ВЫПУСКНАЯ РАБОТА
БАКАЛАВРАПРИКЛАДНОЙ ФИЗИКИ
Конструированиебиосенсора для регистрации P.aeruginosa АТСС 27853
СОДЕРЖАНИЕ
ПЕРЕЧЕНЬУСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
РАЗДЕЛ1. Биосенсоры
1.1 Механизмы,которые обеспечивают селективность и выборочность биосенсоров
1.2 Биосенсоры- принципы конструирования
1.3 Применениебиосенсоров
РАЗДЕЛ2. Материалы и методы
2.1Автоматический вычислительно-измерительный компьютеризированный комплекс дляисследования биоэлектрохимических межфазных границ
2.2Электрохимическая ячейка
2.3Электроды
2.4Очистка и подготовка растворов
2.5Стратегия создания биосенсора для регистрации P.AERUGINOSA АТСС 27853
РАЗДЕЛ3. Результаты исследований
ВЫВОДЫ
СПИСОКЛИТЕРАТУРЫ
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
ITO– оксид индия
Red–ox– окислительно — восстановительная реакция
ЦВАЗ — циклическаявольтамперная зависимость
АСКМ – антигенсыворотки крови мышей
ДЭС – двойнойэлектрический слой
ВВЕДЕНИЕ
Регистрация патогенныхмикроорганизмов в растворах электролитов является одним из основных заданиймедицины, биохимии и электрохимического анализа. С этой целью в миреразрабатываются биосенсорные устройства, которые дают возможность достаточнобыстро и избирательно регистрировать патогенные штаммы микроорганизмов. Для этогоиспользуют потенциометрию, амперометрию и другие электрохимические методы.Важным элементом биосенсора является ионпроводящая мембрана, содержащаябиологически активные компоненты. Синтез высоко проводящих наноразмерных потретьей координате полимерных платформ, структур, пленок или мембран дляконструирования биосенсоров реализуют различными способами. В зависимости отпоставленной задачи используют твердотельные ионообменные мембраны [1], электрохимическисинтезируемые полимерные платформы [2, 13], электрохимическую самосборкуполимолекулярных слоев с использованием α,ω–тиольного компоновщика [2,3].Разработка и внедрение в медицинскую практику новых биосенсоров отечественногопроизводства на основе недорогих отечественных комплектующих с использованиемих для регистрации сигнала импеданса, фарадеевской емкости, поляризационногосопротивления, тока, стохастических спектральных шумовых или электромагнитныхсигналов межфазной границы электрод/биообъект является задачей чрезвычайноактуальной и своевременной.
РАЗДЕЛ 1. Биосенсоры1.1 Механизмы, которые обеспечивают селективность ивыборочность биосенсоров
Рассмотрим три типабиосенсоров — спектроэлектрохимический, ферментативный амперометрический ирезистометрический (кондуктометрический). Биосенсоры — разновидность химическихсенсоров — часто обладают отличной селективностью благодаря специфичностибиологических реакций, но в них есть недостаток — малый срок службы. Применениехимически селективных мембран в известной мере снижает посторонние препятствия.Увеличение селективности к определенному анализируемому раствору или классутаких растворов достигается путем использования спектроэлектрохимии химическиселективных пленок [4], которые наносят на поверхность электрода. В этом случаедля определения агента последний должен быть: 1) распределятся в пленке,которая обладает химической выборочностью; 2) окисляться или восстанавливатьсяна поверхности электрода при заданном потенциале; 3) его окисленная иливосстановленная форма должна поглощать свет некоторой заданной длинны волны,используемой для определения. На рисунке 1 показана схема, котораядемонстрирует работу спектроелектрохимического биосенсора.
/>
Рисунок 1. Схема оптоэлектрохимическогобиосенсора. Обозначение: (Ä-вещества, которые проникают в пленку; Æ– вещества, которые проникают в пленку, но не поддаются Red–oxпревращениям; o – вещества, которые проникают впленку и поддаются Red–oxпревращениям и дают сигнал, но не на «аналитической» длине волны; ►– вещества, которые проникают в пленку и поддаются Red–oxпревращениям, продукты которых дают сигнал на «аналитической» длиневолны).
На правую боковуюстенку волновода нанесена тонкая пленка оксида индия (ITO),которая представляет собой оптически прозрачную поверхность. На нее наноситьсятонкая мешка ионселективной пленки, которая обладает химической выборочностью.Свет, который проходит по оптическому волноводу в каждой точке, где происходитотражение, вызывает исчезающе слабое поле, которое проникает в пленку.Взаимодействие этого поля с анализируемым веществом в пленке приводе кзатуханию света, который проходит по волноводу. Оно связано с концентрациейанализируемого вещества в пленке, которая выполняет две важных функции:
1 — она предварительноконцентрирует анализируемое вещество вблизи поверхности электрода, и может бытьопределена спектроэлектрохимически в режиме нарушенного полного внутреннегоотражения;
2 — она способствуетустранению препятствий со стороны других веществ, поскольку слабое полепроникает на такую малую глубину, что оптический «пробник» касаетсятолько того вещества, которое находится в середине пленки. На практикеанализируемое вещество, распределенное в пленке, можно зарегистрировать лишь вслучае если оно вступает в Red–oxреакцию на поверхности электрода, что приводит к поглощению света на «аналитическойдлине волны». Его модулируют путем электрохимического циклирования междупоглощающими и не поглощающими состояниями вещества. Рассмотрим работуферментативного биосенсора [5]. На рисунке 2 показана схема генерации сигналапри ферментативном катализе, который используется для регистрациимикробиологического субстрата.
/>
Рисунок 2. Схема генерациисигнала в амперометрическом ферментативном электроде, где Ф — фермент, М — медиатор, С — субстрат, П — продукт.
Фермент состоит изодной или больше пептидных цепей, которые образуют третичную структуру,стабилизированную электростатическими взаимодействиями, водородной связью идисульфидными мостиками. Его каталитическая активность связана с активнымцентром, где идет реакция. Она специфическая в силу уникальной пространственнойконфигурации и заряда этого центра. Ферменты реагируют с субстратом последующей схеме:
E + S /> ES /> P + E, (1)
где: Е — фермент, S- субстрат фермента и Р — продукт ферментативной реакции. Кинетика этогопроцесса детально проанализирована Михаелисом — Ментеи [6]. Скоростьобразования или исчезновения продукта описывается следующим уравнением:
–(dS/dP) = (dP/dt) = (ks[E][S])/([(k2+ k3)/k1] + [S]) = (Vmax[S])/(Km +[S]), (2)
где: Vmax – максимальная скоростьферментативной реакции, Km – константа Михаелиса. При инверсии уравнения (2) оно позволяет получитьзависимость Ханеса:
(1/V) = (Km/Vmax[S]) + (1/Vmax).(3)
Эти уравнения позволяют определить концентрацию количества субстрата, иликоличества фермента, которые участвуют в каталитической реакции.
В ферментативныхамперометрических биосенсорах обычно измеряется скорость поглощения кислородаили разряда ферментативной реакции, которая нарабатывается в ходе реакций:
лецитин + Н2Про /> холин+ фосфористая кислота, (4)
холин + ПРО2 + 2Н2Про /> бетаин + 2Н2ПРО2, (5)
где: ChOx-фермент холиноксидаза.
Иммобилизацияферментов необходима для того, чтобы увеличить стабильность измерений, сделатьболее эффективную связь ферментативной реакции с преобразователем, локализироватьреакцию в одном сенсоре, сделать возможными непрерывные измерения и доступнымих математический анализ.
Иммобилизацию ферментовпроводят ионообменом или ковалентным связыванием, поперечной сшивкой (сетка)или удерживанием в ловушках (молекулярные решетки, микроинкапсуляция).Ковалентное связывание наиболее эффективно из всех методов сохраненияактивности и увеличения долговечности ферментов. Достаточно важным является исвязывание фермента с мембраной через соответствующие функциональныегруппировки. Локализация ферментативной реакции — также один из наиболее важныхмоментов в технологии создания сенсоров. Появилась возможность локализоватьферментативную реакцию там, где это наиболее выгодно: на мембране илинепосредственно на электроде, где прямая реакция протекает без диффузионныхограничений. Возможность непрерывных измерений обеспечивается отсутствиемнеобходимости замены фермента, в котором можно регенерировать после окончанииреакции. Содержание ферментов в гелях достаточно детально описано дляферментов, встроенных в агарозу. Ферменты специфическим образом познаютсубстрат, косубстрат, кофактор, активатор и ингибитор. Ферменты способныосуществлять множество превращений с одинаковой эффективностью. Действиеферментов может приводить к мощному увеличению сигнала, который регистрируется.Ферменты могут быть иммобилизированы.
К резистометрическимсенсорам относят биосенсоры, в которых информационный сигнал пропорционаленактивной составляющей электрохимического импеданса Zна высокой частоте f. При высоких fкомплексная диаграмма Арганда вырождается в точку на действительной осиимпеданса ReZ и практически равняетсясопротивлению раствора Rр.На рисунке 3 приведена схема тонкопленочного резистометрического биосенсора,использованного в работе [7], для определения глюкозы и мочевины путемизмерения проводимости G в крови при частоте переменного тока f = 10 кГц.
/>
Рисунок 3. Схемаизмерения проводимости тонкопленочного биосенсора, где I- рабочий электрод, II — электродсравнения.
В ходе экспериментаавторы измеряли зависимость амплитуды исходного сигнала от концентрациисубстрата. Для создания биоматрицы готовили растворы фермента и БСА в 20 ммкалий-фосфатном буфере с рH=7,4с конечными концентрациями 50-100 мг/моль и смешивали в соотношении 1:1,соответственно. Каплю смеси «фермент + БСА» наносили на поверхностьодной пары электродов. На поверхность второй пары наносили раствор чистого БСА(электрод сравнения). Для полимеризации электроды окунали в атмосферунасыщенных паров глутарового альдегида на 30 мин., потом подсушивали мембранына воздухе. Сигнал от электрода с мембраной БСА, которая расположена на том жекристалле, вычитался из сигнала на электроде с ферментативной мембраной.Разработанный биосенсор позволил определить глюкозу и мочевину в крови.
Во многих случаях длявыявления биологической (в первую очередь, ферментативной) активности бактерийможно использовать амперометрические системы проточного инжекционного анализа иминиатюрные электрохимические детекторы. В этих случаях необходимоиспользование перистальтического насоса. Повышение скорости омывающего рабочийэлектрод анализируемого потока раствора приводит к увеличению регистрируемогосигнала [8].1.2 Биосенсоры — принципы конструирования
биосенсорселективность биоэлектрохимический раствор
При конструированиитонкослойных биосенсоров стоит учитывать четыре основных фактора: 1) химическуюи физическую природу ионселективной пленки; 2) характеристики оптическихматериалов; 3) особенности конструирования электрохимической ячейки; 4) типаппаратуры, которая регистрирует.
Ионселективная тонкаяпленка должна обеспечивать предыдущее концентрирование анализируемого вещества,подавление препятствий со стороны сопутствующих веществ, быть оптическипрозрачной на измерительной длине волны света и электрохимически неактивной вопределенном диапазоне потенциалов. При этом она не должна вступать вхимическое взаимодействие с подкладкой из ITO,должна быть тонкой и однородной. Две из наиболее часто используемых подкладокпредставляют собой оксид кремния (SiО2),который готовится по методу «золь-гель», и поливиниловий спирт.Используют также нафионные пленки или ядерные лавсановые фильтры без добавок [9].В них вводят иономеры, которые создают ионообменные кластеры. В качествеиономеров используют полати(диметил диалиламмониевый хлорид) — ДД, полати(винилбензилтриметиламмоный хлорид) — ВТХ, четвертичный полати(4-винилпиридин) 4В иполиакриловую кислоту — ПК. Оптимальная толщина пленки, которую наносят, 400 — 700 нм. Ранее (рис. 3.) представлена схема, которую рационально использоватьпри конструировании такого биосенсора. В литературе описаны сенсоры дляопределении аммиака и хлора с калиевым ионообменным стеклом ВК7, используемым вкачестве оптически прозрачного плоского волновода. Возможности биосенсорнойхарактеристики биологических, физико-химических, биохимических,биоматематических и фармако-клинических реакций поистине не ограниченные.1.3 Применение биосенсоров
Наряду с созданиемновых поколений биосенсоров для определения токсичных газов [10],полиэлектролита [11], разрабатываются полимерные платформы для энзимов, ДНКэлектродов [12]. В последнее десятилетие получили развитие работы, направленныена создание микробных биосенсоров с иммобилизированными бактериями [6].Разрабатываются зонды для идентификации нуклеиновых кислот и другихмакромолекул (рис. 4) [6, 13].
/>
Рисунок 4. Золотоймногоэлектродный сенсор для определения множественного взаимодействияантиген-антитело.
Электрохимическуюимпедансную спектроскопию (ЭИС) в соединении с золотыми рабочими массивами(рис. 4) использовали для определения множественных взаимодействийантиген-антитело. Характеристики биосенсора определялись поверхностью антигенагепатита В (HbsАg).Участок биосенсора был подготовлен в результате иммобилизации антител напокрытую молекулами поверхность электродов. Были получены линейные зависимостисопротивления переноса электронов и концентрации HbsАgв диапазоне от 10 пкг•моль–1 до 1 нг•моль-1 с границейвыявление 10 пкг• моль-1. Последующее развитие получили работы посозданию глюконометров [13]. Для анализа соединения крови непосредственно вартериях и венах уже используется новое поколение иглообразных электродов излегированных сталей и индивидуальных индифферентных металлов (Au,Pt, Ti,Mo) специальной конструкции [14]. Однимиз перспективных направлений развития биосенсорных технологий естьиспользование в них высокопроводящих полимерных пленок, которые удерживаюткомплексы с переносом заряда на основе солей TCNQ[15].
РАЗДЕЛ 2. Материалыи методы2.1 Автоматический вычислительно-измерительныйкомпьютеризированный комплекс для исследования биоэлектрохимических межфазныхграниц
Для проведения экспериментабиоэлектрохимии необходимы как медленная регистрация вольтамперных ихроноамперных зависимостей, с чем, естественно, справляется потенциостат ПИ50.1.1 укомплектованный потенциометрами марок ЛКД или ППД, которые пишут, так иих быстрая регистрация. Однако, поскольку механизм записи циклическойвольтамперной зависимости (ЦВАЗ) потенциометрами марок ЛКД или ППД являетсямеханическим, то скорость быстродействия их небольшая и, естественно, они немогут перекрыть весь рабочий диапазон работы потенциостата ПИ 50.1.1,управляемого от внешнего генератора П – 8. При необходимости регистрации ЦВАЗсо скоростями развертки потенциала, которые превышают 0.1 В/c,с достаточно высокой точностью, эти измерения оказываются искаженными и ихнедопустимо использовать для анализа экспериментальных результатов. В даннойработе нами предложен подход, который дает возможность превратить потенциостатПИ 50.1.1 с программатором ПР–8 в высокоэффективный автоматическийвычислительно-измерительный компьютеризированный комплекс (рис. 5) дляисследования электрохимических и биоэлектрохимических межфазных границ ирегистрации ЦВАЗ. С этой целью мы использовали осциллограф RigolDC1022, который обладает необходимыми характеристиками. На вход Yмы вводим токовый сигнал j,на вход X сигнал напряжения U.В зависимости от целей эксперимента сигнал синхронизации может быть задан отлюбого из 8 шагов программатора. Запись экспериментальных данных осуществляетсяв файл. Записываются триады–время t,ток j и поляризация Е.
/>
Рисунок 5.Автоматический вычислительно-измерительный компьютеризированный комплекс дляисследования электрохимических и биоэлектрохимических межфазных границ.
На примере измеренийциклических вольтамперных зависимостей для разных межфазных границ, в широкомдиапазоне потенциалов поляризации и скоростей развертки по потенциалу,проверена работоспособность предложенной установки. Использование осциллографа RigolDC 1022 позволило (рис. 5) перекрытьвесь рабочий диапазон параметров потенциостата ПИ 50.1.1.2.2 Электрохимическая ячейка
Для єкспериментаиспользовалась специально сконструированная фторопластоваяэлектрохимическая ячейка, показанная на рисунке 6. Она отвечает всемтребованиям, предъявляемым к измерениям электрохимических вольтамперных,хроноамперных и поляризационных исследований. Ячейка полностью герметична ипредназначена для разнообразных нанобиоэлектрохимических исследований винертной атмосфере аргона или гелия марки о.с.ч.
/>
Рис. 6.Герметизированная ячейка для нанобиоэлектрохимических измерений: 1 – рабочийэлектрод; 2 – тефлоновая втулка; 3 – вспомогательный электрод; 4 – тефлоновыйстакан; 5 – тефлоновая крышка; 6 – ввод для гелия; 7 – капилляр для отводагазов; 8 – стеклянный капилляр Лугина–Гебера; 9 – мешалка; 10 – электродсравнения; 11 – компенсационный электрод.
Перед измерениямифторопластовую ячейку промывали раствором хромовой смеси, 1 М раствором Н2SO4, 24 ч. вымачивали в бидистиллированной воде, промывалираствором «пираньи» [16] для снятия всех органических загрязнений ипотом трижды промывали дистиллированной водой.
Электрохимическаяячейка (рис. 6.) с четырьмя электродами: рабочим игольчатым Ptс поверхностью 0.53 см2; основным вспомогательным Pt,расположенным в отдельном отсеке, с площадью поверхности 0.45 см2,диаметром 0.5 мм; вторым вспомогательным Pt – электродом, который использовалсядля увеличения быстродействия работы потенциостата. Электродом сравнения служилстандартный серебрянохлорный электрод сравнения (х.с. э.) с Ест =0.226 В при 20 °С, находящийся в дополнительном отсеке и соединенный с отсекомрабочего электрода через тефлоновый шлиф, во избежание влияния Сl– –ионов на электродный процесс. В качестве стандартного раствора длясеребрянохлорного электрода использовали раствор насыщенного хлористого калия.Все потенциалы в данной работе приведены относительно х.с.э. 2.3Электроды
Как материалы,используемые в подкладках сенсорных электрохимических устройств, используютчистые Pt, Au,SiО2 и графитовыематериалы квалификации о.с.ч. 00 или о.с.ч. 000. Биосенсоры для особых целейсодержат подкладки из сверхчистых монокристаллов металлов или оксидов, которыесодержат ориентированы индексные грани, например Pt(001), Pt (010) или Pt(111). Pt обладает рядомдостоинств, таких как воспроизводимость электрохимических свойств поверхностиэлектрода, возможность эффективного снятия с её поверхности адсорбированныхпримесей, широким электрохимическим окном – широкой двойнослойной областьюпотенциалов в растворах индифферентных электролитов (малые токи заряжания). Подготовказаключалась в выдержке Pt00 в течении 20 мин. в концентрированной HNO3,в тщательном промывании в бидистилляте. После этого снятие органическихпримесей и физических загрязнений осуществляли в растворе пираньи 1:1 (H2SO4конц/Н2О2 35%) при времени выдержки 40 мин, Т=200С.Эта процедура приводила к повышению активности поверхности Pt–электрода. Такаяобработка дала возможность снять адсорбированные вещества с поверхностиэлектрода, растворить поверхностный оксид, стандартизировать подготовкуэлектродов и добиться воспроизводимости измерений.
Для очистки Au и Ptэлектродов от загрязнений и органических примесей, антител и антигеновиспользовали раствор «пираньи», который включал сернуюконцентрированную кислоту H2SO4 и перекись водорода H2O2в соотношении 8:3. Электроды выдерживали в этом растворе в течение 30 минут при40 0С.
Активацию Au и Ptэлектродов проводили в растворе концентрированной азотной кислоты. 2.4Очистка и подготовка растворов
Все использованные вэкспериментах реактивы Kсl, Nа2нро4, Нno3 были марки х.ч. Растворыготовили на дистиллированной воде. Очистку растворов осуществляли наложениемпрямоугольных импульсов потенциала на рабочий электрод от потенциостата ПИ50.1.1, на внешний вход которого от внешнего программатора ПР–8 подавалисьуправляющие импульсы напряжения прямоугольной формы.С помощью дозатора UNI 2010 готовилирастворы АСКМ (сыворотки крови мышей, вакцинированныхбелковым полисахаридом фракцией синегнийной палочки) в PBS.Объем фонового раствора электролита PBSв ячейке составлял 40 мл.
Все измеренияпроводились при 20 0с.В качестве фонового раствора электролита был выбран фосфатный буферный раствор(PBS) следующего состава: 8 г/л NaСl,0,2 г/л KСl,1,44 г/л Na2НРО4,0,24 г/л KН2РО4,рН = 7,4, приготовленный на бидистиллированной воде. Все потенциалы в работеприведены относительно стандартного серебрянохлорного электрода сравнения.2.5 Стратегия создания биосенсора для регистрации P.AERUGINOSAАТСС 27853
Основываясь на мировыхфундаментальных исследованиях создания и конструирования биосенсорных системдля регистрации разных бактериальных штаммов и экспериментальных работах [17-26]для создания биосенсора на P. aeruginosa АТСС 27853 была предложена следующаяструктурная схема построения трандьюсера:
/>
Рисунок 7. Структурнаясхема построения трандьюсера.
РАЗДЕЛ 3. Результатыисследований
На рисунке 8 показанасхема созданного нами биосенсора на P.aeruginosaАТСС 27853 с наноразмерной по координате электрохимической реакции биохимическиактивной мембраной.
/>
Рисунок 8. Схемакомпановки биосенсора с нанопреходами по координате электрохимической реакциидля регистрации P. aeruginosaАТСС 27853.
Взаимодействиеантиген-антитело приводит к изменению электростатических характеристик ДЭС,следствием чего является рост тока во внешней цепи электрохимической ячейки.
Поскольку большая долябиосенсоров, в состав которых входит трандьюсер, является электрохимическимиустройствами, то их работоспособность и воспроизводимость измеряемых данных взначительной мере зависит от материала рабочего электрода, его чистоты. Длямассового производства биосенсоров можно использовать Ptо.с.ч. 00 и Au о.с.ч. 00.
Нами проведено изучениеэлектрохимического поведения Ptо.с.ч. 00 и Au о.с.ч. 00 в фосфатномбуферном растворе (PBS), которыйиспользовался в качестве поддерживающего электролита. На рис. 9 показаны ВАХ(вольтамперные характеристики) от межфазной границы раздела Pt/PBS в зависимости от скоростиразвертки (V/s)по потенциалу Е. При медленных развертках ЦВАЗ имеет один катодный максимумтока на катодной волне, а сами токи являются токами заряжения. С увеличением скоростиразвертки величина регистрируемых токов увеличивается, а токи определяютсяэлектрической емкостью ДЭС (двойного электрического слоя) межфазной границы.При больших скоростях развертки по потенциалу на ЦВАЗ не наблюдается токовыхмаксимумов, а анодный и катодный ток плавно увеличивается или уменьшается взависимости от потенциала. Анодная и катодная зависимости ВАХ обусловлены двумяпроцессами заряжения. Ptпосле подготовки активная, на что указывают большие анодные и катодные токиэлектродных процессов, которые реализовываются на ней. Однако форма и характерэтих кривых указывает на то, что она находится в состоянии окисления. Нарисунке 9 показаны ЦВАЗ при малых скоростях развертки по потенциалу в увеличенноммасштабе по сравнению с рисунком 10. При самой медленной скорости развертки попотенциалу в диапазоне от 0.000 до 0.800 В через межфазную границу текутнаноамперные токи, указывая на хорошую поляризуемость Ptэлектрода и на то, что для анодной волны протекают лишь токи заряжения.
/>
Рисунок 9.ЦВАЗ Pt/PBS. Рабочий электрод Pt00. S = 0.53 см2.Электрод сравнения хлорсеребряный. Насыщен.KСl.Крутизна1 мА/V.1 – V/s = 5•100; 2 – V/s = 5•10-1; 3 – V/s = 5•10-2;4 – V/s = 5•10-3.
Параметры потенциостата: mV T mV S (V/s) шаг 1 10 с шаг 5 1100 5·10(0) шаг 2 1 с шаг 6 5·10(0) шаг 3 1 с шаг 7 1100 5·10(0) шаг 4 1 с шаг 8 -300 5·10(0)
/>
Рисунок 10. ЦВАЗPt/PBS. Рабочий электрод – Pt 00. S= 0.53 см2.Крутизна1 мА/V.3 – V/s = 5·10-2; 4 – V/s = 5·10-3.
Параметрыпотенциостата:/> mV t /> mV S (V/s) шаг 1 10 с шаг 5 1100 5·10(-2) шаг 2 1 с шаг 6 5·10(-2) шаг 3 1 с шаг 7 1100 5·10(-2) шаг 4 1 с шаг 8 -300 5·10(-2)
ЦВАЗ, полученную на Pt00 после обработки в растворе концентрированной HNO3и обработанную дополнительно в растворе пираньи, мы сравнили с ЦВАЗ, полученнойна Pt 00 после обработки в растворецарской водки и обработанной в растворе пираньи (рис. 10). Сравнение кривых «1»,«2» и «3» показывает, что в последнем случае поверхностныйоксид снят с поверхности Pt00, а ЦВАЗ, полученная в последнем случае, имеет два максимума тока. Первый, припотенциале 0,03 В, второй при потенциале 0,10 В характерных для адсорбцииразных форм водорода в растворах кислот как на чистой платине, так и на разныхиндексных гранях в соответствии с работами Делахея. После нанесения наповерхность Pt 00 наномолекулярногослоя антитела к P. aeruginosaАТСС 27853 активность Pt00 электрода подавляется рис.11, кривая «3». При катодных потенциалахвосходящая ветвь ЦВАЗ на Ptэлектроде, который содержит 2 наноразмерных слоя антител совпадает свосходящими кривыми «1», «2». При анодных потенциалах этаже кривая 3 совпадает с кривой 4 как на восходящем, так и на нисходящем,участках ЦВАЗ. Таким образом, наноразмерный 2-молекулярный слой антителмодифицирует поверхность Ptэлектрода и ограничивает минимальные токи, которые проходят через эту границукак в анодной области, так и в катодной. К этому факту мы вернемся позже, приобсуждении взаимодействия этой модифицированной межфазной границы с антигенами P.aeruginosa АТСС 27853. Важнымявляется также тот факт, что на катодной волне пиков тока восстановления оксидаPt ни в одном из данных случаев ненаблюдается. Это указывает на то, что поверхность Ptэлектрода ни в одном из них не окисляется. Форма и ход ЦВАЗ в фосфатном буферезависит лишь от токов заряжения межфазной границы и обусловлена ориентациеймолекул воды, ионов гидроксония и ОН – групп на поверхности электрода иколичеством этих частей, которые вошли в ДЭС.
/>
Рисунок 11. ЦВАЗ Pt/PBS. Рабочий электрод Pt00. S = 0.53 см2.Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки V/s= 5·100. 1 – чистая Ptобработанная в растворе конц. HNO340 мин. и потом в растворе пираньи; 4 – чистая Ptобработанная в царской водке 10 мин., затем в растворе пираньи; 3 – Pt/2 наномолекулярных слоев ІМ АСКМ/ PBS;2 – чистая Pt обработанная в царскойводке, в растворе конц. HNO3 40 мин., затем в растворе пираньи.
Параметрыпотенциостата:/> mV t /> mV S (V/s) шаг 1 10 с шаг 5 1100 5·10(0) шаг 2 1 с шаг 6 5·10(0) шаг 3 1 с шаг 7 1100 5·10(0) шаг 4 1 с шаг 8 -300 5·10(0)
/>
Рисунок 12. ЦВАЗ Pt/PBS. Рабочий электрод – Pt00. S = 0.53 см2.Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки V/s= 5·100. а: 1 – в чистом PBS(pH = 7,4); 2 – с добавкою 0.32 млраствора антигенов P.aeruginosa АТСС 27853 у PBS, τ = 1 мин.; 3 – 15 мин.
Параметрыпотенциостата:/> mV T /> mV S (V/s) шаг 1 10 с шаг 5 1100 5·10(0) шаг 2 1 с шаг 6 5·10(0) шаг 3 1 с шаг 7 1100 5·10(0) шаг 4 1 с шаг 8 -300 5·10(0)
Представляло интересопределить, изменяет ли характеристики ЦВАЗ, полученные на чистой Pt,введение в фосфатный буфер антигенов P.aeruginosa АТСС 27853. На рисунке12 показаны, как ЦВАЗ, полученная от межфазной границы Pt/PBS, (рис. 12. линия «1»),так и ЦВАЗ после введения в исходный раствор антигенов P.aeruginosa АТСС 27853 (рис. 12,линии 2, 3). Следует подчеркнуть, что данные, представленные на рис. 12 линией «1»и линиями «2» и «3», получены в независимых экспериментах.Из этого следует, что введение в исходный раствор антигенов приводит кпоявлению на анодных и катодных ветвях ЦВАЗ соответственновольтамперометрических максимумов окисления и восстановления антигенов P.aeruginosa АТСС 2785. Сувеличением времени контакта с электродом ток в их пиках растет. Адсорбцияпродуктов превращения P.aeruginosaАТСС 2785 при потенциалах положительней пика окисления и отрицательней пикавосстановления растет, на что указывает уменьшение соответствующих токов всравнении с токами, которые протекают в этих областях потенциалов в системе Pt/PBS. Адсорбция этих продуктов с ростомвремени выдержки платины в растворе растет.
Таким образом,присутствие Red/oxмаксимумов на ЦВАЗ, а, следовательно, и наличие стандартной ЭДС однозначноуказывает на то, что они обусловлены именно введением в чистый растворфосфатного буфера антигенов P.aeruginosa АТСС 27853. Следствиемналичия Red/oxпотенциала является то, что антигены P.aeruginosa АТСС 27853 в раствореэлектролита находятся в двух формах и непрерывно переходят друг в друга.Поэтому мы однозначно можем записать это динамическое равновесие в форме:
OxP.aeruginosaАТСС 27853 + ē = RedP. aeruginosaАТСС 27853.(6)
Таким образом,выясняется, что антигены P.aeruginosa АТСС 27853 в растворенаходятся в двух разно заряженных Redи Ox формах, и именно эти формыпереходят друг в друга, соударяясь из Ptиндифферентным электродом, который является лишь переносчиком электронов междуними. Данные рисунка 12 позволяют найти стандартную ЭДС этой цепи:
/>.(7)
Из курса электрохимииизвестно, что каждая электрохимическая редокс пара имеет свой, строго постоянныйпотенциал. Следовательно, стандартная ЕДС
/>
это прирожденноесвойство редокс форм антигенов P.aeruginosa АТСС 27853. Этоважнейший признак, по которому может быть определено в электрохимическойсистеме наличие антигенов P.aeruginosa АТСС 27853. В сущностиPt электрод уже является биосенсоромна антиген P. aeruginosaАТСС 27853. Однако чувствительность такого биосенсора к ионам антигенов мала исоставляет 1 ÷ 5•10–6 М•л–1. В тоже время такойбиосенсор не является избирательным по отношению к антигенам P.aeruginosa АТСС 27853, посколькуна таком электроде в случае наличия в системе посторонних антигенов и другихзаряженных примесей могут начать протекать большие токи, которые замаскируютредокс пики от антигенов P.aeruginosa АТСС 27853.
Создаваемый намиреальный эффективный биосенсор должен быть избирательный именно к антигенам P.aeruginosa АТСС 27853. С этойцелью необходимо так модифицировать рабочую поверхность биосенсора, чтобы онабыла избирательна лишь к анализируемому антигену и давала бы аналитическийсигнал по крайней мере в 10 раз превышающий сигнал, полученный от чистогоэлектрода Pt. Ниже мы опишем роботумодифицированных Pt и Auподкладок, которые нам удалось получить, и которые являются избирательными иболее чувствительными по отношению к антигенам P.aeruginosa АТСС 27853.
Кроме Рt-подкладки длясоздания биосенсора нам предсталяется возможным использовать Au индифферентныйэлектрод. В работе мы использовали два Au электрода: плоский электрод с большойповерхностью (S = 1.04 см2) и малый цилиндрический с площадью равной0.306 см2.
На рисунке 13 показаныэкспериментальные ЦВАЗ, полученные в фоновом электролите на маломцилиндрическом Au 00 электроде взависимости от скорости развертки потенциала. Они указывают на то, чтопрохождение тока через межфазную границу Au/PBS сложнее, чем для межфазной границыPt/ PBSрассмотренной выше.
/>
Рисунок 13. ЦВАЗ Au/PBS. Рабочий электрод – Au00. S = 0.306 см2.Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки: 1 – V/s = 5·100; 2 – V/s = 5·10-1;3 – V/s = 5·10-2.
Параметрыпотенциостата:/> mV T /> mV S (V/s) шаг 1 10 с шаг 5 1100 5·10(0) шаг 2 1 с шаг 6 5·10(0) шаг 3 1 с шаг 7 1100 5·10(0) шаг 4 1 с шаг 8 -300 5·10(0)
Аналогичная картинанаблюдается и для Аu-электрода сбольшой поверхностью, данные для которой показаны на рисунках 14 – 15 приразных скоростях развертки по потенциалу.
/>
Рисунок 14. ЦВАЗ Au/PBS. Рабочий электрод – Au00. S = 1.04 см2.Электрод сравнения хлорсеребряный. Насыщенный KCl.Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки: 1– V/s = 5·100; 2 – V/s = 5·10-1; 3 – V/s = 5·10-2.
Параметрыпотенциостата:/> mV T /> mV S (V/s) шаг 1 10 с шаг 5 1100 5·10(0) шаг 2 1 с шаг 6 5·10(0) шаг 3 1 с шаг 7 1100 5·10(0) шаг 4 1 с шаг 8 -300 5·10(0)
При малых скоростяхразвертки по потенциалу межфазная граница Au/PBS приближается по своимэлектрохимическим свойствам к межфазного границе Pt/PBS, хотя пик тока при потенциале0,24 В (х.с.е.) присутствует на ЦВАЗ, но величины тока слабо зависят отпотенциала при минимальной скорости развертки по потенциалу.
Для того чтобы понять,насколько чисто выполняется наш биоэлектрохимический эксперимент достаточносравнить измерения ЦВАЗ выполненные на большом и малом
/>
Рисунок 15. ЦВАЗ Au/PBS. Рабочий электрод – Au00. Крутизна 1 мА/V. 1 – Sб= 1.04 см2; 2 – Sм=0,306 см2. Скорость развертки V/s = 5·100.
Параметрыпотенциостата:/> mV T /> mV S (V/s) шаг 1 10 с шаг 5 1100 5·10(0) шаг 2 1 с шаг 6 5·10(0) шаг 3 1 с шаг 7 1100 5·10(0) шаг 4 1 с шаг 8 -300 5·10(0)
На рисунке 15представлено такое сравнение при одинаковых экспериментальных условиях и приодинаковой скорости развертки по потенциалу при пересчете ЦВАЗ на единичнуюплощадь Аu-электродов. Полученныекривые практически совпадают. На большом пластинчатом электроде Auболее выразительно выражен токовый максимум.
Некоторые отличия ввеличинах токов наблюдаем при анодных потенциалах. Такие небольшие отличияможно объяснить разной гидродинамикой и разным вкладом краевых эффектов навеличину распределения тока на электродах с разной конфигурацией. Необходимотакже учесть то, что пластинчатый электрод не равнодоступен для тока, которыйпротекает через его разные участки. В целом же наблюдается практически полноесовпадение этих ЦВАЗ. Таким образом, в наших экспериментах достигнута оченьвысокая чистота, воспроизводимость и точность экспериментальных данных.
Эта зависимость токовуказывает на то, что нанесение на Ptи Au электроды 2 наномолекулярных слоевантител вполне достаточно для того, чтобы межфазная граница стойкофункционировала как датчик биосенсорного устройства. При этом мера заполненияповерхности Pt и Auэлектродов двумя мономолекулярными слоями равняется 1, то есть вся поверхностьмодифицированных Pt и Auэлектродов закрыта антителами и внешней электродной поверхностью уже являютсяконцы молекул антител к P.aeruginosa АТСС 27853. Созданиена поверхности Au электродамономолекулярных и полимолекулярных поверхностных слоев позволяет впритыкподойти к получению биосенсоров. В соответствии с выбранной стратегией мынанесли на поверхность пластинчатого электрода Ptс помощью специальных методов 2 наномолекулярных слоев антител АСКМ ииммобилизировали их к поверхности подкладки. ЦВАЗ снимали в фосфатном буферномрастворе. На рисунке 16, линия «2» показывает отзыв межфазной границыPt/ 2НАНО ИМ АСКМ / PBSна зондирование ее треугольными импульсами напряжения. Для сравнения на этом жерисунке (линия «2») приведена ЦВАЗ, полученная на чистом Ptэлектроде.
/>
Рисунок16. ЦВАЗPt/2НАНОІМАСКМ/PBS. Рабочийэлектрод — Pt 00. S= 0.53 см2. Крутизна 1 мА/V.Скорость развертки V/s= 5·100. 1 – чистая Pt(х = 0); 2 – Pt с х = 4НАНО ІМ АСКМ.
Параметрыпотенциостата:/> mV T /> mV S (V/s) шаг 1 10 с шаг 5 1100 5·10(0) шаг 2 1 с шаг 6 5·10(0) шаг 3 1 с шаг 7 1100 5·10(0) шаг 4 1 с шаг 8 -300 5·10(0)
Из сопоставления этихданных выходит, что 2 мономолекулярных слоя нанесенных на Рt-подкладкуприводят к понижению токов что протекают через межфазную границу Pt/2НАНО ИМ АСКМ/ PBS. При этом всяЦВАЗ от межфазной границы Pt/2НАНО ИМ АСКМ/ PBS расположенавнутри ЦВАЗ от межфазной границы Pt/PBS. Такое уменьшение токов в случаеЦВАЗ(2) обусловлено наличием на поверхности Ptподкладки хорошо связанных с ней антител АСМК, которые образуют физическийбарьер с определенным сопротивлением. Таким образом, падение прилагаемогонапряжения происходит уже не только в области ДЭС, но и в наномолекулярнойпленке. Именно оно определяет падение тока на межфазной границе Pt/2НАНО ИМ АСКМ/ PBS по сравнению с Pt/PBS. Наиболее большие отклонения отисходной ЦВАЗ наблюдаются при катодных потенциалах как на ниспадающей, так и нарастущей, ветвях ЦВАЗ. При анодных потенциалахэти ветви ЦВАЗ практически совпадают.
/>
Рисунок17. ЦВАЗ Pt/2НАНОІМАСКМ/PBS. Рабочийэлектрод — Pt 00. S= 0.53 см2. Крутизна 1 мА/V.Скорость развертки V/s= 5·100. 1 – без P.aeruginosa АТСС 27853; 2 – с P. aeruginosaАТСС 27853, τ = 5 мин
Параметрыпотенциостата:/> mV t /> mV S (V/s) шаг 1 10 с шаг 5 1100 5·10(0) шаг 2 1 с шаг 6 5·10(0) шаг 3 1 с шаг 7 1100 5·10(0) шаг 4 1 с шаг 8 -300 5·10(0)
На рисунке 17представлена ЦВАЗ (линия «2»), полученная от межфазной границы Pt/2НАНО ИМ АСКМ/ PBS через 5 мин.после введения в раствор фосфатного буфера антигенов P.aeruginosa АТСС 27853. Введениеантигенов в систему приводит к росту токов при катодных потенциалах нисходящейи восходящей ветвей ЦВАЗ. Однако ожидаемых вольтамперометрических максимумов наней не наблюдается. Поэтому рабочий электрод мы выдержали в PBSна протяжении 18 час. После этого опять произвели регистрацию ЦВАЗ.
/>
Рисунок 18. ЦВАЗ Pt/2НАНО ІМ АСКМ/ PBS. Рабочийэлектрод — Pt 00. S = 0.53 см2.Насыщенный KCl. Крутизна 1 мА/V. Скорость развертки V/s = 5·100.1 –без антигенов P. aeruginosaАТСС 27853; 2 – с P.aeruginosa АТСС 27853, τ = 5 мин.; 3 – с P. aeruginosaАТСС 27853, τ = 18 часов.
Параметрыпотенциостата:/> mV t /> mV S (V/s) шаг 1 10 с шаг 5 1100 5·10(0) шаг 2 1 с шаг 6 5·10(0) шаг 3 1 с шаг 7 1100 5·10(0) шаг 4 1 с шаг 8 -300 5·10(0)
Эти данные представленына рисунке 18 линией «3». Как видно из рисунка, при 0.380 В наанодной ветви ЦВАЗ появился вольтамперометрический максимум тока, а в катодномцикле этой же кривой образуется вольтамперометрический максимум токавосстановления антигенов P.aeruginosa АТСС 27853 при 0.130В. Найденная из этих данных стандартная ЕДС равна 0.250 В. При сравнении ее сполученной раньше ЕДС для этой же Red/oxсистемы на чистом электроде Ptи пренебрегая Нернстовским концентрационным членом, получаем их практическиполное совпадение. В то же время, токи анодного и катодного максимумов болеечем в шесть раз превышают аналогичные токи для вольтамперометрическихмаксимумов, полученных на чистой Pt.Для того, чтобы убедиться, что ток от биосенсора не меняется во времени мыпродолжили измерения ЦВАЗ в этой системе. Все параметры измеренныхвольтамперных зависимостей стойко повторяются в последующих циклахсканирования.
/>
Рисунок19. Pt/2НАНОІМАСКМ/PBS .
Рабочий электрод — Pt00. S = 0.53 см2.Электрод сравнения хлорсеребряный. Насыщенный KCl.Крутизна 1 мА/V. Скорость разверткиV/s = 5·100. 1 – Pt/PBS; 2 – Pt/2НАНО ІМ АСКМ/ PBS; 3 – + антигены P. aeruginosaАТСС 27853, τ = 5 мин.;4 – τ = 18 ч.; 5 – τ = 23ч.;6 – τ = 24ч.; 7 – τ = 25ч. 45 мин.
Параметрыпотенциостата:/> mV t /> mV S (V/s) шаг 1 10 с шаг 5 1100 5·10(0) шаг 2 1 с шаг 6 5·10(0) шаг 3 1 с шаг 7 1100 5·10(0) шаг 4 1 с шаг 8 -300 5·10(0)
На рисунке 19 показаныЦВАЗ, полученные при больших временах выдержки Pt/2НАНО ИМ АСКМ в PBS, которыйсодержит P. aeruginosaАТСС 27853. Для токов ЦВАЗ, показанных на этом рисунках, в анодной и в катоднойобластях потенциалов экспериментальные кривые как перед вольтамперометрическимипиками, так и за ними спадают и приближаются к току, полученному на этом жебиосенсоре при отсутствии антигенов P.aeruginosa АТСС 27853. Этот фактявляется следствием того, что поверхность Ptподкладки модифицирована наномолекулярными слоями антител АСМК, а ониизбирательно отзываются лишь на взаимодействие комплементарных антиген –антитело. Таким образом, свойства биосесора определяют не Ptэлектрод и его структура электронных уровней, а наномолекулярный слой антителАСМК и их электронные уровни. Оказалось, что величина тока анодных и катодныхпиков непрерывно растет с ростом времени нахождения биосенсора в фосфатномбуферном растворе что содержит P.aeruginosa АТСС 27853: Pt/ 2НАНО ІМ АСМК/ PBS, P.aeruginosa АТСС 27853 (8)
В электрохимическихсистемах такой рост тока во времени наблюдается лишь для автокаталитическихпроцессов. Такая же зависимость скорости реакции от концентрации субстратахарактерна для ферментативных реакций и подчиняется кинетике Михаелиса–Ментен [7].
Оказывается, что ивзаимодействие комплементарного наноразмерного слоя антител АСМК, определеннымобразом ориентированных в ДЕС, с ионами антигенов синегнойной палочки можетбыть описано аналогичного вида зависимостями (см. раздел 1.1.).
ВЫВОДЫ
1. Установлено,что при определенных условиях биологически активные антитела или антигеныпринимают участие в процессе электрохимической самосборки наномембраны наинертных подкладках без участия α, ω-тиольного компоновщика.
2. Вработе продемонстрирована возможность использования двухмерных наномембран наоснове фрагментов F(AB`)2 FITC.как части устройства биосенсора длярегистрации иммунного отклика антигенов АСКМ.
3. НаPt и Auэлектродах получены наномолекулярные пленки антител и антигенов. Проведенныеисследования и анализ ЦВАЗ в системе Pt/2 наномолекулярных иммобилизованих слоев антител (сыворотки крови мышей,вакцинированных белковым полисахаридом фракцией синегнийной палочки, – АСКМ) в PBSз pH = 7,4, + х М P. aeruginosa АТСС27853 (Pt/ антитело/антиген).
4. Обнаруженыкатодные и анодные пики токов специфического взаимодействия антитела с антигенамиP. aeruginosa АТСС 27853.
5. Обнаруженыкатодные и анодные пики токов взаимодействия антигена P. aeruginosa АТСС 27853в системе «чистая Pt/ PBS».
6. Сконструированонанобиосенсор относительно комплементарного антигена P. aeruginosa АТСС 27853 иразработан электрохимический метод лабораторной индикации P. aeruginosa АТСС27853.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Чмиленко Ф.О., Худякова С.М. Осмій–селективні електроди наоснові метилтіопірондимеркаптидів. //Науковий вісник Черновецького університету. V Украинский съезд по электрохимии.Химия. 2008.– Випуск 401. – С. 199 – 201.
2. КовальчукЄ.П., Яцишин М.М., Ковалишин Я.С. Речовина в інтерфазі. Фізичнахіміятонкихплівок.ЛНУ.Львів.2005. 225 с.
3. Хансен А.Г.,Вакербарт Х., Нильсен Дж.У., Жан Ж., Кузнецов А.М., Ульструп Е. Межфазныйэлектронный перенос в наномасштабе и с участием отдельной молекулы. //Электрохимия. 2003. – Т. 39. – В. 1. – С. 117 – 128.
4. Хейнеман, У.Р. Разработка новых тонкослойныхспектроэлектрохимических сенсоров, избирательность которых реализуется тремяспособами, и их применение [Текст]/ У.Р. Хейнеман, К.Дж. Селискар, Дж.Т. Ричардсон//Электрохимия. — 2003. – Т. 39. – В. 8. – С.982 – 993.
5. Шеллер, Ф. Ферменты в электрохимическихбиосенсорах [Текст] / Ф. Шеллер, Д. Кирштайн, Ф. Шуберт, Д. Пфайффер, К. МкНейл //Электрохимия. — 1993. – Т. 29. – В. 12. – С. 1522 –1527.
6. Сикейра, Ц.А.К. Перспективы сенсоров дляоценки биологически индуцируемой агрессивности среды [Текст]/ Ц.А.К. Сикейра //Электрохимия. — 1993. – Т. 29. – В. 12. – С. 1541 –1553.
7. Шульга, А.А. Тонкоплёночныекондуктометрические энзимобиосенсоры для определения глюкозы и мочевины в крови[Текст]/ А.А. Шульга, С.В. Дзядевич, А.П. Солдаткин, С.В. Пацковский, Н.Ф.Стародуб, В.И. Стриха, А.В. Ельская //Электрохимия. — 1993. – Т. 29. – В. 8. –С. 998 – 1002.
8. Хитченс, Г.Д. Измерение бактериальнойактивности методом медиаторной амперометрии в проточно-инжекционной системе[Текст]/ Г.Д Хитченс, Д. Ходко, Д.Р. Миллер, О.Дж. Мурфи, Т.Д. Роджерс//Электрохимия. — 1993. – Т. 29. – В. 12. – С. 1534 – 1540.
9. Тарасевич, М.Р. Электрохимическиебиосенсоры [Текст]/ М.Р. Тарасевич, В.А. Богдановская, Г.В. Жутаева//Электрохимия. — 1993. – Т. 29. – В. 12. – С. 1554 – 1560.
10. Чвірук, В.Досягнення та перспективи розвитку у галузі електрохіммічних сенсорів длямоніторингу повітряного середовища [Текст] / В. Чвірук /Труды III съезда поэлектрохимии. Вістник Львівського університету.- 2002. – В. 42. – Ч. 1. – С.178 –181.
11. Чмиленко, Ф.Хімичні сенсори як засоби екологічного контролю вмісту поліелектролітів уводних розчинах [Текст] / Ф. Чмиленко, І. Коробова, О. Мікуленко /Труды IIIсъезда по электрохимии. Вістник Львівського університету. — 2002. – В. 42. – Ч.1. – С. 178 –181.
12. Ковальчук,Є.П. Полімерні платформи для ензимних електродів [Текст] / Є.П. Ковальчук,Б.Б.Остапович, З.Л.Турик, Є. Блажейовський /Труды IV съезда по электрохимии. Вістник ХНУ.2005. – № 648. – С. 68 – 71.
13. Курись,Я. Матрична електрополімеризація – метод одержання поліанілину та поліпіролу,які чутливі до амінокислот [Текст] / Я.Курись, Н.Нетяга, В.Походенко /Труды III съезда по электрохимии. ВістникЛьвівського університету. -2002. – В. 42. – Ч. 1. – С. 138 – 141.
14. Масконе, Д.Иглообразные глюкозные биосенсоры для мониторинга IN VIVO [Текст] / Д.Масконе, Х.Яманака, М.Масчини//Электрохимия. -1993. – Т.29. – № 12. – С. 1528 – 1533.
15. Александров, Ю.Імпедана синтетичних металів на основі солей TCNQ [Текст] / Ю. Александров, О.Поспєлов,О.Шепеленко, А. Кравченко, Г. Камарчук //Труды III съезда по электрохимии.Вістник Львівського університету.- 2002. – В. 42. – Ч. 1. – С. 124 – 126.
16. Ge B., Huang Y.–C., Sen D., Yu H.Z.Electrochemical investigation of DNA-modified surfaces: From quantitationmethods to experimental conditions. // J. Electroanal. Chem. 2007.– V. 602. –P. 156 – 162.
17. Джелали, В.В.БИОСЕНСОРЫ. /В.В. Джелали, А.Ю. Волянский. // Анналы Мечниковского института.2006. – № 3. – С. 16 – 34.
18. Джелали, В.В.Механизм аномального растворения сталей. / В.В. Джелали, С.В. Нестеренко. //Украинский химический журнал. 2007. – Т. 73. – № 6. – С. 114 – 118.
19. Jelali,V.V. Semiconducting properties of DNA nanomolecular layer. /V.V. Jelali, A. Yu.Volyanskiy. // International Scientific Conferece. «Physical and ChemicalPrinciples of Formation and Modification of Micro- and Nanostructures»FMMN’2007.P. С. 26 – 28.
20. Jelali,V.V. Formation mechanism of semiconductor nanostructures. /V.V. Jelali, S.V. Nesterenko.// International Scientific Conferece. «Physical and Chemical Principlesof Formation and Modification of Micro- and Nanostructures»FMMN’2007. P.35 – 37.
21. Джелали, В.В.Полупроводниковые свойства наномолекулярного слоя ДНК. /В.В. Джелали, А.Ю.Волянский. // Физическая инженерия поверхности. Том 5, № 3 – 4, С. 172 – 185.2007.
22. Джелали, В.В.Образование полупроводниковой наноструктуры на поверхности аустенитной стали./В.В. Джелали, С.В. Нестеренко. // Физическая инженерия поверхности. Том 5, № 3– 4, С. 228 – 237. 2007.
23. Джелали, В.В.Фундаментальний зв'язок між діелектричною проникністю і перенапруженням велектрохімічних системах. /В.В. Джелали, А.Ю. Волянский. // Науковий вісникЧерновецького університету. Химия. 2008. – Випуск 401, С. 44 – 46.
24. Джелали, В.В.Зміна коефіцієнтів перенесення заряду в ході електрохімічних реакцій. /В.В.Джелали. // Науковий вісник Черновецького університету. Химия. 2008. – Випуск399 – 400, С. 59 – 61.
25. Джелали, В.В.Нелінійні опори перенесення заряду електрохімічних реакцій. /В.В. Джелали. //Науковий вісник Черновецького університету. Химия. 2008. – Випуск 401, С. 41 –43.
26. Джелали, В.В.Исследование взаимодействия «антиген — антитело» на межфазной границе наномембрана из фрагментов овечьихантител к Ig G мышей/ 0,3 M KСl + 0,05 M Na2НРО4 + y μл антигена сыворотки крови мышей. /В.В. Джелали, А.Ю.Волянский, Л.И. Глазунова, А.В. Мартынов, Т.П. Осолодченко, Л.В. Клемчук. //Анналы Мечниковского института. 2009. – № 1. – С. 28 – 34.