«Кинетическиеметоды определения загрязнителей в различных природных средах»
Содержание
Введение
Глава 1.Сущностькинетических (ферментативных) методов анализа
Глава 2. Некоторыеосновные сведения о ферментах
2. 1.Возможности ферментативных методов анализа
2. 2.Определение органических соединений
2. 3.Определение неорганических соединений
Глава 3. Примерыиспользования кинетических методов в анализе объектов
Глава 4. Оборудованиедля кинетических методов
Литература
ВВЕДЕНИЕ
Дляконтроля примесей в объектах пищевой, микробиологической и фармацевтическойпромышленности, в мониторинге окружающей среды, для решения некоторыхмедицинских и биохимических задач в последние годы все шире применяютферментативные методы анализа, основанные на использовании зависимости скоростикатализируемой ферментом химической реакции от концентрации реагирующих веществи фермента. Использование биологических катализаторов, отличающихся высокойактивностью и избирательностью действия, позволяет значительно повыситьчувствительность и селективность методов анализа. Эти качества в сочетании спростотой аппаратурного оформления и методики эксперимента, экспрессностьюобосновывают широкое внедрение ферментативных методов в практику клинических,агрохимических, заводских лабораторий, научно-исследовательских институтов,природоохранных служб.
Ферментативнымиметодами можно определять сами ферменты, их субстраты (то есть соединения,превращение которых катализируют ферменты), а также соединения, воздействующиена каталитическую активность ферментов, — их эффекторы, активаторы илиингибиторы (то есть вещества, которые либо повышают, либо понижают активностьфермента).
ГЛАВА1. СУЩНОСТЬ КИНЕТИЧЕСКИХ (ФЕРМЕНТАТИВНЫХ) МЕТОДОВ АНАЛИЗА
Кинетические методы основаны наиспользовании зависимости скорости химической реакции от концентрацииреагирующих веществ, а в случае каталитических реакций и от концентрациикатализатора:
/>, (1)
где v — скорость; K — константаскорости каталитической реакции; сА, сВ и скат— концентрации реагирующих веществ и катализатора; m, n и р — показателистепени при концентрациях реагентов и катализатора (обычно р = 1).
Аналитическим сигналом вкинетических методах является скорость процесса или пропорциональная ейвеличина.
Реакцию, скорость которойизмеряется, называют индикаторной, а вещество, по изменению концентрациикоторого судят о скорости процесса — индикаторным веществом.
Индикаторные реакции могут бытьоснованы на катализе окислительно-восстановительных реакций, реакций замещенияв координационной сфере ионов металлов, реакций гидролиза и декарбоксилированияорганических соединений. Наиболее чувствительны и сравнительно просто выполнимыокислительно-восстановительные каталитические реакции. Они чаще всегоиспользуются в анализе неорганических веществ.
Кроме каталитических реакций вкинетических методах используют и некаталитические реакцииокисления-восстановления, разложения, осаждения.
К индикаторной реакциипредъявляют ряд требований:
· концентрация определяемогокомпонента за время наблюдения практически не должна меняться. Катализатор входе реакции не расходуется. Если же определяемым является одно из реагирующихвеществ (некаталитический вариант метода), то с достаточной точностью его можноопределять в тот начальный период, когда его концентрация изменяется не болеечем на 5%;
· необходимо наличие быстрого,простого и доступного метода наблюдения за скоростью индикаторной реакции, т.е. за изменением концентрации индикаторного вещества во времени.
· скорость индикаторной реакциидолжна находиться в определенных пределах. Оптимальное время наблюдения заскоростью индикаторной реакции 5–15 мин. Однако с развитием методовизучения быстрых процессов все чаще используют реакции, протекающие с большойскоростью.
Существуют два вариантакинетических методов:
В каталитическом вариантекинетического метода (каталитическом методе, каталиметрии) определяемыйкомпонент или связанные с ним соединения являются катализатором индикаторнойреакции.
В некаталитическом вариантекинетического метода определяемым компонентом является одно из реагирующихвеществ в некаталитической или каталитической индикаторной реакции.
Каталитические методыотличаются от других химических методов анализа высокой чувствительностью, анекаталитический вариант кинетических методов – высокой селективностью.
Возможны различные способыопределения неизвестной концентрации вещества по данным кинетических измерений.Если индикаторным веществом является продукт реакции, и его текущуюконцентрацию обозначить через х, то скорость реакции можно выразить как
/>(2)
На начальной стадии реакцииконцентрации определяемого вещества В и реагента А могут практически неизменяться за время наблюдения за скоростью процесса. Тогда, проинтегрировавуравнение (2), получим
/>(3)
т. е. наблюдается линейнаязависимость между концентрацией индикаторного вещества и временем. Кинетическийметод, основанный на использовании этого уравнения, называют дифференциальным.
Если концентрация хотя быодного из реагирующих веществ за время наблюдения за скоростью реакции заметноменяется (более чем на 10%), то между концентрацией индикаторного вещества ивременем существует более сложная (например, логарифмическая, обратная ит. д.) зависимость. Такой кинетический метод называют интегральным. Винтегральном варианте часто применяют построение зависимостей концентрациииндикаторного вещества от времени в полулогарифмических, обратных или другихкоординатах, т. к. для расчета неизвестной концентрации определяемогокомпонента удобнее использовать прямоугольные участки кинетических кривых.Характер кинетических кривых, а следовательно, и использованиедифференциального или интегрального вариантов кинетических методов анализаопределяется типом индикаторной реакции, ее механизмом.
В настоящее время наиболеераспространенными являются три основных способа определения неизвестнойконцентрации по данным кинетических измерений. Это способы тангенсов,фиксированного времени, фиксированной концентрации. Рассмотрим их применительнок дифференциальному варианту кинетического метода анализа.
Способ тангенсов основан наопределении тангенса угла наклона кинетических кривых tg при известныхконцентрациях определяемого вещества. При этом tg характеризуетскорость индикаторной реакции и зависит от концентрации определяемого вещества.Градуировочный график строят в координатах: концентрация определяемогосоединения — tg (рис. 1, а).
Способ фиксированного времени.При определенном, строго фиксированном интервале времени протекания реакции,измеряют концентрацию индикаторного вещества в пробах с известнымиконцентрациями определяемого компонента. Градуировочный график строят вкоординатах концентрация определяемого вещества — концентрация индикаторноговещества при фиксированном времени протекания реакции tфикс. (рис. 1,б). Часто при работе этим методом индикаторную реакцию останавливают при tфикс…Путем резкого охлаждения, изменения кислотности раствора, добавленияингибиторов.
Способ фиксированнойконцентрации. В отдельных пробах с известными концентрациями определяемоговещества проводят индикаторную реакцию до строго определенной (фиксированной)концентрации индикаторного вещества хфикс. и измеряют времядостижения этой концентрации. Градуировочный график строят в координатах:концентрация определяемого компонента — величина, обратная времени достижения хфикс.(рис.1, в).
В интегральном варианте всеспособы определения неизвестной концентрации аналогичны, лишь между временемреакции и концентрацией индикаторного вещества существует более сложнаяфункциональная зависимость. В этом случае находят функции концентрациииндикаторного вещества, линейно изменяющиеся во времени (логарифмическая,обратная и т. д.).
/>
Рис. 1. Способы определениянеизвестной концентрации по данным кинетических измерений:
а — тангенсов; б —фиксированного времени;
в — фиксированной концентрации(х — концентрации индикаторного вещества, t — время, с3 > c2> c1 — концентрации определяемого соединения
В)
Каталиметрическое титрование —процесс титрования в присутствии катализатора, в котором точку конца титрованияопределяют по резкому увеличению или уменьшению скорости реакции.
С целью автоматизациикаталиметрического метода анализа скорость реакции часто измеряют в открытыхсистемах. Открытой называют систему, в которую по мере протекания реакциивводят реагенты и/или из которой отводят продукты реакции. В ходе реакциирастворы подаются в реакционную камеру с постоянной или регулируемой скоростью.Разработаны разные варианты открытых систем: на основе проточных методов и«стат»-методов.
Проточные методы. К нимотносится метод непрерывной струи, основанный на смешении реагентов в струе ипредложенный для быстро протекающих реакций с периодом полупревращения t1/2= 0,01–10 с. Другой вариант проточного метода применяют для измерения скоростейсравнительно медленно протекающих реакций с t1/2 = 1–10 мин. В этомслучае проточная ячейка одновременно является и смесительной камерой. Исходныереагенты индикаторной реакции и анализируемый раствор, содержащий катализатор сконцентрацией скат, непрерывно подаются насосами в смесительнуюкамеру вместимостью около 10 мл, продукты реакции и реагенты вытекают соскоростью 2–20 мл/мин. При каждом значении скат устанавливаетсяпостоянная концентрация индикаторного вещества и фиксируется постоянный сигнал,соответствующий скат. Смена раствора в кювете происходит за 1–2 мин,что определяет производительность анализатора 30 проб в час.
Стат-метод предполагает введениереагентов со скоростью, равной скорости их расходования в реакции, так чтоконцентрация индикаторного вещества остается постоянной. Скорость введенияреагента регулируется автоматически.
Воспроизводимость результатовкинетических измерений повышается при использовании метода одновременногокомпарирования. В анализируемый раствор и растворы шкалы стандартоводновременно с помощью стартовой пипетки вводят реагент, инициирующийпротекание каталитической реакции. Через определенный промежуток времени сравниваютаналитические сигналы анализируемого раствора и шкалы стандартов и оцениваютсодержание определяемого вещества. Метод не требует термостатирования.
Для учета влияния примесей наскорость реакции применяют метод добавок. Скорость реакции измеряют в равныхаликвотных частях анализируемого раствора без добавки и в присутствииопределенных добавок катализатора. Метод добавок дает правильные результаты,если в растворе отсутствуют посторонние примеси, обладающие каталитическимдействием на индикаторную реакцию.
Скорость реакции можноопределять по времени внезапного появления окраски раствора в реакцияхЛандольта. Реакции Ландольта — это медленные химические реакции, в которыхобразование окрашенного продукта реакции задерживается подходящим реагентом,специально добавленным для этой цели. Например, при окислении бромидаперсульфатом, катализируемом ионами меди(II), образующийся бром окисляетаскорбиновую кислоту и не взаимодействует с индикаторомN,N-диметил-п-фенилендиамином. Когда практически вся аскорбиновая кислотаокислится, появляется окраска индикатора. Метод, основанный на эффектеЛандольта, в ряде случаев обеспечивает более высокую воспроизводимостьрезультатов анализа, чем обычный метод фиксированной концентрации,разновидностью которого он является.
Концентрацию катализатора можноопределять по длительности индукционного периода tинд., по истечениикоторого скорость реакции становится заметной (рис. 2). Этот способ являетсяразновидностью метода фиксированной концентрации. Индукционный период наблюдаетсяне только в реакциях Ландольта, но и в автокаталитических реакциях, а также вреакциях, когда в начальный период изменяется соотношение форм катализатора.Длительность индукционного периода связана с концентрацией катализаторазависимостью
/> или />.
/>
Рис. 2. Кинетические кривыеокисления KI (2 10–4 М) пероксидом водорода (2,4 * 10–3М), катализируемого Ti(IV), в присутствии крахмала
За изменением концентрациииндикаторного вещества во времени можно наблюдать любым методом, и припостроении кинетических кривых вместо концентрации образующегося продуктаиспользовать любую, пропорциональную ей величину — оптическую плотность, силутока, потенциал системы и т. д. Чаще всего для наблюдения за скоростьюиндикаторной реакции используют спектрофотометрические и люминесцентные, реже —электрохимические, термометрические и титриметрические методы.
Некаталитические методы неотличаются высокой чувствительностью (она определяется, как правило, методомнаблюдения за скоростью индикаторного процесса), но они селективны, частопозволяют определять в смеси близкие по свойствам вещества без ихпредварительного разделения. Эти методы применяют при анализе смесейорганических соединений (спиртов, сахаров, аминов) и смесей таких близких посвойствам ионов металлов, как щелочно-земельные и редкоземельные элементы.
Каталитические методы анализаотличаются высокой чувствительностью, которая для многих неорганических веществсравнима с чувствительностью масс-спектральных и активационных методов анализа,а для органических — с наиболее чувствительными вариантами хроматографии. Вотдельных случаях, например, для серебра, хрома, кобальта, каталитическиеметоды — наиболее чувствительные из всех известных методов анализа. Приэтом преимуществом каталитических методов является сочетание высокойчувствительности с простотой аппаратурного оформления и методики проведенияанализа.
Среди каталитических методоввысокую чувствительность и селективность имеют ферментативные методы,основанные на использовании реакций, катализируемых ферментами. Ферментативнымиметодами определяют субстраты, сами ферменты и эффекторы ферментов (соединения,мешающие активности ферментов). Методы определения субстратов — веществ, накоторые действуют ферменты — высокоселективны и даже специфичны, что позволяетопределять субстраты непосредственно в матрице сложных объектов (кровь,биомассы и биожидкости, многокомпонентные технологические растворы).Чувствительность определения при этом обусловлена методом, выбранным дляконтроля за скоростью процессов. Часто в этих случаях используют ферментныеэлектроды. Методы определения эффекторов ферментов высокочувствительны, но невсегда селективны.
В кинетических методах наиболеечасто используют метод тангенсов как наиболее точный (использует большое числоэкспериментальных данных) и универсальный (применим для реакций с индукционнымпериодом). Реже применяют способ фиксированного времени и способ фиксированнойконцентрации, хотя эти способы более просты и менее трудоемки. Способфиксированной концентрации используют обычно при автоматизации контроля, способфиксированного времени — при проведении серийных анализов.
Метод каталиметрическоготитрования применяют для определения с повышенной точностью микросодержанияионов металлов или органических соединений, образующих с ионом металлаустойчивые, каталитически неактивные комплексы, и следов органических веществ внеорганических солях особой чистоты. При титровании органического соединенияизбыток титранта (иона металла-катализатора) уже в концентрации 10–8–10–6М вызовет протекание каталитической реакции и тем самым определит конечнуюточку титрования .
Основное применениекаталитических методов в анализе реактивов и веществ особой чистоты —определение микроконцентраций переходных металлов. Именно каталитические методыпозволяют определить ионы элементов, содержание которых часто лимитируется втехнических условиях на вещества особой чистоты табл. 1.
Чистота цитирования примесей* ввеществах особой чистоты [16] и пределы обнаружения их каталиметрическимиметодамиПримесь Чистота цитирования, % Предел обнаружения, нг/мл Примесь Чистота цитирования, % Предел обнаружения**, нг/мл Fe 100 1 Ag 31 1 Cu 96 1 Pb 31 10 Ni 66 1 Ti 26 1 Mn 76 0,1 V 21 0,1 Co 70 0,1 Mo 8 1 Cr 41 1 W 7 5
Чаще всего лимитируетсясодержание железа и меди (допустимый уровень — 10–4–10–6%).Другие примеси определяют реже, но для некоторых веществ необходим контроль ихсодержания на уровне 10–7%, который не обеспечивается традиционными методамиэмиссионной спектроскопии и спектрофотометрии. Особенно успешно каталитическиеметоды применяются для определения Co, Mn, V, Mo, W, Nb, Ta. Кроме того, прианализе веществ особой чистоты каталитические методы позволяют определятьотдельные анионы, органические соединения в неорганических солях, отклонения отстехиометрии в составе соединений.
Нижняя граница концентраций,определяемых с применением каталитических методов, для большинства элементовсоставляет 10–8–10–9 М (10–3–10–4мкг/мл), т. е. на 1–2 порядка ниже, чем в методах спектрофотометрии,полярографии и пламенного варианта атомной абсорбции.
Скорость конкретнойиндикаторной реакции зависит от многих параметров: температуры, ионной силыраствора, концентрации мешающих компонентов, наличия ингибиторов и активаторов.Все эти параметры в кинетических методах анализа необходимо строгоконтрфолировать и поддерживать постоянными для получения надежной аналитическойинформации.
Каталитическая реакция являетсярезультатом протекания ряда элементарных процессов, поэтому влияние температурына скорость процесса не всегда легко интерпретировать. Для практической оценкивлияния температуры на скорость реакции используют температурный коэффициент />, которыйпоказывает, во сколько раз увеличивается скорость реакции при возрастаниитемпературы на 10 К:
/>,
Кинетическим определениям могутмешать посторонние ионы и соединения:
· обладающие каталитической активностью;
· снижающие скоростькаталитической реакции или изменяющие направление ее отдельных стадий. Мешающеевлияние оказывают окислители и восстановители, взаимодействующие с реагентамииндикаторной реакции и катализатором: Mn(VII), Cr(VI), I2, />, />, HS;анионы и соединения, образующие с катализатором каталитически неактивныекомплексы — F, />, NH3, />, ЭДТА; ионы переходныхметаллов, проявляющие каталитическую активность — Fe, Cu, Mn, Ti, Co; ионыметаллов, образующие комплексы с реагентами и продуктами реакции — Al, Bi, Zr,Ti, TR и др.; ингибиторы и активаторы — в основном органические вещества,взаимодействующие с промежуточными продуктами реакции или с катализатором —оксалаты, фенолы, нафтолы, амины, а также инертные электролиты (например,нитраты и перхлораты щелочных металлов) и вещества, обладающие буфернымдействием.
Избирательность индикаторныхреакций характеризуется максимально допустимым содержанием посторонних ионов,при которых относительная погрешность определения анализируемого вещества непревышает заданного значения, например, 0,1.
Кислотность раствора влияет наизбирательность определения, если в лимитирующей стадии индикаторной реакцииучаствует ион водорода, а также в случае образования в результате гидролиза приразных значениях рН гидроксокомплексов, обладающих различной каталитическойактивностью. Так, каталитически активные комплексы Ti образуются при рН = 3,8,а максимальное содержание каталитически активных />и />наблюдается при рН = 1,1 иpH = 2,2, соответственно.
Для устранения мешающеговлияния посторонних компонентов применяют традиционные для аналитической химииприемы отделения или маскирования мешающих примесей.
Кинетические методы (в томчисле и ферментативные) при условии строгого соблюдения условий проведенияанализа не уступают другим методам по точности, достаточно экспрессны, легкоподдаются автоматизации. В практике аналитической химии эти методы применяют:
· при анализе смесей близких посвойствам органических соединений (некаталитический вариант);
· при определении микроколичествионов 3d-элементов, группы платиновых металлов, ряда анионов (I, Cl, Br ) и органических веществ в природных и промышленных объектах;
· при определении присутствиятоксичных и лекарственных препаратов, физиологически активных соединений в биологическихобъектах и объектах окружающей среды (ферментативные методы).
ГЛАВА 2. НЕКОТОРЫЕОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ О ФЕРМЕНТАХ
Ферменты- биологические катализаторы белковой природы, ускоряющие химические реакции вживых организмах и вне их. Ферменты обладают уникальными свойствами, которыевыделяют их на фоне обычных органических катализаторов гомогенного типа. Преждевсего это необычайно высокая каталитическая активность. Так, добавканезначительной концентрации фермента (10- 9-10- 7 М) ускоряет превращениесубстрата в 108-1012 раз. Другое, не менее важное свойство ферментов — специфичность (избирательность) их действия в отношении структуры субстрата,типа реакции и условий ее проведения. Специфичность определяется способностьюфермента превращать только данный тип субстратов в определенных реакциях иусловиях. Эти свойства ферментов обусловлены сложной структурой макромолекулбелка и весьма сложным механизмом их действия.
Превращениесубстрата происходит на активном центре фермента. Для многих ферментов, состоящихиз субъединиц, характерно наличие регуляторного участка, которыйвзаимодействует с веществами, влияющими на активность фермента, — активаторами,ингибиторами или инактиваторами (рис. 4).
Важнымсвойством ферментов, которое необходимо учитывать при их практическомиспользовании, является стабильность, то есть способность сохранятькаталитическую активность. При хранении и особенно в ходе ферментативнойреакции фермент может частично или полностью терять свою каталитическуюактивность, другими словами, инактивироваться. Одним из эффективных способовстабилизации ферментов является их иммобилизация — перевод в водонерастворимоесостояние путем связывания с носителем или модифицирование водорастворимымиполимерами с полным или частичным сохранением ферментами каталитическойактивности. Повышение стабильности и возможность многократного использованияиммобилизованных ферментов значительно повышают экономичность ферментативныхметодов анализа.
2.1. Возможности ферментативных методов анализа
Пределыобнаружения веществ, определяемых ферментативными методами (субстратов,активаторов, обратимых и необратимых ингибиторов и инактиваторов ферментов)зависят не только от каталитической активности фермента, но и от другихкинетических характеристик используемой индикаторной реакции. Ферменткатализирует реакции, в которых участвуют, как правило, один или два субстрата.Простейшая односубстратная реакция описывается обычно схемой Михаэлиса-Ментен
E+ S ES P + E,
гдеЕ — фермент, S — субстрат, ES — промежуточный комплекс фермента с субстратом(комплекс Михаэлиса-Ментен), Р — продукт. Концентрация субстрата [S]0 будетпропорциональна u0 только при условии, когда [S]0! Km. Тогда
[S]0= u0Km / kкат[E]
Следовательно,верхняя граница определяемых концентраций субстрата ограничена величинойконстанты Михаэлиса-Ментен (Km). Нижняя граница определяемых концентрацийсубстрата определяется той величиной u0, которая может быть зафиксирована спомощью используемого для наблюдения инструментального метода, причем величинаu0 тем выше для одного и того же значения [S]0, чем выше kкат и [E]. Такимобразом, использование высокоактивного фермента (большое значение kкат) иповышение его концентрации в реакционной смеси могут существенно снизить пределобнаружения субстрата.
Несколькодругие кинетические закономерности следует учитывать при определении техвеществ, которые являются эффекторами ферментов.
Дляконтроля начальной скорости ферментативного процесса или концентрации продуктареакции могут быть использованы практически любые доступные исследователюфизико-химические методы. Наиболее часто применяют фотометрические методыиндикации. При этом в качестве индикаторных часто используют, например,катализируемые пероксидазой и другими оксидазами (ферментами, катализирующимиокислительно-восстановительные реакции), а также гидролазами (катализирующимиреакции гидролиза) реакции образования окрашенных продуктов. Исключительновысокой чувствительностью отличаются хемилюминесцентные методы, позволяющиеконтролировать скорость ферментативных реакций с участием, например,люциферазы. Различные электрохимические методы (потенциометрия, амперометрия)наиболее удобны для контроля скорости реакций, протекающих с поглощением иливыделением протонов, а также окислительно-восстановительных процессов,сопровождающихся поглощением кислорода, образованием Н/>О/>и т.д. Ферментные электроды, вкоторых фермент механически или ковалентно включают в полупроницаемуюполимерную мембрану, покрывающую электрод, позволяют специфически определятьразличные органические и неорганические соединения без введения в анализируемыйраствор дополнительных реагентов.
Кнастоящему времени разработано большое число высокочувствительных и селективныхферментативных методов определения субстратов и эффекторов ферментов:неорганических (ионов металлов, анионов) и органических (N-, S-, P-,O-содержащих) соединений. При этом можно выделить ферменты, позволяющиеопределять целый класс соединений, либо часть этого класса, либо индивидуальноесоединение. Так, с помощью алкогольдегидрогеназы можно определять спирты(субстраты этого фермента), алкогольоксидазы — первичные спирты,арилалкогольоксидазы — ароматические первичные спирты. Следует отметить, чтометоды определения эффекторов, хотя и менее селективны, часто болеечувствительны, чем методы определения субстратов. Так, пределы обнаружениямногих органических веществ — субстратов ферментов лежат в интервале 10- 6-10-4 М, а органических эффекторов — 10-11-10- 8 М. Кроме того, число эффекторовферментов значительно больше, чем число их субстратов, что расширяетвозможности ферментативных методов анализа.
2.2. Определение органических соединений
Ферментативныеметоды определения органических соединений успешно разрабатываются иприменяются в клинических и биохимических лабораториях. Именно применениеферментов дает возможность селективно определять в крови, моче, тканях и другихбиологических объектах малые количества таких метаболитов и физиологическиактивных веществ, как мочевина, мочевая кислота, аминокислоты, сахара (вчастности, глюкоза), спирты, липиды, холестерин, нуклеотиды, антибиотики.
Ферментативноеопределение мочевины основано на реакции ее гидролиза, катализируемой ферментомуреазой. Образующиеся продукты гидролиза — ионы и можно определятьэлектрохимически, фотометрически или флуориметрически. Групповое определениеаминокислот основано на использовании таких ферментов, как L-амино- илиD-аминооксидаза, которые катализируют окисление аминокислоты кислородом воздухадо кетокислоты, пероксида водорода и аммиака. Последний далее определяютэлектрохимически с помощью NH3-чувствительного газового электрода.Специфическое определение отдельных аминокислот возможно при применениидекарбоксилаз, дегидрогеназ, лиаз, трансфераз. Для определения глюкозыиспользуют несколько специфических ферментативных реакций, например: 1)катализируемое глюкозооксидазой окисление ее кислородом воздуха (или другимиокислителями) до глюконовой кислоты и пероксида водорода; 2) ее взаимодействиес АТФ с образованием глюкозо-6-фосфата в присутствии гексокиназы. Прииспользовании первой реакции определение глюкозы проводят либо наблюдая зауменьшением количества кислорода в растворе с помощью О2-чувствительногоэлектрода Кларка, либо измеряя рН раствора, который изменяется вследствиеобразования глюконовой кислоты, либо определяя количество образовавшегосяпероксида водорода. Ферментативные методы определения сахарозы и другихдисахаридов основаны на использовании специфических ферментов (инвертазы,лактазы), превращающих дисахариды в моносахариды, одним из которых являетсяглюкоза. Далее глюкозу определяют с помощью описанного выше метода.Ферментативное определение этанола основано на использовании одного из двухферментов: алкогольоксидазы, катализирующей окисление этанола кислородомвоздуха до ацетальдегида и Н2О2, или алкогольдегидрогеназы, в присутствиикоторой спирт в реакции с НАД (никотинамидадениндинуклеотидом) превращается вНАД " Н2 .
Определениеразличных токсичных соединений, таких, как фенолы, ароматические амины,фосфор-, сероорганические соединения, является важной задачей аналитическойхимии и в первую очередь связано с проблемами контроля и охраны окружающейсреды.
Некоторыетоксичные соединения являются субстратами специфических ферментов, чтопозволяет значительно упростить подготовку проб сложных по составу объектованализа. Например, определять мочевину в воде плавательных бассейнов, почвепозволяет использование уреазы, для которой мочевина являетсявысокоспецифическим субстратом.
Однаков большинстве предложенных методов для определения токсичных соединенийиспользуют их ингибирующее действие на ферменты. Например, фосфорсодержащиепестициды определяют по ингибированию холинэстеразы или карбоксилэстеразы;серосодержащие ингибиторы, различные фенолы — с помощью пероксидазы; поингибированию свечения бактериальной люциферазы определяют инсектициды: ДДТ,пентахлорфенол. Для определения фунгицидов и инсектицидов в плодах, ягодах,листьях применяют папаин, ацетилхолинэстеразу.
2.3. Определение неорганических соединений
Ферментативныеметоды успешно применяют для чувствительного и селективного определения ионовметаллов, неорганических анионов, пероксида водорода, кислорода, растворенногов воде. Многие ионы металлов (например, Ag, Cu, Hg, Zn, Bi, Cd) можноопределять с применением ферментов в количествах, недоступных определению спомощью большинства физико-химических методов анализа. Так, с применениемщелочной фосфатазы разработан метод определения нанограммовых количествбериллия. По ингибирующему действию на алкогольдегидрогеназу возможно определятьионы серебра в концентрации 10 пг/мл. Предложенные методы определения ртути поингибирующему действию на пероксидазу и уреазу являются одними из самыхчувствительных методов. Важно отметить, что приведенные методы являются нетолько высокочувствительными, но и селективными. Обычно же методы, основанныена ингибирующем или активирующем действии ионов металлов на фермент, неотличаются высокой селективностью. Однако избирательность методов можноповысить при использовании обычных для аналитической химии приемовмаскирования.
Наиболеечувствительными и селективными являются ферментативные методы определения ионовметаллов по реактивации апофермента (белковой части фермента). Так, дляопределения цинка и кальция использована реактивация апофермента, полученногоудалением ионов цинка из щелочной фосфатазы. Чувствительный и селективный методопределения меди основан на реактивации апофермента, полученного диализомиммобилизованной полифенолоксидазы.
Дляопределения анионов, таких, как CN-, чаще всего используют ферментныеэлектроды, позволяющие проводить экспрессный анализ сложных промышленных ибиологических объектов. Как правило, в ферментных электродах применяютиммобилизованные ферменты. Чаще всего анионы являются субстратами в техферментативных реакциях, которые положены в основу методов их определения.Пределы обнаружения анионов при использовании ферментных электродов обычно выше10 мкМ. Следует особо выделить высокочувствительные методы определения такихфизиологически активных анионов, как CN-, I-, S2 -, F -, основанные на ихреактивирующем действии на инвертазу, ингибированную ртутью или серебром (спределами обнаружения 0,2-10 нг/мл), а также на ингибирующем действии напероксидазу и кислую фосфатазу.
Определениедругих неорганических соединений — аммиака, кислорода, диоксида серы, пероксидаводорода основано на том, что они являются субстратами многих ферментов и,следовательно, могут быть определены с их помощью.
Расширениюприменения ферментов в аналитической химии способствуют дальнейшее развитие энзимологии,разработка новых способов стабилизации ферментов, выделение и исследованиеновых ферментов.
ГЛАВА3. ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КИНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В АНАЛИЗЕ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙСРЕДЫ
Исследование влияниянеблагородных металлов на кинетическое определение родия
Развитие аналитической химиималых содержаний платиновых металлов может быть связано с совершенствованиемкинетических методов их анализа. Родий — один из элементов группы платиновыхметаллов, число индикаторных реакций для определения которого кинетическимметодом невелико. Наиболее избирательной и чувствительной (2 10-4мкг/мл Rh) является реакция окисления меди (II) периодат-ионом с образованиемокрашенного периодатного комплекса меди (III) в щелочной среде (pH=8,3 — 8,5, =400 нм), которая лежит в основе кинетического определения родия методомтангенсов. Определению родия не мешают 20-кратный избыток платины, палладия,иридия и золота, что вполне устраивает аналитиков, если речь идет об анализетехнологических растворов. Однако, такие растворы содержат большие количестважелеза (1:13000), калия (1:400) и натрия (1:26000). Имеющиеся литературныеданные свидетельствуют, что железо (III) уже в количествах в 25 раз превышающихсодержание родия искажает результаты анализа, а данные о мешающем влияниинатрия и калия вообще отсутствуют.
В данной работе исследовалисьразличные методы устранения мешающего влияния железа (III) на указанную вышекинетическую реакцию и исследовалось мешающееся влияние натрия и калия. Намиустановлено, что описанные в литературе методы маскирования железа (III)фосфат- и фторид- ионами, лимонной, винной кислотами неэффективно в оптимальныхусловиях кинетического определения родия. Следовательно, для анализа такихрастворов необходима предварительная стадия переведения железа вмалорастворимое соединение с целью отделения от родия, причем на этой стадиивесь родий должен оставаться в растворе. При осаждении гидроксида железа2 М раствором гидроксида натрия 86,7 % родия увлекается в осадок, а приосаждении 25%-ным раствором аммиака, в осадок переходит 76,7 % родия илишь использование еще более слабого основания (нитрата натрия) позволяет вдостаточной мере достигнуть переведения железа в осадок без осаждения родия.
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ПЕРСУЛЬФАТА АММОНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КИНЕТИЧЕСКОГО МЕТОДА
Как известно, персульфат аммония используется в практике аналитическойхимии, в том числе при анализе различных цветных сплавов, стали и чугунов.Кроме того, важен вопрос аналитического контроля продуктов получения персульфатааммония, производство которого стало необходимым в последнее время по следующимпричинам. В технологии аффинажа платиновых металлов для очистки палладия отплатины требуется сильный окислитель, как им и является персульфат аммония ваммиачной и нейтральной средах. Товарная его форма в виде соли или раствораобеспечивает удобство применения его по сравнению с другими окислителями.Несмотря на широкий круг потребителей в других отраслях промышленности выпускперсульфата аммония в России прекращён и поставки его обеспечивается толькоимпортом. Поэтому остро стоит задача разработки технологии производства ианализа данного реагента на месте его потребления.
Для определения малых количеств (10-60 мкг) персульфат-ионаиспользовали кинетический метод со спектрофотометрическим контролемиодометрической реакции. Светопоглощение измеряли при постоянном значении рН,равном 6.85 (регулируемый показатель кислотности реакции) и при длине волны 364нм. Кинетические кривые зависимости.оптическая плотность-время обрабатывалиметодом тангенсов. Содержание персульфата аммония определяли методомградуировочного графика (зависимость tg- концентрацияопределяемого вещества). Для определения персульфата аммония в интервале 50-260мкг использовали описанный выше метод, но следует заметить, что нарастаниеоптической плотности, связанное с выделением йода, происходит очень быстро: втечение 3 минут при концентрации 0.2 мг. Поэтому при концентрациях 0.25-0.75 мгвещества в описанной выше методике использовали тиосульфат натрия в качествезамедлителя. Относительная погрешность определения не превышала 3%.
КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ НЕФТЯНОЙ
ИНТОКСИКАЦИИ СЕГОЛЕТОК РУССКОГО ОСЕТРА
Для оценки и прогноза изменений состояния природныхэкосистем широко используются непрерывные или регулярные измерения ихфизических, химических и биологических параметров, лежащие в основеэкологического мониторинга. Между тем экосистемы достаточно долго сохраняют«следы» прошлого, с помощью которого можно не только реконструироватьпройденный ими путь развития, но вкупе с оценкой текущего состояния такжесоставить прогноз того, что их ожидает в будущем. Такие исследования мыназываем экологической диагностикой, поскольку в отличие от экологическогомониторинга они могут носить единовременный характер. Наибольших успеховэкологическая диагностика достигла в области биохимии и физиологии –последствия перенесенных организмами стрессов порой ощущаются в течение всей ихжизни. По нашему мнению, широкие возможности для развития экологическойдиагностики открывает также биотестирование, если оно сочетается с изучениемкинетических закономерностей воздействия внешних факторов на биологическиесистемы.
При биотестировании природных вод обычно встают двавопроса: токсична ли данная природная вода, а если токсична, то какова степеньее токсичности.
Наличие токсичности устанавливают с помощью наборатест-организмов, включающего, как правило, представителей основных трофическихуровней экосистемы — водоросли, зоопланктон, рыбы. Главное требование при ихвыборе — это высокая чувствительность к токсичному веществу.
Значительные сложности возникают при оценке степенитоксичности природных вод. Существующие методы ее оценки можно условноразделить на три группы.
Первая группа предусматривает разработку предельнодопустимой концентрации (ПДК) токсичного вещества путем определения такихпараметров тест-объектов, как летальная или эффективная концентрация для 50%организмов (ЛК50 или ЭК50), острое и хроническое действиетоксичного вещества (ОТД или ХТД) на «выживаемость», «плодовитость»,«изменение роста» и т.д., ориентировочно безопасного уровнясодержания токсичного вещества (ОБУВ) или его максимальной недействующейконцентрации (МНК) и других аналогичных параметров.
При всей привлекательности нормирования природных вод спомощью ПДК или подобных ему показателей, оно, строго говоря, антиэкологично.Во-первых, такое нормирование признает существование нижнего безопасного порогаконцентрации токсиканта в объектах биосферы, что во многих случаях, например,при оценке воздействия канцерогенов, далеко не бесспорно, и, во-вторых, вприродных водах присутствуют сотни и тысячи химических веществ, которыепроявляют друг к другу ингибирующее, аддитивное и синергическое действие, амногие безвредные вещества в определенных условиях становятся токсичными.Принцип ПДК, равно как ОБУВ или МНК, может быть использован для лимитированиясброса токсичного вещества в водоем, но не для отображения экологическогосостояния самого водоема.
Второй способ основан на разработке шкал токсичности,например, с помощью формулы Хабера
E = C·t, (1)
где E — эффект; C — концентрация токсичного вещества; t- время действия.
Критерий Хабера лишен характерных для ПДК недостатков,однако он позволяет выразить степень токсичности только качественно, какгипер-, остро-, умеренно-, слаботоксичная и не токсичная.
К третьей группе можно отнести количественные способывыражения степени токсичности природных вод. Наибольшее распространение срединих получил способ оценки токсичности в баллах с помощью так называемой формулы«суммарной токсичности» [1]:
tХ = 1T(i)/(tT(i)·n), (2)
где tХ — «суммарнаятоксичность»; 1T(i) — условный балл класса реакций тест-организмов;tT(i) — время проявления реакции тест-организма;n — числотест-организмов, у которых отмечена соответствующая реакция.
Согласно (2), чем больше значение tХ, тем выше балл токсичности, и по этому критерию уровеньтоксичности природной воды изменяется от нетоксичной (балл токсичности = 0) дочрезвычайно токсичной (балл токсичности = 500). Следовательно, критерий tХ, также как и ПДК, «признает» существованиенижнего порога действия токсичного вещества. Бальную систему используют такжепри ранжировании токсичности по кратности разбавления (при нормировании сбросасточных вод) и при оценке экологического статуса водоема в терминах«олиго-политоксичность» (при классификации вод по сапробности).
Особо следует сказать о прогностических возможностяхсуществующих критериев оценки токсичности природных вод. Критерии (1) и (2),фиксируя физиолого-морфологические реакции тест-организма, с той или инойстепени достоверности отражают состояние природных вод в данный момент времени,но они не могут быть использованы для ранней диагностики токсическоговоздействия того или иного вещества. Между тем, в условиях все возрастающегоантропогенного воздействия на окружающую среду, вопросы раннего прогнозированияустойчивости природных экосистем становятся приоритетными. Иными словами, речьидет об оценке изменений, происходящих в экосистеме до проявленияморфологических, физиологических, популяционных и других отклонений от нормы иих использования для предсказания возможных путей развития экосистемы.
Это обстоятельство вынуждает перенести акцентмониторинговых исследований природных вод на изучение биохимических процессов,происходящих в тест-организма при воздействии токсичного вещества. Надозаметить, что проблемам биохимии водных организмов в последнее время уделяетсяогромное внимание, однако при попытке использовать их в прогностических целяхвозникают существенные, предопределенные сложностью и многообразиембиохимических процессов, трудности.
Предлагается иной подход к оценке токсичности природныхвод. Он основан на: а) абстрагировании от механизма биохимического воздействиязагрязняющего вещества на тест-организм и б) использовании для описания реакциитест-организма на загрязняющее вещество представлений формальной химическойкинетики, основанных на принципе лимитирующей (или скорость определяющей)стадии сложных процессов. Действительно, любой отклик тест-объекта на токсичноевещество можно представить, как результатом химической реакции между«активными центрами» тест-организма и токсичным веществом. Тогдаформально кинетика отклика тест-организма на токсичное вещество можно записатьв виде:
±dZ/dt = k·C1·C2 = k·a·C1·C3, (4)
где Z — положительный (+) или отрицательный (-) откликтест-организма; t — время; C1 — концентрация активных центров тест-организма;C2 — концентрация токсиканта в фазе тест-организма; C3 — концентрация токсиканта в водной фазе; a — коэффициент пропорциональности между С2 и С3; k — константа скорости реакции отклика тест-организма. Ясно, что в качествеколичественного критерия степени токсичности природных вод здесь выступаетпараметр k.
Распространение представлений формальной химическойкинетики на биотестирование, проведя при этом некоторую аналогию междусорбционными свойствами полимерных и биологических мембран, позволяетпредвидеть два крайних случая: С1=k1C2 и C2>>C1.Тогда уравнение (4) можно переписать в виде
±dZ/dt = k1·C22, (5)
или в виде
±dZ/dt = k2·C1, (6)
где k1 = k·С1; k2 = k·C2= k·a·C3.
Из последних выражений следует, что в зависимости отсоотношения концентраций активных центров тест-организма и токсичного вещества,реакция отклика тест-организма может быть как бимолекулярной, так имономолекулярной.
С целью апробирования предлагаемого подхода длямониторинговых исследований изучалось воздействие нефтяного загрязнения насеголетки русского осетра. В качестве тест-реакции на нефтяные углеводороды(НУ) было использовано изменение концентрации суммарных сульфгидрильных групп втканях сеголеток. Для этого по 12 экземпляров сеголетки русского осетра длинойтела 6-8 см помещали в аквариумы объемом 20 л с различным содержанием сыройнефти. Предварительно нефть эмульгировали перемешиванием механической мешалкойв течение 10 минут при комнатной температуре. Смена раствора проводили черезкаждые 3 суток. По истечении заданного времени рыбы извлекали из аквариума иподвергались биохимическому анализу. Параллельные измерения проводили наконтрольных рыбах, содержащих в аквариуме без нефти. В процессе опыта рыбкормили живым трубочником.
Сульфгидрильные группы в тканях сеголеток,солюбилизированных додецилсульфатом натрия, определяли методомамперометрического титрования, в качестве титранта использовали нитрат серебра.
Выбор в качестве тест-реакции изменение содержанияSH-групп в тканях сеголеток обусловлен следующим. Сульфгидрильные группывыделяются среди других функциональных групп рыб высокой реакционнойспособностью и многообразием химических реакций, в которые они вступают — алкилирование, ацилирование, окисление, тиолдисульфидный обмен, образованиемеркаптидов, полумеркаптилий, меркапталов, водородных связей и комплексов спереносом заряда. Во многих реакциях SH-группы принимают участие в формемеркаптидного иона, обладающего высокой нуклеоофильной способностью, они легкоокисляются молекулярным кислородом, его радикалами, перекисью водорода. Средипроцессов, протекающих в организме с участием SH-групп белковой и небелковойприроды, следует отметить ферментативные реакции — в настоящее времянасчитывается около 100 ферментов, в активности которых принимают участиеSH-групп. SH-групп играют важную роль в ряде физиологических и биохимическихпроцессов — в нервной деятельности, мышечном сокращении, делении клеток,регуляции проницаемости мембран митохондрий, окислительном декарбоксилировании a-кетакислот, окислительном фосфолировании, фотосинтезе,механизме радиационных поражений и при действии токсичных веществ. Изсказанного следует, что концентрация SH-групп должна тонко реагировать наприсутствие в природной воде токсичного вещества.
/>
Рис. 1. Изменение концентрации сульфгидрильных групп втеле личинок русского осетра при их экспозиции в воде, содержащей O.05 (1), 0.25 (2), 0.50 (3), 0.75 (4) и1.00 (5) мг/л нефти. Точки — экспериментальные данные, сплошные линии — расчетпо уравнению (14).
Полученные экспериментальные данные приведены на рис.1. Они показывают, что выдерживание рыб в воде, содержащей нефть, приводит куменьшению концентрации SH-групп белков и низкомолекулярных тиоловых соединенийсеголеток русского осетра. Для краткости назовем этот процесс дезактивациейSH-групп, и применительно к нему перепишем уравнения (5) и (6) в виде:
-dCSH/dt = k1C2SH,(7)
-dCSH/dt = k2CSH.(8)
Решение последних двух уравнений при начальныхусловиях, t = 0, CSH = C0SH, даетсоответственно (9) и (10):
CSH = C0SH/(1+k1tC0SH),(9)
CSH = C0SH[1-exp(-k2t)],(10)
где C0SH и CSH — концентрация сульфгидрильных групп в теле сеголеток до и после воздействия НУ втечение времени t.
Построение анаморфоз уравнений (9) и (10) показала(рис. 2), что кинетика процесса дезактивации сульфгидрильных групп сеголетоклучше подчиняется уравнению реакции второго порядка, чем уравнению реакциипервого порядка. Найденные по тангенсу угла наклона прямых 1/CSH=f(t)значения величин k1 приведены в табл. 1.
Таблица 1. Константы скорости дезактивации SH-группсеголеток русского осетра при их экспозиции в воде, содержащей нефтьСодержание нефти в воде, мг/л
k1, мкмоль/100 г в сутки
0.05
0.25
0.50
0.75
1.00
1.7
3.9
9.3
14.1
21.7
/>/>
Рис. 2. К проверке выполнимости уравнений (9) и (10)для описания кинетики изменения концентрации SH-групп в теле сеголеток русскогоосетра. Обозначения, как на рис. 1.
Полученные данные не позволяют однозначно подтвердитьили однозначно опровергнуть вопрос о пороге токсического воздействия нефти нагидробионты. В пределах точности эксперимента зависимость константы скоростидезактивации SH-групп от концентрации нефти в воде (Сну) можетносить либо линейный
k1=20,23·Cну,(11)
либо нелинейный
k1=1,30+9,28·Cну+11,04·С2ну (12)
характер (рис. 3). Очевидно, при оценке токсическоговоздействия нефтяных углеводородов на гидробионты необходимо исходить не изобщего их содержания в воде, а из концентрации растворенных (активных) форм.Однако на практике не будет большой ошибкой, если исходить из предположения обеспороговом влиянии нефтяного загрязнения и принять, что
k1 = b·Cну, (13)
где b — коэффициентпропорциональности; Сну — содержание нефтяных углеводородов в воде,мг/л.
/>
Рис. 3. Связь между константой скорости реакциидезактивации SH-групп сеголеток русского осетра и содержания нефти в воде.Точки – экспериментальные данные, сплошные линии — расчет по уравнениям (11) и(12).
Если это предположение верно, то, объединив уравнения(9) и (13), получим выражение
CSH = C0SH/(1+b·Cну·C0SH·t), (14)
которое позволяет прогнозировать воздействие нефтяныхуглеводородов на концентрацию SH-групп в тканях сеголеток при любых значенияхнефтяного загрязнения и при любых длительностях экспозиции. О точностивыполнимости уравнения (14) можно судить по данным рис. 1, где сопоставленыэкспериментальные значения SH-групп в тканях сеголеток с теоретическирассчитанными кривыми.
В заключение отметим, что уравнение (12) позволяетрешить и обратную задачу. Например, зная концентрацию SH-групп в тканях рыб,обитающих в загрязненной нефтью природной воде, можно найти время их пребыванияв такой воде, а зная концентрацию SH-групп в тканях рыб и их возраст можнооценить «интегральное биологическое воздействие» нефтяногозагрязнения природных вод на гидробионты.
Кинетический метод определенияйода в пищевых продуктах и продовольственном сырье
Среди каталитических методовполучил применение рода-нидно-нитритный метод. Он основан на реакции окисленияроданид-иона смесью нитрат- и нитрит-ионов, катализируемой йодид-ионами. Пределобнаружения — 0,5-1,0 мкг в 100 г продукта.
Среди различных методовопределения йода в кормах и растениях (кинетический роданидно-нитрит-ный,кинетический церий-мышьяковистый, фотометрический с бриллиантовым зеленым,объемный йод-крахмальный) наибольшую чувствительность и воспроизводимостьрезультатов дают кинетические рода-нидно-нитритный и церий-мышьяковистыйметоды. Первый из них рекомендован также для нужд агрохимической службы. Нарядус этим описан простой метод количественного определения общего йода в пищевыхпродуктах, основанный на каталитической деструкции тиоционата нитритом вприсутствии йодида и последующем фотометрическом определении при длине волны450 нм. Предел определения метода -1 мкг йода в 100 г продукта, правильность — 90%, стандартное отклонение — 10%. Колориметрический метод определения йодидовбыл оптимизирован для рутинного анализа йода в пищевых продуктах, подвергнутыхкулинарной обработке и содержащих большое количество соли. Метод основан надеструкции ферро-тиоцианатного комплекса нитритом, катализируемым йодидом.Предел обнаружения — 2,5 мкг/л, интервал линейности аналитического сигнала — 2,5-12 мкг/л, возврат йодида и йодата -100±10%. По сравнению с МС-ИСП-методомустановлено небольшое расхождение результатов (не более 5%).
ГЛАВА4. ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КИНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА
ФЛЮОРАТ®-02-АБФФ-Т –полуавтоматический фотометрический анализатор биожидкостей
Общее описание
Выпускается по лицензииМинистерства Здравоохранения Российской Федерации серии М № 011373 и имеетрегистрационный № 29/07020299/0182-00
Лицензия № 64/2003-0280-0309 от11 июля 2003 года
Анализатор Флюорат®-02-АБФФ-Т- первый отечественный полуавтоматический фотометр медицинского назначения дляопределения биохимических показателей в биопробах. Анализаторы представляютсобой открытую систему, т.е. предоставляет пользователю возможность работать снаборами реагентов любых фирм изготовителей.
Анализаторы позволяют работатьсо следующими типами биохимических реакций:
А) Реакции по конечной точке –это тип реакций, в которых измерение оптической плотности рабочего растворапроводится после полного завершения химической реакции.
Б) Кинетические реакции – типреакций, в которых измерение оптической плотности рабочего раствора проводитсяв ходе протекания химической реакции.
Кинетические методы анализаявляются более точными и правильными, чем методы по конечной точке. В настоящеевремя эти методы все более широко используются в медицинской практике в России.В тоже время для реализации кинетических методов анализа требуетспециализированного оборудования, наличие в котором термостатированияизмерительной кюветы с точностью не хуже ± 0,2 Со и специальной программырасчета — обязательное условие.
Традиционно используемые вроссийских медицинских учреждениях фотометры общего назначения отечественногопроизводства не дают возможности пользователям работать кинетическими методами.
Анализатор Флюорат®-02-АБФФ-Тпредставляет собой фотометр и обеспечивает измерение основных типов реакций,применяемых в медицинской лабораторной практике:
· Фотометрия по конечной точке состандартом и холостой пробой по реагенту.
· Фотометрия по конечной точке,по коэффициенту пересчета (фактору) и холостой пробой по реагенту.
· Фотометрия по конечной точке состандартом и холостой пробой по образцу.
· Фотометрия по конечной точке,по коэффициенту пересчета (фактору) и холостой пробой по образцу.
· Фотометрия, кривая калибровкипо стандартам (до семи) с холостой пробой по реагенту.
· Фотометрия. Кинетика (дветочки) со стандартом.
· Фотометрия. Кинетика (дветочки) со стандартам и холостой пробой по реагенту.
· Фотометрия. Кинетика. Фактор.
· Оптическая плотность.
· Бихроматика. Конечная точка постандарту с холостой пробой по реагенту.
Отличительные особенности:
· Работа в диалоговом режиме(вопрос — ответ)
· Автоматическая сменасветофильтров при выборе методики измерения
· Автоматическая загрузка воперативную память калибровочной зависимости (калибровки) при смене методикиизмерения
· Мембранный насос и проточнаямикрокювета (для фотометрических методик)
· Малый расход реагентов 400 мкл– 1000 мкл на 1 анализ
· Встроенный термостатизмерительной кюветы. Температуры стабилизации 25, 30, 37 оС
· Хранение в памяти 40 методиканализа
· Автоматический анализрезультата на попадание в диапазон нормы
· Печать протокола выполненияанализов на принтере
· Производительность выполненияанализов до 100 анализов в час методом по конечной точке
НПФ АП «Люмэкс»®выпустила уже второе поколение полуавтоматических биохимических анализаторов — «Фотометр®-АБФ-100»
Принцип метода
Измерение оптической плотностии автоматический расчет концентрации определяемого компонента.
Анализаторы предназначены дляработы с унифицированными в медицине фотометрическими методиками анализа дляопределения: общего белка, альбумина, общего и прямого билирубина, холестерина,триглицеридов, мочевины, АлТ, АсТ, ЛДГ, a-амилазы, 17- КС, 17- ОКС, кислой ищелочной фосфатазы и т.п., макроэлементов и электролитов.
Процедура работы
Алгоритм выполнения анализовпредполагает сначала проведение специфической химической реакции (или ееначала) вне прибора (в пробирке). Для выполнения анализа используютсяспециальные наборы реагентов, а в качестве пробы — соответствующийбиологический материал. Далее: перенос рабочего раствора в кюветное отделениеанализатора, измерение оптической плотности (интенсивности люминесценции)рабочего раствора, расчет концентрации, анализ результата на попадание вдиапазон нормы, вывод результата и необходимых комментариев на экран и принтер.Все этапы работы анализатора кроме первых двух выполняются автоматически.
Диалоговый режим работы,использованный в анализаторе — это наиболее удобный для пользователя режим,позволяющий максимально упростить работу оператора. В случае работы в этомрежиме оператор просто выбирает необходимый пункт из меню, предлагаемогоанализатором, или непосредственно выполняет инструкцию, которая в виде текстаотображается на дисплее.
Перед началом измерений ванализатор с клавиатуры необходимо ввести программу для выполнения анализа, всоответствии с инструкцией к используемому набору реагентов. Этот процесс такжевыполняется в диалоговом режиме.
Области применения
Анализ компонентов биопроб вклинико-диагностических лабораториях лечебных, профилактических,научно-исследовательских медицинских учреждениях.
Области нибольшей эффективностиработы прибора:
· Малые и средниеклинико-диагностические лаборатории медицинских учреждений или как второйфотометр в крупных лабораториях.
Рекомендуемый комплект поставки
· Основной блок анализатора
· Стандартная кварцевая кюветаК10 или блок проточной кюветы
· Инструкция по эксплуатации
· Сетевой предохранитель
ЛИТЕРАТУРА
1. Золотов Ю.А., Дорохова Е.Н.,Фадеева В.И. и др. Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн. 2. Методыхимического анализа. / Под ред. Ю.А. Золотова. М.: Высш. шк., 1996.
2. Основы аналитической химии.Практическое руководство. / Под ред. Ю.А. Золотова. М.: Высш. шк., 2001.
3. Крейнгольд С.У. Каталиметрия ванализе реактивов и веществ особой чистоты. М.: Химия, 1983.
4. Марк Г., Рехниц Г. Кинетика ваналитической химии. / Пер. с англ. Под. ред. К.Б. Яцимирского. М.: Мир, 1972.
5. Яцимирский К.Б. Кинетическиеметоды анализа. Изд. 2-е. М.: Химия. 1967.
6. Номенклатура кинетическихметодов анализа. (Рекомендации ИЮПАК, 1993). // Журн. аналит. химии. 1998. Т.53, № 1. С. 110–126.
7. Мюллер Х., Отто М., Вернер Г.Каталитические методы в следовом анализе. / Пер. с нем. Под ред.К.Б. Яцимирского. М.: Мир, 1982.
8. Сычев А.Я.Окислительно-восстановительный катализ комплексами металлов. Кишинев: Штиинца,1976.
9. Набиванец Б.И., Линник П.Н.,Калабина Л.В. Кинетические методы анализа природных вод. Киев: Наукова думка,1981.
10. Бончев П. Комплексообразованиеи каталитическая активность. / Пер. с болг. Под ред. К.Б. Яцимирского. М.: Мир,1975.
11. Каталог химических реактивов иособо чистых химических веществ. М.: Химия, 1983.
12. Крейнгольд С.У., БожевольновЕ.А., Драпкина Д.А. // Журн. аналит. химии. 1967. Т. 22, № 3. С. 218.
13. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты.М.: Мир, 1982. Т. 1. 389 с.
14. Фершт Э. Структура и механизмдействия ферментов. М.: Мир, 1980. Т. 1. 432 с.
15. Клячко Н.Л. Ферменты — биологические катализаторы: Основные принципы действия // СоросовскийОбразовательный Журнал. 1997. № 3. С. 58-63.
16. Келети Т. Основы ферментативнойкинетики. М.: Мир, 1990. 350 с.