ограничений разрабатываемой МВИ. При разработке МВИ химик-аналитиксвои усилия должен фокусировать не только на достижении низких пределовколичественного определения анализируемых пестицидов, но не упускать из полязрения более важные аспекты анализа остатков пестицидов: надежностьидентификации и воспроизводимость результатов. Известно, что в настоящее времяв Украине в некоторых сельскохозяйственных культурах и продуктах питаниясодержание пестицидов не допускается (так называемые zero tolerances) илинаходится на уровне предела обнаружения (limit of detection, LOD), т. е. любыедетектируемые остатки пестицидов считаются недопустимыми. Для таких случаев первостепенноезначение приобретает надежность идентификации пестицида, а не точноеколичественное определение его содержания, поскольку уже сам факт обнаруженияпестицида является основанием для запрещения использованиясельскохозяйственного сырья или продукта питания. В этих случаях применениеполуколичественного варианта ТСХ является вполне оправданным при условии, чтопри этом достигается надежная идентификация определяемого пестицида.
Понимая,какое важное значение в анализе остатков пестицидов имеют вопросы, связанные сповышением надежности идентификации определяемых соединений, нами былипредприняты систематические исследования по изучению межмолекулярныхвзаимодействий хлор- и азотсодержащих пестицидов в условиях газовой ижидкостной хроматографии. При этом было впервые установлено существованиекорреляционных зависимостей между параметрами удерживания членов гомологическихрядов сорбатов, полученных при использовании хроматографических методов сразличными механизмами сорбции. Эффективность использования таких зависимостейдля повышения надежности идентификации пестицидов была продемонстрирована напримере гомологических рядов хлоралканкарбоновых и хлорфеноксиалканкарбоновыхкислот и их эфиров, хлорфенолов, замещенных фенилмочевин, нитрофенолов и нитрофенольныхсоединений, замещенных бензойных кислот, симм-триазинов, эфиров тиокарбаминовойкислоты. [9]
Глава 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮХЛОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ В ВОДЕ, ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ, КОРМАХ И ТАБАЧНЫХИЗДЕЛИЯХ ХРОМАТОГРАФИЕЙ В ТОНКОМ СЛОЕ
Данная методика апробирована ирекомендована в качестве официальной группой экспертов при Госкомиссии похимическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками приМСХ СССР.
Настоящие Методические указания распространяются на определение содержания ДДТ,ДДЭ, ДДД, гексохлорана, альдрина, кельтана, гептахлора, метоксихлора, дактала,тедиона и эфирсульфоната в воде, почве, вине, овощах, фруктах, грибах, зерне,комбикормах, корнеклубнеплодах и зеленых кормах, рыбе, мясе, мясопродуктах,внутренних органах, молоке и молочных продуктах, животном жире, сливочном ирастительных маслах, жмыхах, шротах, лузге, меде, сахаре, яйцах ияйцепродуктах, а также в табачных изделиях.
Принцип метода. Метод основанна хроматографии хлорсодержащих пестицидов в тонком слое окиси алюминия,силикагеля или пластинок «Силуфол» в различных системах подвижныхрастворителей после экстракции их из исследуемых образцов и очистке экстрактов.Подвижным растворителем служит н-гексан или н-гексан в смеси с ацетоном. Месталокализации препаратов обнаруживают после опрыскивания пластинок растворомаммиаката серебра с последующим ультрафиолетовым облучением или после облученияультрафиолетовым светом пластинок «Силуфол», содержащих о-толидин.
Реактивы и растворы
Ацетон хч, ГОСТ 2603-71
Аммиак водный хч, ГОСТ 3760-64
Алюминия окись 2 ст. активностидля хроматографии, ч, МРТУ 6-09-5296-68. Просеивают через сито 100 меш.
Алюминия окись, пропитаннаясерной кислотой. Две весовые части окиси алюминия (или окиси кремния) помещаютв фарфоровую ступку, заливают одной объемной частью серной кислоты и тщательноперемешивают. Смесь готовят непосредственно перед подготовкой колонок дляочистки экстрактов из проб шротов, жмыха, лузги
Бензол хч, ГОСТ 5955-68
Н-гексан ч, МРТУ 6-09-2937-66
Калий щавелевокислый чда, ГОСТ5868-68
Кальций сернокислый чда, ГОСТ3210-66. Просушивают 6 часов в сушильном шкафу при 160 град. C. Просеиваютчерез сито 100 меш.
Кремния окись для люминофоровч, МРТУ 6-09-4875-67
Натрий сернокислый безводный ч,ГОСТ 4166-66
Натрий углекислый кислый хч,ГОСТ 4201-66, 0,5 н. раствор
Натрий хлористый хч, ГОСТ4233-66, насыщенный раствор
Петролейный эфир (темп. кип. 40- 70 град.)
Перекись водорода хч (30%водный раствор), ГОСТ 10929-64
Проявляющие реактивы:
Проявляющий реактив N 1. 0,5 газотнокислого серебра растворяют в 5 мл дистиллированной воды, прибавляют 7 мламмиака и доводят объем раствора до 100 мл ацетоном; в готовый раствор можнодобавить 0,2 мл перекиси водорода. Раствор следует хранить в колбе с притертойпробкой в темном месте в течение 3-х дней. На пластинку 9 x 12 см расходуется 8- 10 мл раствора. Проявляющий реактив N 2. 0,5 г азотнокислого серебрарастворяют в 5 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл 2-феноксиэтанола идоводят объем раствора до 200 мл ацетоном, затем добавляют 6 капель30-процентной перекиси водорода.
Серебро азотнокислое чда, ГОСТ1277-63
Серная кислота ч, ГОСТ 4204-66
Силикагель АСК (Воскресенскогохимкомбината Московской обл.)
Силикагель КСК, просеянныйчерез сито 100 меш.
Стандартные образцы:
ДДТ, ДДД, ДДЭ, альдрин, изомерыГХЦГ, гептахлор, метоксихлор, кельтан, эфирсульфонат, дактал, тедион хч.
Стандартные растворы: 10 мгсоответствующего пестицида растворяют в мерной колбе на 100 мл в н-гексане идоводят до метки этим растворителем. Стандартные растворы необходимо хранить встеклянной посуде с притертыми пробками в холодильнике.
Стеклянная вата, очищеннаяконц. серной кислотой, промытая дистиллированной водой и высушенная о-Толидинч, МРТУ 6-09-6337-69, 1% раствор в ацетоне2-феноксиэтанол
Этиловый спирт, ректификат, ТУ19-11-39-69
Хлороформ хч, ГОСТ 200-15-74
Четыреххлористый углерод хч,ГОСТ 20228-74
Этиловый эфир (для наркоза),Фармакопея СССР
Натрий сернокислый, 2% водныйраствор
Натрий сернокислый, насыщенныйраствор
2.4. Приборы и посуда
Баня водяная, ТУ 64-1-2850-76
Вакуумно-ротационныйиспаритель, ИР ТУ 25-11-310-69 или прибор для отгонки растворителей, МРТУ25-11-67-67
Воронки химические, диам. 6 см,ГОСТ 86-13-64
Воронки делительные, емкостью100, 250, 500 мл, ГОСТ 10054-75
Воронки Бюхнера, ГОСТ 9147-69
Гомогенизатор или измельчительтканей
Камера для опрыскивания, ТУ25-11-430-70
Камера для хроматографирования,размером 150 x 200, 105 x 165 мм, ГОСТ 10565-63
Колбы Бунзена, ТУ 25-11-135-69
Колбы мерные, емкостью 50, 100мл, ГОСТ 1770-74
Колбы нш, емкостью 100, 250,500 мл, ГОСТ 10394-63
Колбы круглодонные нш, емкостью150, 250, 500 мл, ГОСТ 10394-63
Микропипетки, ГОСТ 1770-74 (длянанесения стандартных растворов)
Пипетки или шприцы длянанесения проб
Пипетки емкостью 1, 5, 10 мл,ГОСТ 1770-74
Прибор для встряхивания, МРТУ2451-64
Пластинки стеклянные 9 x 12, 13x 18 см
Пульверизаторы стеклянные дляопрыскивания пластинок
Сито на 100 меш (диаметротверстий 0,147 мм)
Стеклянные хроматографическиеколонки (диаметр — высота), 20 x 400, 15 x 150
Ртутно-кварцевая лампа
Цилиндры мерные емкостью 25,50, 100, 250, 500 мл, ГОСТ 1770-74
Чашки выпарительные N 3, N 1,ГОСТ 9147-69
Приготовление пластинок дляхроматографии
Тщательно промытую хромовойсмесью, раствором соды, дистиллированной водой и высушенную пластинку протираютэтиловым спиртом или эфиром и
покрывают сорбционной массой.Массу готовят следующим образом:
а) 50 г просеянной через сито100 меш. окиси алюминия смешивают в фарфоровой ступке с 5 г сернокислогокальция, прибавляют 75 мл
дистиллированной воды иперемешивают в ступке или колбе до образования однородной массы. На пластинку 9x 12 см наносят 10 г сорбционной массы (на пластинку 13 x 18 см — 20 г) и,покачивая, равномерно распределяют по всей пластинке. Пластинки сушат прикомнатной температуре 18 — 20 часов, можно сушить их 20 минут при комнатнойтемпературе, а затем 45 минут в сушильном шкафу при температуре 110 град. C.
б) 35 г силикагеля КСК,просеянного через сито 100 меш., смешивают с 2 г сернокислого кальция и 90 млдистиллированной воды и перемешивают в ступке или колбе до однородной массы.Наносят на пластинки и сушат, как указано выше. Порция рассчитана на 10пластинок.
Если пластинки с тонким слоемсиликагеля темнеют после облучения УФ-светом, силикагель перед употреблениемследует очистить от примесей. Для этого силикагель заливают на 18 — 20 часовразбавленной соляной кислотой (1:1), кислоту сливают, промывают силикагельводой и кипятят в круглодонной колбе 2 — 3 часа с разбавленной азотной кислотой(1:1), промывают проточной водопроводной, затем дистиллированной водой донейтральной реакции промывных вод, сушат в сушильном шкафу 4 — 6 часов притемпературе 130 град. Силикагель дробят и просеивают через сито 100 меш.
Пластинки для хроматографии«Силуфол» UV-254 производства ЧССР перед использованием импрегнируюто-толидином. Для этого каждую пластинку опускают на 0,5 см в 0,1% растворо-толидина в ацетоне, налитый в камеру для хроматографирования. После того какфронт растворителя поднимется до верхнего края пластинки, ее вынимают ивысушивают на воздухе, избегая прямого солнечного света. После этого пластинкиготовы к употреблению. Пластинки, импрегнированные о-толидином, хранят вэксикаторе. Используют при анализе кормов.
Пластинки «Силуфол»UV-254 производства ЧССР предварительно промывают дистиллированной водой вхроматографической камере, высушивают на воздухе и непосредственно передиспользованием активизируют в сушильном шкафу при температуре 65 град. в течение4 минут. Подготовка хроматографических колонок для очистки экстрактов
Хроматографическая колонка дляочистки от молочного жира. В нижнюю часть хроматографической колонки (размером20 x 400 мм) помещают стекловату или 500 мг обезжиренной ваты. Затем засыпают вколонку силикагель АСК (75 мл для очистки экстрактов из проб свиного жира и 70мл для всех остальных проб) и уплотняют силикагель постукиванием по колонке.Колонку промывают 50 мл н-гексана или петролейного эфира, и прошедший через неерастворитель отбрасывают. После этого колонка готова для хроматографическойочистки экстрактов из проб рыбы, мяса и мясопродуктов, молока имолокопродуктов, меда, яиц и т.д.
Хроматографическая колонка дляочистки экстрактов из проб шротов (необогащенных липидами) и лузги.
Хроматографическую колонкузаполняют на высоту 1 см стеклянной ватой, затем в колонку вносят просеяннуюокись алюминия (I) слоем 2,5 см или окись кремния — 3,5 см. Далее засыпают, неутрамбовывая, комочки окиси алюминия (кремния), пропитанные серной кислотой,высота слоя (II) 2,5 см. Каждый слой последовательно промывают гексаном (всего20 — 30 мл).
Для анализа жмыхов и шротов,обогащенных липидами, слоиокиси алюминия следует увеличить до 5 см (I) и 3 см(II) соответственно, в случае использования окиси кремния — 6 см (I) и 3 см(II).
Вода, вино. 200 мл пробыпомещают в делительную воронку и экстрагируют пестициды, встряхивая в течение3-х минут н-гексаном или петролейным эфиром тремя порциями по 30 мл илидиэтиловым эфиром тремя порциями по 50 мл. В объединенные экстракты насыпают 10г безводного сернокислого натрия или фильтруют через воронку, заполненную на2/3 сернокислым натрием. Экстракты переносят в прибор для отгонки растворителейи отгоняют растворитель до объема 0,2 — 0,3 мл. В случае необходимости экстрактчистят серной кислотой.
Овощи, фрукты. 20 гизмельченной пробы помещают в колбу с притертой пробкой и проводятэкстрагирование пестицидов трижды в течение 15 минут на аппарате длявстряхивания н-гексаном или петролейным эфиром порциями по 30 мл. Объединенныеэкстракты сушат безводным сернокислым натрием, переносят в прибор для отгонкирастворителей, отгоняют растворитель до объема 0,2 — 0,3 мл и наносят напластинку.
Зерно, грибы. Из измельченныхпроб отбирают 20 г зерна, 50 г сырых или 10 г сухих грибов и помещают в колбы спритертыми пробками. Экстракцию пестицидов проводят трижды на приборе длявстряхивания н-гексаном или петролейным эфиром порциями по 30 мл. Объединенныеэкстракты переносят в делительную воронку, прибавляют 10 мл насыщенного растворабезводного сернокислого натрия в серной кислоте и осторожно встряхиваютнесколько раз. Отделяют органический слой и повторяют обработку до тех пор,пока кислота не станет бесцветной. Экстракт промывают дистиллированной водой,сушат безводным сернокислым натрием и отгоняют растворитель.
Яблоки, капуста, трава, сено.20 г измельченных яблок, 20 г капусты, 40 г травы и 20 г сена заливают 100 млацетона в колбе с притертой пробкой. Встряхивают 2 — 3 минуты, прибавляют 20 млдистиллированной воды и охлаждают на льду 30 минут. Экстракт сливают ифильтруют холодным, экстракцию повторяют. Из объединенных водно-ацетоновыхэкстрактов отгоняют ацетон, а из водного остатка экстрагируют препаратын-гексаном тремя порциями по 10 мл в течение 10 минут. Гексановые экстрактыочищают серной кислотой, насыщенной безводным сернокислым натрием. Сушатбезводным сернокислым натрием. Отгоняют растворитель до небольшого объема инаносят на пластинку. Если очистка неполная (после испарения растворителя наколбе остается белый налет), экстракт испаряют досуха, остаток смываютхолодным ацетоном 3 раза порциями по 0,2 мл и сразу наносят на пластинку.
Комбикорма. Для исследованияберут навеску 40 г, увлажняют ее в колбе 60 мл дистиллированной воды.Увлажненную навеску оставляют на ночь в колбе, закрытой пробкой. Экстракциюпестицидов проводят дважды 50 — 100 мл смеси гексан — ацетон 1:1 привстряхивании в течение 2 часов. Экстракты объединяют в делительной воронке на500 мл, прибавляют дважды по 50 мл дистиллированной воды и, после разделенияслоев, нижний водный слой сливают в другую делительную воронку и экстрагируютпестициды 40 мл гексана. Водный слой сливают. Гексановые экстракты объединяют,фильтруют через воронку с бумажным фильтром, заполненным на 2/3 безводнымсернокислым натрием. Экстракты упаривают на ротационном испарителе до объема 20- 30 мл или досуха, растворяя затем сухой остаток в 20 — 30 мл гексана илипетролейного эфира. Экстракт переносят в делительную воронку и производяточистку серной кислотой, как описано выше.
Шрот, лузга, жмых. Навески: 15г обогащенного липидами шрота или жмыха; 20 г не обогащенного липидами шротаили лузги делят на равные части и помещают в колбы емкостью 100 — 250 мл спритертыми пробками, заливают гексаном (три объема гексана на одну весовуючасть шрота), встряхивают на приборе для встряхивания 30 минут. Экстрактфильтруют через воронку Бюхнера, не перенося осадок на воронку. В колбуповторно заливают указанное количество гексана, встряхивают 30 минут,фильтруют, количественно переносят осадок на воронку Бюхнера с помощью 30 млгексана (3 раза по 10 мл). Полученный экстракт выпаривают до 30 мл наротационном испарителе или в токе воздуха при температуре не выше 40 град.,остаток делят на две равные части и помещают в морозильную камеру холодильникана 1 час (не менее). Каждую часть пропускают через отдельную колонку с окисьюалюминия со скоростью 2 мл/минуту, промывают колбу и колонку 50 мл охлажденнойсмеси этилового эфира с гексаном (15:85). Эту операцию необходимо проводить безперерыва, не оставляя на следующий день. Очищенные экстракты объединяют иупаривают до объема 1 мл. Остаток из колбы переносят количественномикропипеткой с помощью резиновой груши в пробирку на 1 мл, колбу имикропипетку 2 — 3 раза промывают небольшим количеством гексана (всего 0,3 — 0,5 мл), сливая его в ту же пробирку. Затем осторожно выпаривают гексан изпробирки на водяной бане при температуре 50° почти досуха (конечный объемприблизительно 2 — 3 капли). Если общий объем экстракта и промывной жидкостипревышает 1 мл, то сначала выпаривают экстракт, постепенно прибавляя к немупромывную жидкость. При наличии в упаренном экстракте белого мазеобразногоосадка в пробирку добавляют 5 — 6 капель гексана и помещают ее на 15 — 20 минутв морозильную камеру холодильника, затем деканируют дважды таким же количествомгексана и снова упаривают до конечного объема 2 — 3 капли.
Параллельно с исследуемымиобразцами готовят два модельных экстракта. Каждый экстракт получают из одногограмма шрота, не содержащего пестицидов (соотношение сухого вещества ипестицида то же, что и в исследуемых образцах). В один из экстрактов передочисткой на колонках вносят микрошприцем (микропипеткой) определяемые пестицидыв количестве 3 мкг, в другой — 0,75 мкг. Упаренные исследуемые и модельные экстрактыс помощью микропипетки или микрошприца количественно наносят на пластинку,трижды смывая пробирку небольшим количеством гексана.
Рыба, мясо и мясопродукты.Мясо, мясопродукты пропускают через мясорубку. Рыбу очищают от чешуи,внутренних органов и тоже пропускают через мясорубку. 20 г пробы перемешивают сбезводным сернокислым натрием и помещают в колбу с притертой пробкой. Пестицидыэкстрагируют дважды смесью гексан — ацетон или петролейный эфир — ацетон всоотношении 1:1 порциями по 50 мл в течение 1,5 часов при встряхивании.
Экстракт фильтруют черезворонку с бумажным фильтром, заполненным на 2/3 безводным сернокислым натрием,затем растворитель отгоняют, сухой остаток растворяют в 20 мл н-гексана ивносят его в колонку с силикагелем АСК. После впитывания экстракта в сорбентпестицид элюируют 110 мл смеси бензола с гексаном в соотношении 3:8 порциями по25 — 30 мл. Элюат собирают в круглодонную колбу со шлифом емкостью 250 — 300мл. Через 10 минут после впитывания последней порции растворителя сорбентотжимают с помощью груши. Элюат отгоняют до объема 0,1 мл и наносят нахроматографическую пластинку.
В том случае, если пробы мясаили рыбы содержат большое количество жира, после испарения первого экстрагента(смеси ацетона с гексаном) и растворения сухого остатка в гексане следуетпровести очистку гексанового экстракта серной кислотой, а затем колоночнуюочистку, как описано выше.
Животный жир, яйца, яичныйпорошок. Жир измельчают на мясорубке, яичный порошок тщательно перемешивают,яйца — отделяют желток от белка, взвешивают желток и белок, а для анализа беруттолько желток. Конечный результат о содержании хлорорганических пестицидов вяйце приводят на все яйцо. Желток тщательно перемешивают. 25 г подготовленногообразца заливают 50 мл ацетона, перемешивают и нагревают на горячей водянойбане до закипания растворителя. Колбу охлаждают, добавляют в нее 10 млохлажденного 2% раствора сернокислого натрия, перемешивают и охлаждают 45 минутна ледяной бане. Затем сливают ацетоновый слой в круглодонную колбу через слойобезжиренной ваты. Экстракцию ацетоном с последующим вымораживанием жираповторяют еще два раза. Из объединенных экстрактов отгоняют ацетон наротационном испарителе или в приборе для отгонки растворителей (температурабани не более 70 град. +/- 2 град.) и трижды экстрагируют петролейным эфиромпорциями 20, 10 и 10 мл. Продолжительность первой экстракции 1 час, последующих- 15 минут. Петролейный эфир переносят в делительную воронку с 40 мл 2% водногораствора сернокислого натрия, перемешивают содержимое в течение 2-х минут,дают слоям разделиться и водную фазу отбрасывают. Для улучшения разделенияслоев можно добавить несколько мл насыщенного раствора сернокислого натрия.Операцию промывки экстракта повторяют еще два раза, после чего петролейный эфирсливают в стакан с 20 г безводного сернокислого натрия, споласкиваютделительную воронку дважды 5 мл петролейного эфира. Подсушенный экстрактколичественно переносят в мерный цилиндр на 50 мл и доводят объем растворапетролейным эфиром до 30 мл. Далее наносят 30 мл экстракта в колонку ссиликагелем АСК, как указано выше. Для проб свиного жира насыпают 75 млсиликагеля АСК, для всех остальных проб — 70 мл. Очистку экстрактов проводят,как описано для проб мяса. Элюат собирают в круглодонную колбу на 150 мл,растворитель упаривают до объема нескольких капель и наносят нахроматографическую пластинку.
Мед. 30 г меда смешивают с 3 гбезводного сернокислого натрия и трижды экстрагируют пестициды гексаномпорциями по 30 мл каждый раз по 15 минут, тщательно растирая мед стекляннойпалочкой в узком химическом стакане. Экстракты объединяют и отгоняют гексан дообъема 30 мл или до меньшего объема, далее доводя экстракт до 30 мл гексаном.30 мл экстракта вносят в хроматографическую колонку с силикагелем АСК и проводяточистку экстракта и испарение растворителя, как описано выше.
Сахар. Из навески 50 г сахара,предварительно растворенного в воде, пестициды экстрагируют в делительнойворонке на 250 мл н-гексаном. Экстракцию пестицидов проводят трижды по 50, 25 и25 мл растворителя каждый раз встряхивая по 5 минут. Объединенные гексановыеэкстракты очищают от коэкстрактивных веществ (красящие, аминокислоты, липиды)сернокислотным способом.
Молоко и молочные продукты. Дляподготовки проб можно использовать один из приведенных способов.
Первый способ. Сливки, сметана,молоко и др. цельномолочные продукты. Для анализа берут 20 г сливок и сметаны,предварительно разведенных равным объемом дистиллированной воды, 50 мл молока,кефира и т.п., прибавляют концентрированную серную кислоту (30 — 40 мл) дополного почернения пробы. Охлажденный до 10 — 15 град. раствор переносят вделительную воронку и экстрагируют препараты гексаном 2 раза порциями по 25 мл.Для полного извлечения воронку встряхивают 2 минуты, затем оставляют ее на 30минут до полного разделения слоев. Если образуется эмульсия, прибавляют 1 — 2мл этилового спирта. К объединенным экстрактам в делительной воронке прибавляют10 мл концентрированной серной кислоты, насыщенной сернокислым натрием, иосторожно встряхивают несколько раз. Очистку продолжают до получения бесцветнойсерной кислоты.
Творог, сыр. 50 г творога или10 г измельченного на терке сыра заливают 40 мл гексана или петролейного эфира,непрерывно встряхивают 2 — 3 минуты и оставляют на 30 минут. Экстракциюповторяют. Объединенные экстракты в делительной воронке очищают сернойкислотой, как указано выше.
Второй способ. Молоко, кефир,простокваша, кумыс и другие цельномолочные продукты. 25 мл продукта помещают вделительную воронку на 300 мл, приливают по 5 мл щавелевокислого калия инасыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают, приливают 100 мл ацетона,встряхивают 2 минуты. Приливают 100 мл хлороформа и встряхивают 2 мин. Воронкуоставляют до полного разделения слоев. Верхнюю фазу отбрасывают, а нижнюювыливают в круглодонную колбу со шлифом и испаряют растворитель досуха. Остатоксмывают 30 мл гексана.
Сгущенное молоко, 10 — 20%сливки. К 10 г продукта прибавляют 10 мл насыщенного раствора хлористого натрияи выливают в делительную воронку вместимостью 150 мл. К смеси приливают 40 млацетона, встряхивают 2 минуты, приливают 60 мл хлороформа, встряхивают 2 — 3минуты и оставляют до разделения фаз. Далее поступают, как при определениипестицидов в молоке.
Сгущенные молочные продукты. 10г продукта помещают в стаканчик, заливают 10 мл воды с температурой 45 — 50град. C, перемешивают и переносят в делительную воронку на 150 мл, добавляют 5мл щавелевокислого калия. Содержимое воронки перемешивают, приливают 80 млацетона и встряхивают 2 — 3 минуты. Добавляют 100 мл хлороформа и встряхивают 5- 7 минут. После разделения фаз нижнюю фазу сливают в круглодонную колбу,растворители отгоняют, а сухой остаток растворяют в 30 мл петролейного эфира.Сухие молочные продукты. 3 г сухих молочных продуктов (сливок 2 г) высыпают встаканчик, приливают 15 мл дистиллированной воды с температурой 40 — 45 град.C, размешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 300 мл, приливаютпо 5 мл щавелевокислого калия и насыщенного раствора хлористого натрия.Содержимое воронки перемешивают, добавляют 80 мл ацетона и встряхивают 3 — 5минут, приливают 100 мл хлороформа, встряхивают 5 минут и оставляют на 3 — 5минут (до разделения фаз). Нижнюю фазу сливают в круглодонную колбу,растворитель отгоняют, а остаток смывают 30 мл гексана. Сметана, 30 — 40%сливки. 5 г продукта отвешивают в стаканчик, приливают 10 мл насыщенногораствора хлористого натрия и переносят в делительную воронку вместимостью 150мл. Стаканчик обмывают 40 мл ацетона, смывы переносят в делительную воронку,которую встряхивают 2 — 3 минуты, добавляют 70 мл хлороформа и встряхивают 2мин. Воронку оставляют на несколько минут до разделения фаз, нижнюю фазусливают в колбу для отгонки растворителей, растворитель отгоняют, а остатоксмывают 30 мл гексана.
Творог, сыр. 10 г творога илиизмельченного на терке сыра растирают с 10 мл насыщенного раствора хлористогонатрия и переносят в делительную воронку на 250 — 300 мл. Прибавляют 80 млацетона, встряхивают 2 минуты, приливают 100 мл хлороформа и вновь встряхивают.Нижнюю фазу используют для анализа после отгонки растворителей, растворивостаток в 30
мл гексана. Далее проводят очистку экстрактов из проб молока и молочныхпродуктов от молочного жира, подготовленных по второму способу. Для этого 30 млэкстракта наносят в колонку с 70 мл силикагеля АСК. После впитывания экстрактав сорбент пестицид элюируют 110 мл смеси бензола с гексаном в соотношении 3:8порциями по 25 — 30 мл. Элюат собирают в круглодонную колбу на 250 — 300 мл.Через 10 минут после впитывания последней порции растворителя сорбент отжимаютс помощью резиновой груши. После очистки растворители отгоняют под вакуумом.
Сливочное масло. 20 г сливочного масла растапливают на водяной бане вкруглодонной колбе, прибавляют 50 мл ацетона, тщательно перемешивают дорастворения жира, прибавляют 10 мл ледянойдистиллированной воды и охлаждают нальду до затвердевания жира (примерно 30 минут). Сливают ацетоновый экстракт, ипроцедуру повторяют еще 2 раза. Из объединенных экстрактов в круглодонной колбеацетон отгоняют на водяной бане. Пестициды экстрагируют из оставшегося водногоэкстракта гексаном тремя порциями по 10 мл в течение 5 минут. Объединенныегексановые экстракты в делительной воронке обрабатывают серной кислотой ссернокислым натрием. Очищенный экстракт сушат безводным сернокислым натрием иупаривают. Почва. К навескам воздушно-сухой почвы (10 г), помещенным вконические колбы емкостью 250 мл, приливают 10 мл 1-процентного водногораствора хлористого аммония и оставляют на сутки закрытыми. Затем приливаютсмесь 30 мл ацетона и 30 мл гексана и встряхивают колбы в течение часа навстряхивающем устройстве. Содержимое колб переносят в центрифужные пробирки.После центрифугирования жидкую часть сливают в конические колбы, почву спомощью 10 мл 1-процентного раствора хлористого аммония и 30 мл ацетонапереносят в исходные конические колбы, добавляют 30 мл гексана и проводятэкстракцию еще в течение 30 минут. Затем экстракты объединяют. К объединеннымэкстрактам в делительной воронке приливают180 мл дистиллированной воды,осторожно встряхивают в течение 5 — 7 минут, дают жидкостям расслоиться инижний водный слой сливают в коническую колбу. Гексановый слой пропускают черезбезводный сульфат натрия (столовая ложка или 30 — 40 г сульфата натрия). Изводно-ацетонового слоя экстракцию пестицидов проводят еще дважды 15 и 10 млгексана, который затем сушат через тот же сульфат натрия. Гексановые экстрактыобъединяют. Концентрирование экстрактов проводят либо на ротационно-вакуумномиспарителе, либо при температуре бани не более 40 град. C и времени отгонки 9 — 11 минут, либо из колбочек с г-образным отводом при температуре водяной бани 72- 75 град. C.
Очистку сконцентрированныхгексановых экстрактов из проб почв проводят серной кислотой, как описано вышедля других проб, и испаряют растворитель. Табак и табачные изделия. 5 г табакапомещают в стеклянный стакан на 500 мл, заливают 50 мл концентрированной сернойкислоты и стеклянной палочкой тщательно размешивают до полного равномерногообугливания пробы. Спустя 10 — 15 минут в колбу добавляют 25 мл гексана,тщательно размешивают содержимое и прибавляют 20 мл четыреххлористого углерода.Экстракцию пестицидов из пробы проводят в течение 15 минут трижды, после чегоэкстракт последовательно переносят в делительную воронку для однократной илидвукратной дополнительной очистки серной кислотой.
Хроматографирование.
На хроматографическуюпластинку на расстоянии 1,5 см от ее края шприцем или пипеткой наносятисследуемую пробу в одну точку так, чтобы диаметр пятна не превышал 1 см. Остатокэкстракта в колбочке смывают тремя порциями (по 0,2 мл) диэтилового эфира,которые наносят в центр первого пятна. Справа и слева от пробы на расстоянии 2см наносят стандартные растворы, с содержащие 10, 5, 1 мкг исследуемыхпрепаратов (или другие количества, близкие к определяемым концентрациям).
Пластинки с нанесеннымирастворами помещают в камеру для хроматографирования, на дно которой за 30минут до начала хроматографирования наливают подвижный растворитель. Прииспользовании пластинок с тонким слоем окиси алюминия или силикагеля в качествеподвижного растворителя применяют н-гексан или смесь гексана с ацетоном всоотношении 6:1, для препаратов, у которых величина R в гексане ниже 0,3. Прииспользовании f пластинок «Силуфол» подвижный растворитель — 1%раствор ацетона в гексане, а пластинок «Силуфол», импрегнированныхо-толидином, — гексан с диэтиловым эфиром в соотношении 49:1. Край пластинки с нанесеннымирастворами может быть погружен в подвижный растворитель не более чем на 0,5 см.
После того как фронтрастворителя поднимется на 10 см, пластинку вынимают из камеры и оставляют нанесколько минут для испарения растворителя. Далее пластинку орошают проявляющимреактивом и подвергают действию УФ света в течение 10 — 15 минут (лампа ПРК-4).Пластинки следует располагать на расстоянии 20 см от источника света.
При наличии хлорорганическихпестицидов на пластинке появляются пятна серо-черного цвета. При использованиидля анализа пластинок «Силуфол», импрегнированных о-толидином, ихнепосредственно после хроматографирования подвергают УФ-облучению в течениенескольких минут. При наличии хлорорганических пестицидов в этом случаепоявляются пятна сине-голубого цвета. Количественное определение осуществляютсравнением площадей пятен пробы и стандартных растворов. Между количествомпрепарата в пробе, не превышающим 20 мкг, и площадью его пятна на пластинкесуществует прямая пропорциональная зависимость. При большем содержаниипрепарата следует использовать пропорциональную часть исследуемого экстракта.
Глава4. СОВРЕМЕННОН АППАРАТУРНОЕ ОФОРМЛЕНИЕ
СИСТЕМА ДЛЯ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ СДЕНСИТОМЕТРОМ «ДенСкан»
Назначениеи область применения
Системыдля тонкослойной хроматографии и электрофореза с денситометром«ДенСкан» предназначены для качественного и количественного анализасостава проб веществ и материалов в видимой области спектра и ультрафиолетовомсвете при длинах волн 254 и 365 нм.
Областьприменения — исследования в химии, биохимии, биологии, медицине, фармакологии,аналитическом контроле чистых веществ, объектов окружающей среды и др.
Техническиеданные
· Денситометр обеспечивает расчетпараметров и количественную оценку хроматограмм в видимой и ультрафиолетовойобласти спектра ( lmax= 254 нм, lmax =365 нм)
· Размер обрабатываемых пластин,см… не более 15 х 15
· Время ввода изображения, с…… не более 5
· Время обмера хроматограммы, мин… ………5
· Отношение сигнал/шум: видимаяобласть… не менее 5/1
· УФ, 254 нм… не менее5/1
· УФ, 365 нм… не менее 5/1
· Относительное СКО по площадипятен, %
· видимая область…не более 5
· УФ, 254 нм… неболее 5
· УФ, 365 нм… неболее 5
· Размах значений Rf: видимаяобласть… не более 0,02
· УФ, 254 нм… не более 0,02
· УФ, 365 нм…не более 0.02
· Масса осветительной камеры, кг… не более 12 кг
· Габаритные размерыосветительной камеры, мм… не более длина…420
ширина…420
высота…700
· Напряжение питания, В… 220 ± 22/33
· Частота переменного тока, Гц… 50 ± 1
· Средняя наработка на отказденситометра, ч… не менее 5000
Состав денситометра
Денситометр «ДенСкан»состоит из камеры осветительной, черно-белой либо цветной видеокамеры илисканнера, блока ввода изображения, системы обработки данных.
Камера осветительная выполненав виде блочной конструкции, включающей следующие основные узлы:
— источники света:
лампы дневного света
лампы УФ диапазона, длина волны254 нм
лампы УФ диапазона, длина волны365 нм
— набор корректирующихсветофильтров
— детектор — черно-белаямалогабаритная видеокамера OS-45D или аналогичная с чувствительностью не хуже0,02 люкс, с ручной фокусировкой и ручной регулировкой диафрагмы либо цветнойсканнер с разрешением от 200 d.p.i. и выше с интерфейсом, соответствующим TWAINстандарту
— установочный столик дляпластин
— канал связи с блоком вводаизображения
Система обработки данных сиспользованием персонального компьютера и программного обеспечения«Dens». Минимальные требования к компьютеру:
— Операционная система — Microsoft Windows 95, Windows 98, Windows NT (версия 4.0 или выше)
— Процессор — Pentium 100 MHz
— Оперативная память (RAM) — 8Мбайт, рекомендуется 16 Мбайт
— Цветной монитор — сдиагональю не менее 14 дюймов
— Место на жестком диске — 10Мбайт
— Манипулятор — «мышь»
Блок ввода изображениявидеобластер AverMedia (и программное обеспечение к нему) используется дляполучения изображения хроматограммы на мониторе компьютера. Возможноиспользование аналогичных систем.
Пластины и листы длятонкослойной хроматографии (TLC) Код Описание S0002020 стеклянные пластины для TLC: SIL G-25, 20×20 см., 25 шт. S0UV2020 стеклянные пластины для TLC: SIL G-25 UV 254, 20×20 см., 25 шт. SP002020 листы из полиэстера: SIL G, 20×20 см., 25 шт. SPUV2020 листы из полиэстера: SIL G/UV 254, 20×20 см., 25 шт. SA002020 алюминиевые листы: SIL G, 20×20 см., 25 шт. SAUV2020 алюминиевые листы: SIL G/UV 254, 20×20 см., 25 шт.
/>
Шприц для хроматографииМШ-50 (М-50) (шток из нержавеющей стали, с противооткатной муфтой) Шприц для хроматографииМ-1Н (МШ-1), М-5Н (с направляющей)
Шприц для хроматографии МШ-10(М-10Н), МШ-50 (М-50Н) (шток из нержавеющей стали, с направляющей)
Шприц для хроматографииМШ-10М (М-10) (шток из нержавеющей стали, с противооткатной муфтой)[10]
Литература
1. КирхнерЮ. Тонкослойная хроматография. М.: Мир, 1981.
2. Хроматографияв тонких слоях / Под ред. Э. Шталя. М.: Мир, 1965.
3. ЕвгеньевМ.И., Евгеньева И.И., Москва Н.А., Левинсон Ф.С. 5-Хлор-4,6-динитробензофуразанкак реагент в тонкослойной хроматографии ароматических аминов // Завод. лаб.1992. Т. 58, № 4. С. 11-13.
4. НазаркинаС.Г. Определение полиароматических углеводородов в объектах окружающей средыметодами жидкостной и тонкослойной хроматографии.
5. СоголовскийБ.М. Денситометр «Сорбфил» для количественной ТСХ
6. Руководство по химическомуанализу поверхностных вод суши (под редакцией А.Д. Семенова) // Л.:Гидрометеоиздат. — 1977. — 540 с.
7. Унифицированные методы анализавод. Под редакцией Ю.Ю. Лурье // М.: Химия. — 1973. — 376 с.
8. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химияпромышленных и сточных вод. // М.: Химия. — 1984. — 447 с.9. В.Д. Чмиль Состояние и перспективы использования современныхинструментальных методов анализа пестицидов в Украине
10. www.izme.ru/