Дипломнаробота
Натему:
Використання олійних рослин для оцінки токсичностінафтозабрудненого ґрунту
ЗМІСТ
ВСТУП
1.ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1.1 Проблема нафтового забруднення ґрунту
1.2 Якість ґрунту як складова стійкості екосистеми
1.3 Оцінка якості ґрунту за допомогою тест-систем
2. ОБ’ЄКТИ, МЕТОДИ ТА УМОВИПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1 Об’єкт дослідження та його характеристика
2.2 Підготовка матеріалу для дослідження
2.3 Методи досліджень
2.3.1 Визначення фітотоксичностіґрунту
2.3.2 Визначення тест-показниківльону звичайного
2.4 Статистично-математичнеопрацювання результатів
3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
3.1 Залежність процесу проростання насіння льонузвичайного (Linum usitatissimum L.) від концентрації нафти у ґрунті
3.2 Морфометричні параметри проростків Linumusitatissimum L. як тест-реакції на дію нафтового забруднення ґрунту
ВИСНОВКИ
ЛІТЕРАТУРА
ВСТУП
Інформація простан довкілля отримується за допомогою численних методів контролю,спостереження та оцінки. Об’єктивна та своєчасна інформація формує правильнерозуміння проблеми та є основою для прийняття ефективних управлінських рішеньщодо покращення стану довкілля. Екологічний моніторинг має на меті збір, оброблення,збереження та аналіз інформації про стан навколишнього природного середовища,прогнозування його змін та розробки науково обґрунтованих рекомендацій длязбереження чи покращення стану довкілля (Еколог. право України, 2008).
Одним із видівзабруднення, що чинить тривалий стресовий вплив на екосистему, є нафта.Забруднення ґрунтів нафтою спричиняє як деградацію земель, так і створюєнебезпеку проникнення полютантів у живильні ланцюги, однією з ланок яких єлюдина. Нафтопродукти завдяки високій адсорбуючій здатності ґрунту довгий часзберігаються в ньому, змінюючи його фізико-хімічні та біологічні властивості.Природне відновлення ґрунтових екосистем, забруднених нафтою – довготривалий іскладний процес (Оборин та ін., 1987).
Для оптимізаціїданого процесу необхідне ведення моніторингу нафтогазового комплексу тасупутнього забруднення ґрунтів. Важливою складовою екологічно моніторингу єбіомоніторинг, який використовує методи біоіндикації та біотестуванння(Самсонов та ін., 2005). Ці методи виступають доповнювальними при проведенніфізико-хімічного аналізу. Оскільки детальний хімічний аналіз нафти та її вмістув забрудненому ґрунті може надати докладну інформацію про загальну концентраціюполютанта, проте потенційні впливи на екосистеми не можуть бути передбачені,використовуючи тільки дані концентрації. Тому необхідні дослідження через серіюбіотестів (Cornelis et al., 2001).
Ряд наслідків, щовипливають з первісного хімічного забруднення, призводять до того, щостандартні хімічні методи аналізу є недостатніми, щоб повністю оцінити вплив нанавколишнє середовище. Обмеженість хімічних методів аналізу полягає у неврахуванні синергізму забруднювачів, абсорбцію ґрунтовими колоїдами тавзаємодію із гуміновими кислотами. (Baker,1970; Wang, 1990). У біотестахвідображається інтеграція цих ефектів, і тому їх застосування рекомендуєтьсядля оцінки екологічного ризику забрудненого ґрунту (Keddy, 1995). Крім того,використання таких біологічних методів тестування рекомендується для оцінки ефективностіпроцесів ремедіації грунту. У біотестуванні основним параметром оцінкизабруднення виступає не концентрація полютанта, а реакція та відповідь живогоорганізму. Цей метод дозволяє оцінити забруднення по відношенню до біотичнихкомпонентів екосистеми. Біотести наочно продемонстрували, що хімічного аналізуне достатньо для екологічної оцінки забрудненого грунту, особливо, припрогнозуванні впливу складних сумішей сполук, наприклад, таких як нафта (Banks,2005).
Рослини можнавважати найбільш зручними об’єктами для біомоніторингу ґрунтів. Простота облікуефектів та інтерпретації результатів, їх чутливість і відтворюваність робитьдоцільним застосування рослинних тест-систем для діагностування та оцінкитоксичності нафтозабруднених ґрунтів. Тому, враховуючи вищесказане, ми працювали над розробкоюекспрес-методу оцінки токсичності нафтозабрудненого ґрунту за допомогою рослин.Як тест-об’єкт використовували льон звичайний (Linum usitatissimum L.).
Мета роботи –встановлення закономірності „доза-ефект” між концентрацією нафти у ґрунті тачутливими тест-реакціями проростків льону звичайного (Linum usitatissimum L.)для фітооцінки токсичності нафтозабруднених ґрунтів.
Для досягнення мети булипоставлені конкретні завдання:
· оцінити фітотоксичність ґрунту, забрудненого різною кількістю нафти задопомогою найбільш чутливих тест-реакцій рослин льону звичайного: енергії проростання, схожостінасіння та морфометричних характеристик проростків;
· з’ясуватизакономірність відношення „доза-ефект” між концентрацією нафти у ґрунті та чутливимитест-показниками L. usitatissimum;
· зробитивисновки про доцільність використання даних параметрів для оцінки фітотоксичності нафтозабрудненого ґрунту.
1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1.1 Проблема нафтового забруднення ґрунту
У межахКарпатського регіону видобувається значна кількість нафти і газу. Бориславськенафтове родовище, що у Львівській області України, – один з найстарішихнафтопромислових центрів світу. У м. Бориславі та його околицях унаслідокдовготривалого нафтовидобутку значна частка природних угруповань зазналадегресивних змін (Цайтлер, 2000). Нафтові родовища міста Бориславарозглядаються як об’єкти підвищеного ризику розвитку екологічного лиха.
Серед компонентів наземнихекосистем насамперед забруднені нафтою ґрунти, що опосередковано впливає наґрунтову мікрофлору, рослинний і тваринний світ. На забруднених нафтоютериторіях формується специфічний мікроклімат, зумовлений мікрорельєфом,складом субстрату, порушеним водним та зміненим температурним режимами,з’являється специфічний запах. Чорне забарвлення нафтозабруднених ґрунтівпризводить до надмірного поглинання сонячної радіації (Андресон та ін., 1980 ).
Нафтові виливи утворюють на поверхніґрунту щільну, в’язку бітумінозну кірку. Забруднення нафтою ґрунтів зумовлює зміни їхфізико-хімічних властивостей. Так, склеювання структурних частинок ґрунтунафтою призводить до значного зростання в’язкості і щільності ґрунтової маси,що погіршує його повітряно-водний режим. Ґрунти, просочені нафтопродуктами,втрачають здатність вбирати і затримувати вологу. У таких ґрунтах створюютьсяанаеробні умови, змінюється окисно-відновний потенціал. Порушуєтьсявуглецево-азотний баланс ґрунту: різко зростає співвідношення між вуглецем іазотом за рахунок вуглецю нафти, знижується нітрифікаційна здатність, зменшуєтьсявміст нітратного азоту, вільного фосфору, обмінного калію, змінюється вмістпоглинутих основ кальцію і магнію. Це погіршує азотний режим ґрунту і порушуєкореневе живлення рослин (Оборини и др., 1987).
Основними механізмамидеградації ґрунту при забрудненні нафтою є:
· безпосереднє пригнічення біологічних процесів токсичнимикомпонентами;
· зменшення вологоємності ґрунту й заблокування поживнихречовин внаслідок гідрофобізації поверхні важкими вуглеводнями;
· диспергація ґрунту одновалентними катіонами супутніх солей. (Мірошниченко, 2005).
Значне нафтовезабруднення ґрунту, що виникає при аварійних викидах, супроводжується гостроютоксичною дією нафти на живі організми. У високих концентраціях нафта чинитьсильну токсичну дію на всю ґрунтову біоту, однак, період токсичності єпорівняно недовготривалим. З часом гострота токсичної дії нафти помітнознижується, а довготривале зниження біологічної продуктивності нафтозабрудненихґрунтів, очевидно, пов’язане із зміною важливих властивостей ґрунтів (Никифороваи др., 1987).
Полікомпонентністьнафт та мінливість їх складу обумовлює різнобічність негативноїдії на ґрунти (Мірошниченко, 2005). Метанові вуглеводні (алкани) легкоїфракції чинять наркотичну та токсичну дію на живі організми, зокрема, на нервовусистему, викликаючи її нестійкість. Ці вуглеводні розчинні у воді, тому легкопроникають у клітини організмів через мембрани. Парафін не токсичний для живихорганізмів, бо внаслідок високих температур застигання та розчинності в умовахземної поверхні він переходить у твердий стан, позбавляючи нафту рухомості(Пиковский, 2003;). Навіть невелике підвищення температури різко активуємолекулу парафіну, роблячи її здатною до глибоких процесів окиснення
Ароматичні вуглеводні – найбільштоксичні компоненти нафти. У концентрації лише 1% у воді вони вбивають всіводні рослини; нафта, що містить 38% ароматичних вуглеводнів, значно пригнічуєріст вищих рослин. Важкікомпоненти (смоли, асфальтени тощо) слабо розкладаються ґрунтовою мікрофлорою іобумовлюють стійкі гідрофобні властивості забрудненого ґрунту. Легкі фракції (насамперед,нормальні і розгалужені алкани з довжиною ланцюга до 12-16 атомів вуглецю)високотоксичні для рослин і ґрунтової фауни, легко мігрують у ґрунті, аледоступні до розкладу. Гідрофобні властивості, спричинені цими фракціями,поступово зникають протягом 2-3, максимум 5-річного періоду. (Мірошниченко,2005).
Спостереження за динамікоюфітотоксичності окремих нафтопродуктів виявили суттєву різницю і всамовідновленні родючості ґрунту. За тестового рівня забруднення 10 л/м2 очищення ґрунту від бензину відбувалося за перше півріччяпісля його надходження, переважно шляхом фізичного випаровування. Час очищенняґрунту від гасу складає близько двох років, провідні механізми –випаровування і біодеградація. Негативна дія мазуту, викликана збільшеннямгідрофобності поверхні ґрунтових часточок, триває набагато більше(Мірошниченко, 2005).
Отже, у фітотоксичностінафтового забруднення можна виділити як пряму, так і опосередковану дію. Першучинять пари легколетючих вуглеводнів у ґрунтовому повітрі, другу – складаютьпогіршення поживного і водно-повітряного режиму та інактивація важливихмікробіологічних процесів (нітрифікація, амоніфікація, целюлозолітичнаактивність) “важкими” компонентами нафти.
1.2 Якість ґрунту як складова стійкості екосистеми
Сучасна концепція якості ґрунту розвинулася від розуміння різноманітнихфункцій, які виконує ґрунт в екосистемі. Якість ґрунту визначається як ключовау стійкості екосистеми. На відміну від функцій води та повітря, які прямопов’язані із здоров’ям людини, функції ґрунту чинять опосередкований вплив (Warkentin, 1995).
Якість ґрунту – це здатність виконувати функції в межах природних чикерованих екосистем, щоб підтримувати біологічну продуктивність рослин і тварин,забезпечувати якість довкілля, сприяти здоров’ю людини (Doran et al., 1996).
Властивості ґрунту, які визначають його якість, можна поділити напостійні (мінеральна складова, гранулометричний склад) та динамічні (вмістгумусу, рН, мікробіота). Саме динамічні компоненти потребують постійногоспостереження для відслідковування змін (Carter, 1996).
Визнано, що ґрунти є необхідними для нормального функціонуванняекосистем, що сприяють здатності системи витримувати несприятливі наслідкитаких порушень, як посухи, шкідники, забруднення, експлуатація людиною,включаючи сільське господарство. Стійкість проти деградації та здатністьвідновитися після порушення є важливими показниками функціонування ґрунту.
Екологічний погляд на ґрунт розглядає вплив його функції на іншікомпоненти екосистеми (наприклад, воду, атмосферне повітря і біту), а такожприлеглі до них екосистеми. Таким чином ґрунт змінює хімічний склад опадів іперерозподіляє водуу в навколишньому середовищі, бере участь у підтриманнібалансу води і тепла, газів атмосфери і служить в якості резервуара длябіорізноманіття та генетичного матеріалу.
Існує кілька підходів до визначення функцій грунту в екосистемі:
· SoilScience Society of America (1995): підтриманнябіологічної продуктивності, різноманітності; регулювання та розподіл води ірозчинених потоком речовин; фільтрація, буферизація, іммобілізація ідетоксикації органічних і неорганічних речовин; зберіганнята включення в колообіг поживних речовин та інших елементів в біосфери Землі.
· Blum andSantelises (1994): виробництво біомаси; ґрунт як реактор (фільтри, буфери, перетворюєматерію); ґрунт як середовище існування і депо генетичних резервів
· Warkentin(1995): утилізаціята рециркуляція органічних матеріалів із вивільненням поживних речовин та енергії;розподіл опадів на поверхні ґрунту; підтримання стабільної структури дляпротистояння водної та вітрової ерозії; буферизація швидких змін температури івологості, вмісту хімічних елементів; підтримання різноманітності місцьпроживання, створюючи широкий спектр розмірів пор та пустот у ґрунті;зберігання та поступове вивільнення поживних речовин і води; розподіл енергіїна поверхні ґрунту.
Ґрунт як одна із фундаментальних абіотичних складових екосистеми єважливим об’єктом екологічного моніторингу. Ця значущість випливає також ізвзаємозв’язку усіх компонентів екосистеми через кругообіг речовин. Придеградації ґрунту негативному впливу піддаються й інші компоненти екосистем.Речовини, які є ґрунті, можуть включатися у трофічні ланцюги, які можуть закінчуватисялюдиною. Полютанти здатні мігрувати у ґрунтові води, які стають носіямитоксичних речовин (Kоrdel, 2001).
Для нормативної оцінки якості ґрунту визначають загальну концентраціюзабруднюючих речовин, отриману за допомогою фізико-хімічних методів аналізу.Однак, для вивчення потенційного впливу на екосистему необхідною є оцінка черезсерію біотестів (Banks,2005).
1.3 Оцінка якості ґрунту за допомогоютест-систем
Отриматиінформацію про рекцію біологічних систем можна за допомогою методів біоіндикаціїта біотестування. Методи біоіндикації дозволяють отримати дані, щохарактеризують відгук біоценозів на антропогенний вплив. Характерно, що реакціяформується протягом досить тривалого проміжку часу, тому може включатинакладання різних чинників, їх коливання та адаптаційні механізмивиду-індикатора (Семенов, 1984). Біоіндикатори не можуть миттєво реагувати назміну екологічних умов, тому що їх індикаторними властивостями є популяційніпроцеси та процеси угруповання в цілому. Методи біотестування, на відміну відбіоіндикації, являють собою характеристику ступеня впливу на біоценози. Задопомогою цих методів можна отримати дані про токсичність конкретної пробиводи, ґрунту, забрудненої хімічними речовинами – антропогенного чи природногопоходження в даний час. Таким чином, методи біотестування близькі до методівхімічного аналізу. У той же час, на відміну від хімічних методів, вонидозволяють дати реальну оцінку токсичних властивостей води або іншогосередовища, обумовлених присутністю комплексу забруднюючих хімічних речовин таїх метаболітів (Саксонов и др., 2007).
Біотест – дослід,в якому зіставляються реакції певного організму в умовах токсичного забрудненняі чистому середовищі (контроль). Під токсичністю розуміють властивість хімічнихречовин проявляти пошкоджуючу або летальну дію на живі організми. Речовина, щомає токсичну дію, називається токсикантом, а процес впливу токсиканта наорганізм – токсикація (на екосистему – токсифікація).
Основнимпоказником в біотестуванні є тест-функція – функціональний показник, що реагуєна токсичний вплив і може бути виміряний кількісно за допомогою певного методу.Тест-реакція – кількісний вираз зміни тест-функції (Гідроекологічнатоксикологія та біоіндикація забруднень, 1995).
Тест-фукнкціі, щовикористовуються в якості показників біотестування для різних об'єктіввідмінні: для інфузорій, ракоподібних, ембріональних стадій молюсків, риб,комах − виживання (смертність) тест-організмів; для ракоподібних, риб,молюсків − плодючість, поява аномальних відхилень у ранньомуембріональному розвитку організму, ступінь синхронності дроблення яйцеклітин; длякультур одноклітинних водоростей та інфузорій − загибель клітин, зміна(приріст чи зменшення) чисельності клітин в культурі, коефіцієнт діленняклітин, середня швидкість росту, добовий приріст кореня та ін ( Брагинский,1993).
За Н. С.Строгановим (Строганов, 1971), кількісно токсичність речовини для окремогоорганізму визначається як величина, обернена до медіанної летальноїконцентрації: Т = 1/LC50. Проте LC50 можна визначити тільки для однієї речовиниі тільки в експеремкнтальних умовах і для певного виду організму. Проте, усі ціпоказники токсичності є більш актуальними для гідробіонтів і використовуютьсядля оцінки токсичності вод та ґрунтових витяжок (Гідроекологічна токсикологіята біоіндикація забруднень, 1995).
Методибіотестування широкого використовуються при проведенні гідрологічного моніторингуякості вод. У розвинених країнах при контролі якості води, крім гідрохімічниханалізів, обов'язковим є токсикологічний контроль. Показник „токсичність” якнорматив при контролі стічних вод та видачу дозволів на їх скидання в природніводойми застосовується в таких країнах, як Данія, Франція, Германя, Ірландія,Нідерланди, Великобританія, Норвегія, Бельгія, Швеція, Швейцарія, Канада, США,Австралія, Бразилія, Японія (Саксонов и др., 2007).
Існує безліч біологічних показників, за допомогою яких оцінюється стан таякість ґрунтів. Найбільш важливими для цілей ґрунтового моніторингу напромислових об'єктах є інтегральні показники біологічної активності:токсичність, „дихання”, кількість вільнихамінокислот і білків. Інтенсивність дихання ґрунту є виключно варіабельноювеличиною і залежить від великої кількості факторів (температурного режиму,вологість, стану фітоценозу та ін.) Для оцінки екологічного впливу забрудненьнеобхідно проводити порівняння даних, отриманих на різних ділянках вмаксимально близьких умовах. Інформативними є й інші показники, наприклад,ферментативна активність. Попадання нафти і нафтопродуктів у ґрунт призводитьдо трансформаційних змін активності основних ґрунтових ферментів, що впливає наобмін азоту, фосфору, вуглецю і сірки (Киреева, Новоселова и др., 2001). Стійкізміни в активності деяких ґрунтових ферментів можуть використовуватися якдіагностичні показники забруднення ґрунтів нафтою. Для цього зручними об’єктамиє ферменти, що об'єднуються під загальною назвою ґрунтові уреази. По-перше,вони менше піддаються впливу інших екологічних факторів і, по-друге,прослідковується чітка залежність їх активності від ступеня забрудненняня ґрунтів(Киреєва и др., 2001).
Застосування мікроорганізмів для оцінки інтегральної токсичності ґрунту істворення на їх основі комплексної системи чутливих, достовірних і економічнихбіотестів є перспективним напрямком досліджень. Багато фізіологічних груп ґрунтових мікроорганізміввиявляють чутливість по відношенню до нафтових вуглеводнів. Загальна кількістьмікроорганізмів, як правило, досить чітко відображає мікробіологічну активністьґрунту, швидкість розкладання органічних речовин і кругообігу мінеральнихелементів. На підставі даного показника можна не тільки судити про ступіньзабруднення ґрунту нафтою, а й про потенційну здатність до відновлення, а такожпро процеси розкладання нафти у природних умовах і при рекультивації забрудненихґрунтів (Киреева и др., 2003). Нафтове забруднення може також сприяти накопиченнюв ґрунтів мікроскопічних грибів, які виділяють фітотоксини та викликаютьзахворювання рослин. Безпосередній вплив нафти на рослинний покрив виявляєтьсяв тому, що сповільнюється ріст рослин, порушуються функції фотосинтезу ідихання, відзначаються різні морфологічні порушення, сильно страждають кореневасистема, листя, стебла і репродуктивні органи (Киреева и др., 2003).
Рослини можнавважати найбільш зручними об’єктами для біомоніторингу ґрунтів, оскільки вони єпервинними ланками трофічних ланцюгів, виконують основну роль у поглинаннірізноманітних забруднювачів і постійно зазнають їх впливу внаслідок закріпленняна субстраті. Простота обліку ефектів та інтерпретації результатів, їхчутливість і відтворюваність робить доцільним застосування рослиннихтест-систем для діагностування та оцінки токсичності нафтозабруднених ґрунтів.
Оперативну інформацію про фітотоксичність забрудненогоґрунту можна отримати, використуючись як тест-об'єкти насіння та проросткирослин. Для коректної постановки досліду на токсичність, насіння для тестування підбирають за розмірами ішвидкістю проростання, наприклад: салат (Lactuca sativa L.),просо (Panicum miliaceum L.) редьку (Raphanus L.), червону конюшину (Trifolium pratense L.), пшеницю (Trifolium aestivum L.)(Chaіneau, 1997). В якості тест-функції виступають показники схожості насіння,дружність і час появи сходів, швидкість росту проростків, останній з якихвважається найбільш чутливим. У цьому відношенні рослинні тест-системи мають істотніпереваги перед приладами: дешеві, легко відтворюються, швидко розмножуються,мають типову відповідну реакцію на вплив (Гродзинський, 2006)
Для визначеннятоксичності на вищих трофічних рівнях використовують ґрунтових безхребетних. У природних екосистемах, длякомплексного біотестування використовують мікроартроподи. Ґрунтові ногохвістки(колемболи) дуже чутливі до дії органічних речовин, тому їх можна з успіхомзастосовувати при визначенні інтегральної токсичності нафтозабруднених ґрунтів(Трублаевич, 1997). Тест-показником може служити відсоток тих особин коллембол,що вижили, тривалість їх життя, поведінкові реакції. При вмісті нафти 1-5% масиґрунту був виявлений лінійний зв'язок між вмістом забруднювача і величиноютест-показника (Cornelis, 2001).
Ціннимибіоіндикаторами являются дощові черв’яки (Hund-Rinke et al., 2003). Закількістю дощових черв’яків, їх станом можна судити про ступінь забрудненняґрунтів. Ці тварини мають відповідні тест-реакції, які залежать не лише відтривалості забруднення, але й від дози забруднювача. Існує пряма залежність міжконцентрацією внесених нафтопродуктів і смертністю дощових черв’яків назабруднених ділянках в перші дні після внесення у ґрунт нафтопродуктів.Переваги дощових червяків як тест-обєктів полягають у чутливості до змін вґрунті, що пов’язано із особливостями їх життєдіяльності: газообмін черезшкіряні покриви, заковтування часточок ґрунту (Козлов, 2002).
Біотестування на дафніях стало широковикористовуватися в контролі забруднення вод (Строганов, 1971). ПопулярністьDaphnia magna яктест-обєкта пов’язана з тим, що вона легко розводиться в культурі, доситьстійка в штучних умовах, дає цілий комплекс тест-реакцій, та має короткийжиттєвий цикл, що дозвляє прослідковувати токсичний вплив на наступні покоління(Брагинський, 2000). Біотестування ґрунтів із використанням дафній доцільнопроводити лише на водних витяжках для гідрофільних речовин, тому для оцінкитоксичності нафтопродуктів цей метод не є ефективним.
Комплексне біотестування, яке включає наступні тест-об'єкти: насіннярослин, мікроорганізми, ґрунтові безхребетні та ферменти можна використовуватияк в повному обсязі, так і частково, в залежності від цільового призначеннядосліджень і ступеня нафтового забруднення ґрунту. Якщо проби з ґрунтовиминогохвістками і активність ферментів дають кількісну характеристику токсичностіґрунту при низькому та середньому ступені забруднення, то мікробіологічні тестизручні для опису стану сильно забруднених високотоксичних ґрунтів (Киреева идр., 2003). Тестування водними організмами, як правило, здійснюється на витяжках іззабрудненого грунту, досліджуючи короткострокові періоди впливу. Перевагитакого методу полягають у низьких витратах і швидкій відповіді. Проте, зекологічної точки зору, оцінка гострої дії, є менш значущою та репрезентативною.Такі тести можуть бути використані, наприклад, для виявлення потенційноговпливу хімічних забруднюючих речовин на функціонування фільтраційного механізмуґрунтів (Keddy, 1995). Довготермінові методи біооцінки, що ґрунтуються навизначенні хронічного впливу, є більш значущим з екологічної точки зору іможуть надати інформацію про можливі наслідки зміни властивостей ґрунту яксередовища існування. Тести гострої та хронічної дії відрізняються затривалістю життя піддослідного організму, тобто періодом впливу.
Проте, лишекомплексна оцінка, що враховує вплив на різні види організмів, різних трофічнихрівнів може відображати ступінь екотоксичності ґрунту (Cornelis, 2001).
2. ОБ’ЄКТИ, МЕТОДИ ТА УМОВИПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1 Об’єкт дослідження та його характеристика
Льон звичайний (Linum Usitatissimum L.) − вид рослин з родини льонових Linaceae.Однорічна травяниста рослина. Стебло циліндричне, вгорі гілчасте зланцетовидними листками. Віночок з п’ятьма пелюстками блакитного кольору. Плід −п’ятигніздна куляста коробочка з десятьма маслянистими насінинами. Цвіте зчервня по серпень, насіння достигає у липні (рис. 2.1). Насіння міститьслизисті речовини (близько 12 %), пектин, жирну олію (30-40%), складену ізгліцеридів лінолевої (35-40%), ліноленової (25-35%) та ), олеїнової (15-20 %),пальмітинової і стеаринової кислот, ціаногеновий глікозид лінамарин (1,5%),ензим лінамаразу, до 20-25% протеїнів, цукри, каротин тощо. Типові біотопи дляльону звичайного − це узлісся, пустища, узбіччя доріг, вирощується у культурі.Рослина не вимоглива до умов середовища (Опред. высших растений Украины, 1987).
2.2 Підготовка матеріалу для дослідження
Для визначенняфітотоксичності грунту були підготовлені зразки нафтозабрудненого грунту Длядосліджень використовували сиру нафту густиною 0,86 г/мл, ґрунт глинистий(середньосуглинковий) з екологічно чистої території. У повітряно-сухий ґрунтвносили нафту за такою схемою:
· контроль(ґрунт чистий);
· 99 г чистого ґрунту + 1 г нафти (1% забруднення);
· 97,5 г чистого ґрунту + 2,5 г нафти (2,5% забруднення);
· 95 г чистогоґрунту + 5 г нафти (5% забруднення);
· 94 гчистого ґрунту + 6 г нафти (6% забруднення);
· 92 г чистого ґрунту + 8 г нафти(8% забруднення);
· 90 г чистого ґрунту + 10 г нафти (10% забруднення);
· 85 г чистого ґрунту + 15 г нафти (15% забруднення);
2.3 Методи досліджень
2.3.1 Визначення фітотоксичності ґрунту
Наважкуґрунту 20 г поміщали в ступку і зволожували водою приблизно до 75% від повноївологоємкості, добре розтирали цю масу. Потім суспензію переносили в чашкиПетрі. При струшуванні чашки утворилося легеньке водяне дзеркальце.
На грунт у чашкивисівали насіння льону звичайного (Linum usitatissimum L.) (по 20 штук).Закриті чашки ставили в термостат на при температурі +24°С. Через 3 доби рахувалисхожість насіння, на 6-ту добу – вимірювали довжину кореня і пагона проростків.
2.3.2 Визначення тест-показників льону звичайного
Після проростаннянасіння льону звичайного аналізували наступні тест-показники: індекс схожості(ІС) на 3-тю добу, індекс кореня (ІК) та індекс пагона (ІП) на 6-ту добу,індекс проростання насіння (ІПН) (Teaca, 2008).
/>,
де /> − к-тьпророслого насіння в досліді,
/> − к-тьпророслого насіння в контролі;
/>,
де /> −довжина кореня в досліді,
/> −довжина кореня в контролі;
/>,
де /> −довжина пагона в досліді,
/> −довжина пагона в контролі;
/>
2.4 Статистично-математичнеопрацювання результатів
нафтовий забрудненняґрунт льон
Досліди проводили у п’ятикратнійповторності. Отримані результати опрацьовували статистично з використаннямпрограмного пакета Microsoft Excel для персональних комп’ютерів. Визначалисереднє арифметичне, стандартну похибку. Достовірність різниці між контрольнимі дослідними варіантами оцінювали за критерієм Стьюдента; вірогідними вважалирізниці, де Р
3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХОБГОВОРЕННЯ
3.1 Залежність процесу проростання насіння льону звичайного (Linumusitatissimum L.) від концентрації нафти у ґрунті
Для проростаннянасіння необхідні певні умови, передусім – вода. Процес проростання насіннярозпочинається після адсорбції води крізь мікропіле та насіннєві оболонкизавдяки біоколоїдам, якими є білки, крохмаль, геміцелюлоза, пектинові речовини.Набрякання цих речовин створює силу для розриву оболонки. Зародок збільшуєтьсяу розмірах завдяки росту клітин розтягуванням і поглинанню води. Зародковийкорінець виходить унаслідок розриву насінної шкірки і насінину вважаютьпророслою (Терек, 2007).
Нами встановлено,що залежно від концентрації у ґрунті нафта по-різному впливає на проростаннянасіння льону звичайного (Linum usitatissimum L.). Криві динаміки проростаннянасіння в часі ілюструють, що при низьких концентраціях нафти насіння проростаєшвидше, ніж у контролі (рис. 3.1). На 3-тю добу при забрудненні 1% нафти уґрунті кількість пророслого насіння на 9% більша, ніж у контролі, при 2,5%нафти – на 15%. При даних концентраціях криві динаміки проростання насінняшвидше виходять на плато (кількість пророслого насіння досягає максимальногозначення на 4-ту добу). У контролі досягнення максимуму схожостіспостерігається на 5-ту. Отже, нафта при низьких концентраціях (1%, 2,5%)сприяє виходу насіння із стану спокою та стимулює проростання насіння.
Це можна пояснитистимулюючою дією нафти при низьких концентраціях (Грищенко, 1982). Встановлено,що стимулюючий ефект мають поліароматичні вуглеводні (ПАВ) як компоненти нафти,зокрема флуорен, антрацен, пірен, хризен. При низьких концентраціях (10 мг/кг).спостерігалося стимулювання росту рослин на ранніх етапах розвитку для такихдосліджуваних видів, як пшениця — Triticum vulgare Vill, овес — Avena sativa L.,кукурудза — Zea mays L., помідори — Lycopersicon esculentum Miller, квасоля — Phaseolusvulgaris L, соняшник — Helianthus annus L. (Maliszewska-Kordybach, 2000).
У концентраціях5%, 6% та 8% нафта значно пригнічує процес проростання насіння. Кількістьпророслого насіння на 3-тю добу при 5% нафтового забруднення зменшується на32%, а при 6% – на 34% щодо контролю. Криві динаміки проростання досягаютьсвого плато, як і в контролі, на 5-ту добу. При забрудненні 8% насіння починаєпроростати лише на 4-ту добу, а плато настає на 6-ту добу. При нафтовомузабрудненні 10% насіння проростає на 6-ту добу. Отже, при високих ступеняхнафтового забруднення швидкість проростання насіння гальмується, що зумовленовисокою токсичністю нафти. Таким чином, швидкість проростання насіння залежитьвід концентрації токсиканта, що буде враховано при розробці методу фітооцінкитоксичності нафтозабруднених ґрунтів.
/>
Рис. 3.1. Часовадинаміка проростання насіння льону звичайного (Linum usitatissimum L.) прирізних концентраціях нафти у ґрунті
Нафта яктоксикант негативно впливає на проростання насіння, зменшуючи схожість. Намивстановлено, що індекс схожості на 6-ту добу при низьких та середніх концентраціяхнафти (1 – 8%) залишається близьким до контролю. На проміжку 0—8% крива індексусхожості іде майже горизонтально і наближається до плато, що відображає слабкузалежність між концентрацією нафти у ґрунті та ІС в цих межах (див. рис. 3.2).При концентрації 10% ІС становить 28%, що свідчить про високу токсичністьнафтозабрудненого ґрунту. При вищих концентраціях індекс схожості наближаєтьсядо нуля. Зменшеннясхожості можна пояснити здатністю насіння адсорбувати нафту, яка в свою чергузмінює розвиток метаболічних реакцій, в результаті чого насінина не проростає(Baker, 1970).
Отже, для ІС привмісті нафти 1%, 2,5%, 5%, 6% та 8% спостерігається незначне відхилення відконтролю, тоді як при вищих концентраціях відбувається різке зменшеннякількості пророслого насіння. Показовими є фото дослідних рослин (рис. 3.3).
/>
Рис. 3.2. Індекс схожості насіння льону звичайного (Linum usitatissimumL.) за дії різних концентрацій нафти у ґрунті
Отримані намирезультати свідчать, що динаміка проростання та схожість насіння льонузвичайного (Linum usitatissimum L.) є чутливими та інформативнимитест-реакціями для оцінки токсичності нафтового забруднення ґрунту. Такітест-реакції є перспективними для проведення фітооцінки нафтозабрудненогогрунту, на їх основі можна розробляти методичні рекомендації для фітоіндикаціїнафтозабруднених територій.
3.2 Морфометричні параметри проростків Linum usitatissimum L. яктест-реакції на дію нафтового забруднення ґрунту
Зручнимиоб’єктами для біоіндикації забруднювачів є проростки рослин (Гродзинський,2006; Горова, 2005). Нафтавпливає на всі етапи онтогенезу рослин, серед яких найбільш чутливими єпроростки. При дослідженні фітотоксичності нафти було показано,що нафтове забруднення значно інгібує ріст і розвиток рослин (Киреева, 2007).
Як морфометричнийпоказник ми вимірювали довжину коренів та пагонів проростків та визначалиіндекс кореня (ІК) льону звичайного. Було встановлено, що за дії нафтивідбувається інгібування росту кореня. Індекс кореня при вмісті нафти 1%, 2,5%,5%, 6% зменшується відповідно на 70, 66, 63, 61% щодо контролю (рис. 3.3.). ІКпри цьому слабо змінюється, утворюючи пологе плато. А при вищих концентраціяхвідбувається подальше зменшення ІК: при 8% – на 80%, при 10% — на 94%.Пригнічення росту кореня зумовлене токсичністю нафти, яка через водний розчинвзаємодіє із проростками (Linder at al, 1990). Схожість насіння ілюструє прямийвплив нафти, тоді як довжина проростків є реакцією на опосередкований впливводорозчинних нафтопродуктів. Це свідчить про високу чутливість досліджуваноїтест-реакції та лінійну залежність кривої „доза-ефект”.
Отже, ІК чутливореагує на токсичність нафти. Прямолінійна залежність між індексом кореня таконцентрацією нафти у ґрунті спостерігається на проміжку 6–10% забруднювача. Цедозволяє використовувати ІК при проводити діагностиці вмісту нафти у ґрунті вцьому інтервалі.
/>
Рис 3.3. Індекс кореня льонузвичайного (Linum usitatissimum L.) за дії нафти у ґрунті
Ми такожаналізували таку тест-реакцію, як індекс пагона (ІП). Даний параметр вважаєтьсяменш чутливим, оскільки пагін безпосередньо не контактує із забруднювачем. Атоксичний вплив буде зумовлений міграцією токсикантів від кореня до пагона таствореною концентрацією летких нафтопродуктів у чашці Петрі (Wong, 1999).
Індекс пагонапоступово зменшується із зростанням вмісту нафти у ґрунті (рис. 3.4.). Прислабкому забрудненні нафтою, концентрація 1 та 2,5%, ІП становить відповідно 55та 52 % щодо контролю. Нафта у кількості 5% виявляє більш токсичну дію, про щосвідчить зменшення ІП до 21%. При концентрації токсиканта 6% індекс пагонастановить 16,3%, при 8% – 12,8%, при 10% пагін не розвивається. Показовими єфото дослідних рослин (рис. 3.6).
Отже, ІП чутливореагує на вміст нафти у ґрунті. Із зростанням концентрації нафти від 1% індекспагона поступово зменшується і при 10% забруднення наближається до нуля. Цесвідчить про доцільність використання даної тест-реакції при проведенніфітооцінки токсичності нафтозабруднених ґрунтів.
/>
Рис. 3.4. Індекс пагона льонузвичайного (Linum usitatissimum L.) за дії нафти у ґрунті
Параметр, який об’єднуєІС, ІК та ІП, є індекс проростання насіння (ІПН). Очевидно, даний показник мавби бути найбільш достовірним та інформативним, оскільки інтегрує найтиповішітест-реакції досліджуваного об’єкта. Отриманий індекс проростання дійснонайповніше відображав ступінь токсичності нафти (див. рис.3.9). Так приконцентрації нафти 1% ІПН зменшується до 14,3%, при 2,5% – до 24,5% (рис.3.5.). Вже при низьких концентраціях нафти фіксується значне відхилення щодоконтролю. При послідовному зростанні вмісту нафти до 5%, 6%, 8%, 10% ІПНстановить відповідно 11,1%, 9,2%, 2,6%, 1,4%.
Інтегруваннятест-показники дозволить суттєво збільшити діагностичну продуктивністьтест-системи.
/>
Рис. 3.5. Індекс проростання насіння льонузвичайного (Linum usitatissimum L.)
ВИСНОВКИ
На основіотриманих даних можна зробити наступні висновки:
1. Встановлено,що нафта при низьких концентраціях (1%, 2,5%) сприяє виходу насіння із стануспокою та стимулює проростання насіння Linum usitatissimum L, при високих (5%,6% та 8%, 10%) – пригнічує
2. Індекссхожості різкщ зменшення при високих концентраціях нафти у грунті (10%).
3. Отриманінами результати свідчать, що динаміка проростання та схожість насіння льонузвичайного (Linum usitatissimum L.) є чутливими та інформативнимитест-реакціями для оцінки токсичності нафтового забруднення ґрунту. Такітест-реакції є перспективними для проведення фітооцінки нафтозабрудненогогрунту, на їх основі можна розробляти методичні рекомендації для фітоіндикаціїнафтозабруднених територій.
4. Встановленопрямолінійну залежність між індексом кореня та концентрацією нафти у ґрунті напроміжку 6–10% забруднювача.
5. Встановленолінійну залежність між індексом пагона L. usitatissimum та вмістом нафти уґрунті:
6. Індекспроростання насіння – найбільш достовірний та інформативний параметр, якийзбільшує ефективність та чутливість тест-системи.
7. Досліджуванітест-реакції льонузвичайного (Linum usitatissimum L.) доцільно використовувати при оціненні фітотоксичностінафтозабруд- неного ґрунту, на їх основі можна розроблятиметодичні рекомендації для фітоіндикації нафтозабруднених територій.
ЛІТЕРАТУРА
1. Андресон Р.К., МукатановА.Х., Бойко Т.Ф. Экологические последствия загрязнения почв нефтью // Экология.– 1980. – №6. – С. 21-25.
2. БрагинськийЛ. П. Методологические аспекты токсикологического биотестирования на Daphniamagna Str. и других ветвистоусых ракообразних (критический обзор) // Гидробиол.журн. − 2000.− Т.36, №5. − С.50
3. Гідроекологічнатоксикологія та біоіндикація забруднень / За ред. Олексіва І. Г., БрагінськогоЛ. П. − Львів: Світ, 1995− 440с.
4. Горова А. І., Скворцова Т.М., Клімкіна І. І, Павличенко, А. В., Бучавий Ю. В. Цитогенетичний моніторингдовкілля та здоровя людини // Вісн. Укр. Тов-ва генетиків і селекціонерів. –2005. – Т. 3, №1-2. – С. 36-47.
5. Грищенко О.М. Ботаническиеаномалии как поисково-разведочный критерий нефтегазоносности // Экология. –1982. — № 1. — С. 18-22.
6. ГродзинськийД.М., Шиліна Ю.В., Куцоконь Н.К., Михєєв О.М., Гуща М.І., Коломієць О.Д.,Фалінська Т.П., Овсяннікова Л.Г., Кутлахмедов Ю.О., Пчеловська С.В.Застосування рослинних тест-систем для оцінки комбінованої дії факторів різноїприроди. – К.: Фітосоціоцентр, 2006. — 60 с.
7. Гродзинский А.М. и др.Прямые методы биотестирования почвы и метаболитов микроорганизмов //Аллелопатия и продуктивность растений: Сб.науч.тр. АН УССР. — К.: Наук. думка,1990. – С. 121-124.
8. Екологічне право України.Академічний курс: Підручник. / За заг. Ред. Ю. С. Шемчушенка. − К.:Юридична думка, 2008. − С. 195.
9. Изменение численности иповеденческих реакций дождевых червей Lumbricus rubellus Hoffmeister в условияхзагрязнения почв нефтьюНаучно-исследовательский институт биологии и биофизикипри Томском государственном университете 634050 Томск, просп. Ленина, Сибирскийэкологический журнал, 2004, № 4, с. 463-466
10. Израэль Ю.А., Гасилина Н.К.,Ровинский Ф.Я. Система наблюдений и контроля загрязнений природной среды в СССР// Метеорология и гидрология, – 1978. – № 10. – С. 5-12
11. Козлов К.С. Дождевые черви– биоиндикационный тест почв загрязненных нефтью // Материалы докладовмежрегиональной научно-технической конф. «Научная сессия ТУСУР». – Томск, 2002.Ч.3. – С. 136-138.
12. Киреева Н.А., Кабиров Т.Р., Дубовик И. Е. Комплексное биотестирование нефтезагрезньонних почв //Екология. – 2007. – №5..
13. Киреева Н.А.Фитотоксичность антропогенно-загрязненных почв / Н.А. Киреева, Г.Г. Кузяхметов,А.М.Мифтахова, В.В.Водопьянов. – Уфа Гилем, 2003.
14. КучеренкоМ.Є. Бабенюк Ю.Д., Войціцький В.М. Сучасні методи біохімічних досліджень. – К.:Укрсоціоцентр, 2001. – 424 с. .
15. Никифорова Е.М., СолнцеваН.П., Кабанова Н.В. Геохимическая трансформация дерново-подзолистых почв подвоздействием нефти // Влияние промышленных предприятий на окружающую среду. — М.: Наука, 1987. — С. 241-253.
16. Оборин А.А., КалачниковаИ. Г., Масливец Т.А. и др. Нефтяное загрязнение почв и способы рекультивации //Влияние промышленных предприятий на окружающую среду. – М.: Наука, 1987. – С.284-290.
17. Определитель высшихрастений Украины // Под ред. Д.Н. Доброчае- ва, М.И.Котова, и др. – К.: Наук.думка, 1987. – 548 с.
18. Пиковский Ю.И., ГеннадиевА.Н., Чернянский С.С., Сахаров Г.Н. Проблема диагностики и нормированиязагрязнения почв нефтью и нефтепродуктами // Почвоведение. — 2003. — №9. — С.1132-1140.
19. Саксонов М. Н., АбалаковА. Д., Данько Л. В., Бархатова О. А., Балаян А. Э., Стом Д. И. Экологическиймоніторинг нефтегазовой отрасли.Физико-химические и биологические методы: учеб.пособие. – Иркутск: Иркут. ун-т, 2005. – 114 с.
20. Семенов С.М., ФилипповаЛ.М. Прогнозирование состояния биоты в системе экологического мониторинга //Комплексный глобальный мониторинг загрязнения окружающей природной среды. ТрудыII Международного симпозиума. – Л.: Гидрометеоиздат, 1982,. – С. 364-370Гидрометеоиздат, 1976. – С. 181-191
21. Cтроганов Н. С. Методикаопределения токсичности водной среды / Н.С. Строганов // Методики биологическихисследований по водной токсикологии. / Под ред. Строганова Н. С. – М.: Наука,1971. – С. 14-60.
22. Терек О.І. Ріст рослин: навч. посібник / О.І. Терек. – Львів: Видавничий центр ЛНУ ім. ІванаФранка, 2007. – 247 с.
23. Трублаевич Ж.М. Оценкатоксичности почв с помощью лабораторной культуры коллембол / Ж.М. ТрублаевичЖ.М., Е.Н. Семенова // Экология, 1997. – №5.
24. Химия нефти / Под ред. З.И. Сюняева. — Л.: Химия. – 1984. — С. 5-25.
25. Цайтлер М.Й. Видовий складугруповань, що формуються як результат заростання територій, забрудненихнафтопродуктами // Мат. першої наук. конф. молод. учен. „Наукові основизбереження біотичної різноманітності”. – Львів: Ліга-Прес. – 2000. – Вип. 1. — С. 101-105.
26. Цайтлер М.Й. Відновленнярослинного покриву і зміни структури ценопопуляцій трав’яних рослин нанафтозабруднених територіях Бориславського нафтового родовища: Автореф. дис…канд. біол. наук: 03.00.16 / Дніпропетровськ, 2001. – 16 с.
27. Цайтлер М.Й. Екологічнінаслідки довготривалого нафтовидобутку на Бориславському нафтовому родовищі //Праці НТШ. (Екологічні проблеми Львівщини). – Львів, 2000. – №7. — С. 84-90.
28. Baker, J.M. The effect of oils on plants // Environ. Polut. − 1970. −1:27 –P. 44.
29. Banks M.K. and Schultz K. E. Comparison of plants for germination toxicity tests inpetroleum contaminated soil // Water, Air, and Soil Pollution.−2005. −167:211– P. 219
30. CarterM.R. Concepts OfSoil Quality //Soil Quality is in the Hands of the Land Manager. – 1996 – P. 5-10/
31. Chaıneau,C.H., Morel, J.L., Oudot, J. Phytotoxicity and plant uptake of fuel oilHydrocarbons// Journal of Environmental Quality. − 1997.−Vol.26. −P. 1478-1483.
32. CornelisA.M., Eline E. Van Der Hoke, S. Bouwens, B. Rusch, R. Kronenburg, and G.Stokman. The use of acute and chronic bioassays to determine the ecologicalrisk and bioremediation efficiency of oil-polluted soils // EnvironmentalToxicology and Chemistry. – 2001. –Vol. 20, No. 7. –P. 1438–1449.
33. DoranJ.W., Sarrantonio M., Liebig M. Soil health and sustainability // Advances inAgronomy. – 1996 – Vol. 56. – P. 1–54.
34. Henner,P., Schiavon, M., Druelle, V., Lichtfouse, E. Phytotoxicity of ancient gas worksoils. Effect of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) on plant germination//Organic Geochemistry. −1999. −Vol.30. −P.963-969.
35. Hund-RinkeK., Achazі R., Rоmbke J., Warnecke D. Avoidance test with Eisenia fetida asindicator for the habitat function of soils: results of a laboratory comparisontest // J Soils & Sediments– 2003 12).– Vol. (1) 7 – Р. 77.
36. Karlen,D.L., Mausbach, M.J., Doran, J.W., Cline, R.G., Harris, R.F., Schuman, G.E.,.Soil quality: a concept, definition, and framework for evaluation // SoilSci. Soc. Am. J. – 1997 – Vol. 61 – P. 4–10.
37. Keddy C.J., Greene J.C., Bonnell M. A… Review of whole organism bioassays: Soil,freshwater sediment and freshwater assessment in Canada // Ecotoxicol EnvironSaf – 1995 – Vol. 30 – P. 251.
38. KоrdelW., Rоmbke J. Requirementson physical, chemical and biological testing methods for estimating the qualityof soils and soil substrates // J. Soils'& Sediments – 2001 – Vol. (2) 98.– P. 98.
39. Linder,G., Greene, J. C., Ratsch, H., Nwosu, J., Smith, S., and Wiborn, D. (). Seed germination androot elongation toxicity tests in hazardous waste site evaluation. In Plantsfor Toxicity Assessment: Second Volume.– 1990 – pp. 177-187.
40. Pedrozo,M.F.M.; Barbosa, E.M.; Corseuil, H.X.; Schneider, M.R.; Linhares, M.M… Ecotoxicologiae avaliaçao de risco do petróleo: Centro de Recursos Ambientais.– 2002 –/>246p
41. Pezeshki,S. R.; Hester, W.; Lin, Q.; Nyman, J. A… The effects of oil spill and clean-upon dominant US Gulf coast marsh macrophytes: a review // Environ. Poll. –2000–. v. 108, 129-139 p.
42. Smith, M.J.; Flowers, T. H.; Duncab, H. J.; Alder, J… Effects of polycyclic aromatichydrocarbons on germination and subsequent growth of grasses and legumes infreshly contaminated soil with aged PAHs residues // Environ. Poll. – 2006 –Vol. 141, № 519 – P. 25.
43. Stom D.I.Effect of Individua Phenolic Compounds and their Mixtures on LiminousBacterial. // Acta hydrochimikal et hydrobiologica Part 1-4 / Ed. By D.I. Stom,T.A. Geel, A.E. Balayan – Part 1-4 – 1986. – Vol. 14, № 4. – P. 332-337.
44. Teaca C.A., Bodirlau R., Toxicity assay assessment // Bioresourses − 2008 −Vol.3 (4) − P. 1130-1145.
45. Wang X.,Bartha R. Effects of bioremediation on residues, activity and toxicity in soilcontaminated by fuel spills // Soil Biochem. – 1990. – Vol. 22. – P.501–505.
46. Wang, W.and J.M. Williams.Screening and biomonitoring of industrial effluents using phytotoxicity tests// Environ. Toxicol. Chem. – 1988 – Vol. 7. –P. 645-652.