На правах рукописи ЛАВРЕНТЬЕВА Ирина НиколаевнаШТАММ «ОРЛОВ – Д» ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ03.00.06 – вирусологияА в т о р е ф е р а т Диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наукМосква - 2009 гРабота выполнена в ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека^ Научный консультант:Доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН Жебрун Анатолий БорисовичОфициальные оппоненты:Доктор биологических наук, профессор, академик РАМН Зверев Виталий ВасильевичДоктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Лашкевич Василий Андреевич Доктор медицинских наук, профессор Подчерняева Раиса Яковлевна ^ Ведущее учреждение: ФГУН «Московский научно-исследовательский Институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человекаЗащита состоится «19» июня 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН (142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита).С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова (142782, Московская обл., п/о Институт полиомиелита).Автореферат разослан «_______» мая 2009 г.Ученый секретарь диссертационного совета,кандидат биологических наук О.А. Медведкина^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность проблемы Стратегический план Европейского регионального бюро ВОЗ на 2005 – 2010 г.г. определяет борьбу с врожденной краснухой (ВК) в числе приоритетов и предусматривает элиминацию эндемичной краснухи и снижение заболеваемости ВК в странах региона до уровня менее 1 случая на 100 тыс. живых новорожденных (целевая программа «Здоровье для всех в XXI веке»). В странах, где достигнут высокий охват населения профилактическими прививками против краснухи, эта задача успешно решается [Best, Banatlava, 2006]. В Российской Федерации иммунизация против краснухи детей первого – второго года жизни введена в календарь профилактических прививок приказом МЗ РФ от 27.12.97 г. № 375. В связи с отсутствием отечественной вакцины, прививки проводятся зарубежными препаратами, зарегистрированными в установленном порядке [Бектемиров, 2004]. Их действующим началом является вакцинный штамм Wistar RA27/3 (автор – S. A. Plotkin). В настоящее время, согласно приказу Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 30.10.2007 г. № 673, плановой иммунизации подлежат дети в возрасте 12 месяцев, 6 лет и девочки 13 лет; дополнительной – в рамках реализации Национального проекта в области здравоохранения – все дети от 1 до 17 лет не болевшие, не привитые или однократно привитые против краснухи; а также девушки 18 – 25 лет, не болевшие и не привитые ранее. C 1999 г., когда был зарегистрирован максимальный уровень заболеваемости краснухой (399,0 на 100 000 населения), этот показатель снизился более чем в 10 раз (21,7 на 100 000 населения в 2007 г.), что, в целом, свидетельствует об эффективности вакцинопрофилактики инфекции. В то же время, специфическая профилактика краснухи в России связана с рядом проблем и вопросов, которые требуют изучения. В Государственном докладе «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (2007 г.) Главного государственного санитарного врача РФ Г.Г. Онищенко констатируется, что регламентированный ВОЗ 95 % уровень охвата ревакцинирующими прививками в стране не достигнут. Среди заболевших краснухой наметилась тенденция к увеличению доли взрослого населения, в том числе женщин репродуктивного возраста. Как отмечает Г.Г. Онищенко, отсутствие отечественной вакцины сдерживает охват прививками всех подлежащих вакцинации контингентов. Изолированный на территории Российской Федерации вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов» (автор – В.Н. Мешалова) был получен в г. Ленинграде под руководством академика А.А. Смородинцева в 70-ые годы XX века и депонирован в ГКМВ в 1979 г. Клинические испытания экспериментальных серий вакцины, созданной на его основе, показали высокую иммуногенную активность (100 % сероконверсий в группе серонегативных привитых, СГТ АТ – 8,1 lg2), низкую реактогенность препарата (1 % клинических реакций средней тяжести) [Мешалова и др., 1979]. В 1995 г., в рамках реализации Федеральной целевой программы «Вакцинопрофилактика» (руководитель программы – А.А. Ясинский), вакцинный штамм «Орлов» был восстановлен нами до исходных показателей биологической активности, сертифицирован в ГИСК им. Л.А.Тарасевича как вакцинный и получил наименование «Орлов-В» [Лаврентьева и др., 2003 г]. В большинстве стран, где осуществляется специфическая профилактика краснухи, преобладает циркуляция вирусов первой генетической линии, к которой принадлежит и вакцинный штамм Wistar RA27/3. Россия определена экспертами ВОЗ, как единственная территория с эндемичным распространением вирусов генотипа 2с [WHO, Wkly epidemiol. report, 2005]. Несмотря на высокое антигенное родство различных штаммов вируса краснухи, выделенных в разных регионах мира [Десятскова, 1974., Зверев и др. 2002], филогенетические изменения вируса под прессом коллективного иммунитета представляются возможным событием и создают потенциальную угрозу возникновения его дрейфовых вариантов со значимыми мутационными изменениями генома, как это отмечено, в частности, в отношении вакцинных полиовирусов в ходе реализации программы ликвидации полиомиелита живой оральной вакциной [Облапенко, 2003, Онищенко и др., 2008]. Однако в отечественной научной литературе до последнего времени не было работ, посвященных изучению адаптационной изменчивости вируса краснухи в период вакцинопрофилактики инфекции; а также – определению генетической принадлежности штамма «Орлов-В». Не было работ по определению генетической близости между современными штаммами и изолятами вируса краснухи, циркулирующими на территории РФ, и вакцинными штаммами, полученными более 30 лет тому назад. Не проводилась сравнительная генетическая характеристика отечественного и зарубежного вакцинных штаммов вируса краснухи. Решение этих вопросов представляет не только научный интерес, но и имеет непосредственное отношение к эффективности и безопасности специфической профилактики краснухи на территории Российской Федерации. Штамм «Орлов-В» получен на первичной культуре клеток ППК. Использование в качестве тканевого субстрата в производстве вакцины первично-трипсинизированных клеточных культур усложняет технологию получения вакцины, затрудняет стандартизацию качественных характеристик конечного продукта, повышает себестоимость препарата. Более экономичным, технологичным, стабильным по биологическим свойствам клеточным субстратом для производства МИБП являются полуперевиваемые (диплоидные) линии клеток человека, рекомендованные экспертами ВОЗ для производства, в частности, вакцины против краснухи [Серия технических докладов ВОЗ, № 28, 1989]. При проведении в России массовой иммунизации детского населения и селективной вакцинации взрослых, существенное значение приобретает экономическая составляющая кампании. Использование для профилактики краснухи отечественного препарата, полученного на диплоидной линии клеток человека, позволило бы, ориентировочно, снизить затраты только на дополнительную иммунизацию населения в рамках реализации национального проекта «Здоровье» в 1,7 раза и сэкономить около 187 млн. рублей. При проведении плановой иммунизации экономия составила бы около 64 млн руб. ежегодно (в ценах 2008 г.). Экономическое преимущество такого препарата определяет актуальность разработки, так как его внедрение будет способствовать повышению охвата прививками всех декретированных контингентов и совершенствованию профилактики СКВ. Вместе с тем, адаптация вируса к иной системе клеток-продуцентов может сопровождаться мутациями вирусного генома с изменением молекулярно-генетических свойств полученного варианта. Для оценки пригодности более технологичного варианта вакцинного вируса необходимо определить его генетическую стабильность in vitro, а также, в опытах in vivo – сохранность основных биологических свойств, характеризующих штаммы для живых вакцин: специфическую и иммунологическую безопасность; специфическую активность. Вышеизложенное свидетельствует об актуальности настоящего исследования и служит основанием для получения варианта эндемичного для России вакцинного штамма вируса краснухи, адаптированного к более технологичному тканевому субстрату, и его всестороннего изучения.^ Цель работы: Создание на основе вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов» кандидата в вакцинный штамм и определение возможности его использования для профилактики краснухи на территории России. ^ Задачи исследования:Провести сравнительный генетический анализ вакцинных штаммов вируса краснухи и современных штаммов и изолятов вируса.Определить возможные филогенетические изменения вируса краснухи в период вакцинопрофилактики инфекции.Оценить чувствительность ряда диплоидных линий клеток к вирусу краснухи и получить вариант исходного вируса краснухи, адаптированный к диплоидной культуре клеток «М-22» (штамм «Орлов-Д»). Провести сравнительный генетический анализ штаммов Wistar RA27/3 и «Орлов-Д».Оценить возможность использования диплоидной культуры клеток «М-22» в качестве тканевого субстрата для получения вакцины против краснухи. Изучить генетические изменения вируса краснухи в процессе аттенуации в культуре клеток ППК и при его адаптации к диплоидной линии клеток «М-22».Исследовать в опыте на обезьянах макака-резус специфическую безопасность штамма «Орлов-Д», включая контагиозность.Определить в испытаниях на обезьянах макака-резус специфическую и протективную активность штамма «Орлов-Д».9. Изучить влияние иммунизации препаратом из штамма «Орлов-Д» на показатели врожденного иммунитета обезьян. ^ Научная новизна и теоретическая значимость исследования: Впервые получены новые знания: - о генетической принадлежности вакцинного штамма «Орлов-В», о генетических маркерах, характеризующих ослабленные варианты вируса краснухи; - о более тесном генетическом родстве штамма «Орлов-В» и российских изолятов вируса краснухи, чем это присуще штамму Wistar RA27/3; - об адаптационной изменчивости вируса краснухи в период вакцинопрофилактики инфекции; В ходе исследования получен новый вариант вакцинного штамма «Орлов», адаптированный к более технологичному тканевому субстрату – штамм «Орлов-Д». Впервые проведена сравнительная генетическая характеристика штаммов «Орлов-Д» и Wistar RA27/3 и установлены различия между штаммами в высоко консервативной области белка Е1, отвечающей за поливалентную иммуногенную активность вируса. Впервые разработаны технологические подходы к получению живой ат-тенуированной краснушной вакцины на основе штамма «Орлов-Д» и ди-плоидной культуры клеток кожно-мышечных фибробластов человека «М-22». Впервые в эксперименте получены сведения о специфической безопасности штамма вируса краснухи «Орлов-Д», включая отсутствие контагиозных свойств, а также данные о высоких показателях его иммуногенной активности и протективности, не уступающие по этим критериям препарату сравнения – штамму Wistar RA27/3; доказана иммунологическая безопасность штамма. Эти результаты являются научным обоснованием перспективности использования штамма «Орлов-Д» для профилактики краснухи в России. ^ Практическая значимость: Получение нового аттенуированного штамма для живой вакцины против краснухи и разработка способа получения вакцины на технологичном тканевом субстрате создает реальные предпосылки для получения вакцины против краснухи на основе эндемичного для России штамма вируса, что будет способствовать совершенствованию профилактики краснухи и СВК на территории Российской Федерации.^ Положения, выносимые на защиту: 1. Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В» идентифицирован как вирус генотипа 2с, эндемичный для территории РФ, и генетически более близок к циркулирующим на территории России изолятам вируса краснухи, чем вакцинный штамм Wistar RА27/3. Вакцинопрофилактика краснухи вызывает филогенетические изменения возбудителя. 2. Выбор диплоидной линии клеток фибробластов кожно-мышечного лоскута эмбриона человека «М-22» для получения штамма «Орлов-Д» обусловлен чувствительностью указанной культуры клеток к вакцинному штамму вируса краснухи, аналогичной чувствительности клеточной культуры ППК, использованной для аттенуации штамма «Орлов», а также наличием банка посевных клеток «М-22», рекомендованных ГИСК им. Л.А. Тарасевича для производства вакцинных препаратов. Данная культура клеток является технологичным субстратом и пригодна для промышленного выпуска краснушной вакцины. 3. Аттенуация штамма «Орлов» вируса краснухи в первичной культуре клеток ППК сопровождается значимой мутацией в структуре гена Е1. В процессе многократного пассирования штамма «Орлов-Д» в диплоидной культуре клеток «М-22» сохраняется его генетическая стабильность. Доклиническое изучение штамма «Орлов-Д» на обезьянах макака – резус специфической безопасности, специфической активности и иммунологической безопасности свидетельствует о его пригодности для получения вакцины против краснухи.Внедрение результатов исследования в практику:1. Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В». Депонирован в ГКМВ (№ 2326 от 04.04.1995 г.); свидетельство об аттестации штамма в ГИСК им. Л.А. Тарасевича № 01-33/8 от 29.03.95 г.2. Штамм вируса краснухи «Орлов-Д». Депонирован в ГКМВ (№ 2347 от 29.12.1998 г.). 3. Штамм вируса краснухи «Лебедев». Депонирован в ГКМВ (№ 2365 от 17.12.2004 г.).4. Изоляты вируса краснухи, выделенные на территории Пермского края. Депонированы в коллекцию Международного генетического банка Национального центра биотехнологической информации (Национальный институт здоровья, США) (№№ EF210064 - EF210075 от 21.04.07 г.).5. Патент на изобретение РФ № 2081912 «Вакцинный штамм вируса краснухи Орлов-В». Приоритет от 22.05.1995 г. 6. Патент на изобретение РФ № 2173344 «Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-Д» и способ получения вакцины против краснухи». Приоритет от 28.06.1999 г.Инструкция по изготовлению и контролю живой культуральной краснушной вакцины. Рассмотрена и одобрена Ученым Советом ФГУ «Санкт-Петербургский НИИЭМ имени Пастера Министерства здравоохранения Российской Федерации» (протокол № 10 от 14.11.2001г.) и утверждена директором Института 14.11.2001 г.Апробация работы и публикации: Основные результаты исследовательской работы доложены и обсуждены на 18 научных форумах и конференциях: на юбилейной конференции НИИЭМ им. Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 1995 г.) ; на Международной конференции «XXXI Dani preventive medicine» (Nis, 1997 г.), на Международной конференции «Modern Vaccinology»» (г. Уфа, 1996 г.); на II Международной научной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г.Санкт-Петербург, 1998 г.); на Международной конференции «XXXII Dani preventive medicine» (Nis, 1998 г.), на научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения академика В.Д. Белякова «Достижения отечественной эпидемиологии в XX веке. Взгляд в будущее» (г. Санкт-Петербург, 2001 г.); на Международной научной конференции «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы» (г. Санкт-Петербург, 2003 г.); на научно-практической конференции «Вакцинопрофилактика в XXI веке (Пермь, 2000 г.); на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» (г. Пермь, 2003 г.); на Всероссийской научной конференции с международным участием «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» (г. Адлер, 2006 г.); на Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах» (г. Адлер, 2007 г.); на IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (г. Москва, 2007 г.); на Международном конгрессе «48th Annual Meeting of the Eurohean Society for Pediatric Research» (г. Прага, 2007 г.), на Международном Российско-Норвежском семинаре «Совершенствование системы эпидемиологического надзора, диагностики и профилактики врожденной краснухи» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.); на 3 заседаниях Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Санкт- Петербург, 2003, 2005, 2007 г.г.); на заседании Ученого Совета ГУ ИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН (Московская область, 2007 г.). Диссертационная работа была апробирована на заседании проблемной комиссии по вирусологии (25.09.08 г.) и заседании Ученого Совета (02.10.08 г.) ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора. Научные положения, изложенные в диссертации, опубликованы в 31 печатной работе в период с 1995 по 2008 г.г., включая монографию «Краснуха» (Пермь – Санкт-Петербург – Москва, 2002), аналитический обзор «Инфекционная заболеваемость в Северо- Западном федеральном округе России. Закономерности и особенности эпидемического процесса в современный период» (СПб., 2007) и 8 работ в журналах, которые рекомендованы ВАК для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук. По материалам исследования получено два патента РФ на изобретение. ^ Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 328 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, главы материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованной литературы и приложений. Список литературы включает 297 работ, из них 113 отечественных и 184 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 20 таблицами. ^ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Исследование выполнено в ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора с 1995 по 2007 гг. в комплексе с ООО диагностический центр научно-производственная фирма (НПФ) «Хеликс» (г. Санкт-Петербург), ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае» (г. Пермь); ГУ НИМП РАМН (г. Адлер-Сочи). В работе использованы следующие группы вирусов: 1. Варианты вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов», полученные в ходе его аттенуации в культуре клеток ППК. Использованы 14, 17, 23 пассажи вируса в указанной культуре клеток. Штаммы получены из коллекции музейных вирусов лаборатории детских вирусных инфекций ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора. 2. Вакцинные штаммы вируса краснухи: - Wistar RA27/3 (в составе вакцины Rudivax); - «Орлов» (36 пассажей в культуре клеток ППК; получен из ГКМВ, г. Москва); - «Орлов-В» - получен нами проведением трех дополнительных пассажей штамма «Орлов» в культуре клеток ППК. Всего штамм «Орлов-В» прошел 39 пассажей в указанной культуре клеток. 3. Штамм вируса краснухи «Лебедев», выделенный нами в 2001 г. от ребенка с СВК на перевиваемой культуре клеток BHK-21; в работе использован 3 – 4 пассаж вируса в указанной культуре клеток. 4. В ходе работы получен аттенуированный штамм вируса краснухи «Орлов-Д». 5. Вакцинные штаммы вируса кори Л-16 и вируса эпидемического паротита Л-3. 6. Вирусы ВВС, ВБН, ВЭМ. Образцы крови, полученные на территории Пермского края в период 1999 – 2005 гг., от 13 пациентов с лабораторно подтвержденным диагнозом «краснуха». Первичные (ППК), диплоидные (ДКЛЧ, ДКПЧ, «М-22»), перевиваемые (RК-13, ВНК-21, Vero, L-41, СПЭВ) культуры клеток. Лабораторные животные: 130 беспородных взрослых и новорожденных мышей, 44 морские свинки, 75 взрослых и 1-3 дневных кроликов породы «Шиншилла», 35 обезьян макака-резус. Для проведения исследования применялись вирусологические, молекулярно-биологические, иммунологические, морфологические, гистологические методы исследования.^ Определение биологической (инфекционной) активности вирусов проводили титрованием на культуре клеток, используя десятикратные разведения образцов ВСЖ. Учет результатов производили по прямому ЦПД вируса на клетки или в реакции интерференции с рабочей дозой ВВС. Конечную концентрацию вирусов определяли по методу Рида и Менча.^ Молекулярно-генетические исследования проводили на базе диагностического центра ООО НПФ «Хеликс». Для выделения РНК из сыворотки крови больных или из лиофилизированного штамма вируса краснухи использовали набор реагентов «Рибо-сорб», производства ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора (г. Москва) в соответствии с инструкцией по применению.^ Для проведения реакции обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) использовали набор реагентов «Revert AidTM First Stand cDNA Sintesis Kit» (Fermentas); реакцию проводили по стандартной схеме. Полученную кДНК использовали для проведения ПЦР. Для проведения ПЦР были подобраны 3 группы праймеров: 1. Для сравнительного генотипирования штаммов «Орлов-В», «Орлов-Д» и Wistar RA27/3 была использована пара праймеров, полностью фланкирующих ген Е1 и дающих амплификат размером 1443 п. о. (с 8292 по 9653 н): Forward: 5’- CAC TCA AGC ACC TGT CCC C– 3’; Reverse: 5’ – GCA CAG CAA GCG AGT AAG C- 3’. 2. Для генотипирования штаммов и изолятов вируса краснухи был использован участок гена Е1 размером 739 п.о. (с 8731 по 9469 н.), полученный в результате амплификации с другой пары праймеров: Forward: 5’- TCT GGG CTG TCA ACG CCT ACT CCT – 3’; Reverse: 5’ – ATC CAC TCG GGT ATT TCG – 3’. 3. Для сравнительного генотипирования пассажных вариантов штамма «Орлов» - 14 пар праймеров, амплификаты которых суммарно перекрывают весь геном Rubella (9755 п.о.) (таблица 1).Таблица 1Последовательности праймеров, использованных для секвенирования генома вируса краснухи № Последовательность Ta*(°С) Размер продукта (нк) 1 2 3 4 1 CGGACCTCGCTTAGGACTC 58 778 2 CCGGCAGGACTTGGTAGAT 3 CACGCATCTACCAAGTCCTGC 61 678 4 GCACGGTGTCCAAGTGGC 5 ACCTGGATCGTCCACGCAG 65 641 6 GGCAGGTCACGCACCGAGA 7 CTCGGTGCGTGACCTGCC 63 769 8 CGCAGCAGACCAGCCGTAG 9 GCTGGTCTGCTGCGGAGTC 62 701 10 GCACCCGGCACTCGTGTAG 11 TACACGAGTGCCGGGTGC 63 719 12 GCGAGCGGTTTCGTCAGC 13 ATCAAGAACGCCGCCACC 64 716 14 TCTTGGGCCTCGGGGATG 15 CCGCACTCTGGAGGAGCT 58 704 16 TGGCGTTGGTGGTGTAATG 17 GGTGGCAGGCCCATTACA 60 762 18 TTAGTCGGCGTCGTGGAGA 19 CACGACGCCGACTAACGC 61 669 20 GCCCAGGTTGGTGAAATGC 21 TCACCAACCTGGGCACCC 66 723 22 CGGCGGTCGTGGAGTTCG 23 GCCGGCCTCAATGACAGC 62 649 24 CGCACGAGACATCAGTGGG 25 AGATCCCCACTGATGTCTCG 59 766 26 ATCCACTCGGGCATTTCG 27 AGTGCGGACTCCACATACG 57 718 28 GGGCAAGAACCTCATCTAGG * Та – температура отжига Последовательности праймеров группы 1, 2 и 3 были использовали для секвенирования соответствующих амплификатов.ПЦР проводили по стандартной методике, адаптированной к соответствующей паре праймеров. Программа проведения ПЦР: 95° С – 3 мин + {94 ° С – 30 сек; 60 ° С – 30 сек; 72 ° С – 45 сек } х 35 циклов + 72 ° С – 5 мин. Амплификацию проводили на приборе «Терцик» (ДНК-Технология). Секвенирование в 4,25% полиакриламидном геле - на автоматическом секвенаторе ABI Prism 377 («Applied Biosystems», США) с использованием реагентов «BigDyeTMTerminator Kit v.2.0» (Appliied Biosystems) Полученные хромотограммы анализировали с помощью программы Chromas 2.3 «Technelysium Pty Ltd» (Австралия). Для построения филогенетического древа вируса краснухи использовали компьютерную программу MrBayes 3.1., в соответствии с рекомендациями ВОЗ (2005). Для определения степени эволюционной близости штаммов и изолятов вируса краснухи использовали показатель генетической дивергенции, который складывался из доли нуклеотидных замен между образцами (%) и индекс генетической близости, который рассчитывали, используя эволюционную модель случайных нуклеотидных замен [Kimura, 1980]. Межгрупповые генетические различия определяли, используя внутригрупповые консенсусные последовательности. Для анализа мутационных изменений генома штамма «Орлов» в процессе аттенуации в качестве референс-препарата использована референс- последовательность NC_001545 [Dominguez et al., 1990]. Для оценки генетических различий между вакцинными штаммами вируса краснухи Wistar RA27/3 и «Орлов-Д» использовали компьютерную программу «Vector NTI 10.0» (Invirtogen USA).^ Доклиническое изучение штамма «Орлов-Д» проводили на базе ГУН НИИМП РАМН (г. Адлер-Сочи).Контроль специфической безопасности штаммов вируса краснухи проводили определением остаточной нейровирулентности при интрацеребральном заражении серонегативных к краснухе обезьян макака-резус. Перед началом эксперимента животных погружали в глубокий наркоз, который достигался внутримышечным введением 10% раствора гексенала из расчета 1,0 мл на 1,0 кг массы животного. Вируссодержащий материал вводили в зрительный бугор каждого полушария головного мозга в дозе, 10000 ТЦД50/0,5 мл. Клиническое наблюдение за обезьянами проводили 30 суток, в течение которых отмечали наличие или отсутствие клинических симптомов поражения центральной нервной системы. По истечении периода клинического наблюдения у животных брали пробы крови для определения в сыворотке вирусспецифических АТ, после чего умерщвляли под глубоким гексеналовым наркозом, проводили аутопсию, морфологическое и гистологическое исследование тканей ЦНС и других внутренних органов обезьян. ^ Специфическую активность штаммов вируса краснухи определяли по критериям: 1. Иммуногенная активность – формирование вирусспецифических АТ через 28 суток после однократного внутримышечного введения серонегативным к краснухе обезьянам препаратов из исследуемых штаммов. Прививочная доза соответствовала 1 прививочной дозе для человека – не менее 1000 ТЦД50/0,5 мл. Определение титров АТ проводили в РТГА, используя «Диагностикум краснушный антигенный сухой для РТГА» производства ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора в соответствии с инструкцией по применению препарата. ^ 2. Протективная активность - устойчивость иммунизированных животных к трехкратному интраназальному заражению патогенным штаммом вируса краснухи «Лебедев» в дозе 10000 ТЦД50/0,5 мл. Группу контроля при этом составляли не иммунизированные, серонегативные к краснухе обезьяны, зараженные по той же схеме. Развитие вирусемии регистрировали в ПЦР, исследуя сыворотки крови животных на разных сроках после заражения. Для выделения вирусной РНК использовали набор реагентов «АмплиСенс Rubella-302» производства ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора.^ Контагиозность штаммов вируса краснухи оценивали после 28 суток тесного контакта (нахождение в одной клетке) иммунизированных и не иммунных макаков, определяя у последних наличие вирусспецифических АТ. ^ Интерфероновый статус и параметры клеточного иммунитета обезьян определяли, исследуя гепаринизированную кровь, взятую из локтевой вены животных; α- и γ- ИФН получали in vitro, используя различные индукторы (ВБН, Con-A). Титрование полученных цитокинов проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах, маркированных «для работы с культурой клеток» с 24-часовой культурой монослоя клеток-мишеней СПЭВ против 100 цитопатических доз индикаторного вируса (ВЭМ). Параметры клеточного иммунитета определяли в тесте розеткообразования эритроцитов барана, меченых моноклональными антителами против различных субпопуляций лимфоцитов, а также против маркеров молекул HLA-DR. Использовали диагностический набор «Диагностикумы стабильные на основе моноклональных антител» Витебского государственного медицинского института в соответствии с инструкцией. Все манипуляции с обезьянами проводили после в/м введения раствора калипсола из расчета 0,1 мл на 1 кг массы тела животного. Статистическая обработка материала проведена методами параметрической и непараметрической статистики [3айцев, 2003] с использованием t-критерия Стьюдента для определения значимости различий между явлениями. Разность результатов считали статистически достоверной при р ^ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ На основании проведенных исследований сформулированы и представлены к защите четыре основные положения: ПЕРВОЕ ПОЛОЖЕНИЕВакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В» идентифицирован как вирус генотипа 2с, эндемичный для территории РФ, и генетически более близок к циркулирующим на территории России изолятам вируса краснухи, чем вакцинный штамм Wistar RА27/3. Вакцинопрофилактика краснухи вызывает филогенетические изменения возбудителя. На первом этапе работы представлялось важным определить генетическую принадлежность современных изолятов вируса краснухи, выделенных на территории России; их генетическую близость к вакцинным штаммам Wistar RA27/3 и «Орлов-В», полученным в 70-ые годы XX века. Для этого, на основе нуклеотидной последовательности фрагмента гена Е1 размером в 739 п.о. (с 8731 по 9653 н.), в соответствии с рекомендациями ВОЗ по генотипированию «диких» штаммов вируса краснухи [WHO, Wkly epiod. Report, 2005] был проведен филогенетический анализ 13 изолятов вируса краснухи, идентифицированных на территории Пермского края в период с 1999 по 2005 гг. SLM17Perm-1999, SLM11Perm-2000, SLM13Perm-2000, SLM14Perm-2000, SLM16Perm-2000, SLM12Perm-2003, SLM3Perm-2003, SLM7Perm-2002, SLM8Perm-2002, SLM5Perm-2004, SLM9Perm-2004, SLM6Perm-2005, SLM15Perm-2005, а также упомянутых выше вакцинных штаммов вируса краснухи. В анализе использовали также имеющиеся в коллекции GenBank последовательности 4 штаммов вируса краснухи, циркулировавших в России в 1967- 1997 гг.. По результатам исследования все изоляты вируса краснухи, выделенные на территории Пермского края, а также вакцинный штамм «Орлов-В» и 4 российские штамма, выделенные в период 1967 – 1997 гг., отнесены к генотипу 2с (рис. 1). Штамм Wistar RA27/3 отнесен к генетической линии 1. В ходе генетического анализа этого штамма было получено совпадение его положения в филогенетическом древе с установленным номером в GenBank, что подтверждает достоверность полученных результатов. Индекс генетической близости между современными изолятами вируса краснухи и вакцинными штаммами «Орлов-В» и Wistar RA27/3 составил 0,74 и 0,99 соответственно. Эти показатели свидетельствуют о более тесном генетическом родстве современных изолятов вируса, выделенных на территории Западного Урала, российских изолятов более раннего периода выделения с вакцинным штаммов «Орлов-В», чем со штаммом Wistar RA 27/3. Полученные результаты коррелируют с данными ВОЗ, которая определяет РФ как территорию с эндемичной циркуляцией вирусов краснухи генотипа 2с [WHO, Wkly Epidemiol. Rec., 2005]. Своего рода уникальность вирусов краснухи генотипа 2с, связанная с их эндемичным распространением в России, может являться обоснованием, наряду с экономическим преимуществом, целесообразности использования в РФ вакцинного штамма, выделенного на данной территории. Группой ученых [Frey et al., 1998, Zheng et al. 2003] было высказано предположение о том, что возрастающая изменчивость штаммов вируса краснухи является следствием введения в практику широкомасштабной вакцинации в разных странах мира. Очевидно, что надзор за краснушной инфекцией должен предусматривать наблюдение за эволюцией вируса в период вакцинопрофилактики. C этой целью были исследованы изоляты вируса краснухи, выделенные на территории Пермского края, где, вакцинопрофилактика краснухи проводится с 1995 г. За десятилетний период в крае были использованы две стратегии: селективной вакцинации девушек и женщин репродуктивного возраста; массовой вакцинации детей 1-2 года жизни. В ходе исследования была выявлена низкая популяционная изменчивость современных изолятов по отношению к референс-штаммам вируса краснухи, которая варьировала в интервале 0 – 1 %. Также несущественными оказались генетические различия между изолятами вируса краснухи, полученными в период селективной иммунизации на фоне эпидемического подъема заболеваемости (1999 – 2000 гг. и 2003 г.) и в межэпидемический период 2003 г. - показатель генетической дивергенции не превышал 0,6 – 2% (р > 0,05). Рис. 1. Генетическая характеристика изолятов вируса краснухи, циркулирующих на территории Пермского края в 1999–2005 гг. Изоляты: 5-SLM5Perm-2004, 6-SLM6Perm-2005, 7-SLM7Perm-2002, 8-SLM8Perm-2002, 9-SLM9Perm-2004, 11-SLM11Perm-2000, 12-SLM12Perm-2003, 13-SLM1ЗPerm-2000, 14-SLM14Perm-2000, 15-SLM15Perm-2005, 16-LM16Perm-2000, 17-SLM17Perm-1999. Референсные штаммы генного банка - AY 247015, AY 247016, AY 247017, AY 247019 (Россия, 1967-1997 гг.). Вакцинные штаммы вируса краснухи: «Орлов-В»; Wistar RA27/3 в составе вакцины Rudivax.Напротив, массовая туровая иммунизация детей 1 – 2 года жизни в течение 4-х лет применения, при пороге привитости, равном 460,0 на 1000 детского населения (расcчитан на все население г. Перми в возрасте от 1 до 17 лет) привела к достоверному увеличению показателя генетической дивергенции с 1,15 % в 2000 – 2002 гг. до 3,14 % в 2004 – 2005 гг. (r = 0,76; t = 4,58 p В соответствии с задачами исследования, следующий этап работы был связан с получением варианта вакцинного штамма «Орлов» - штамма «Орлов-Д». Для получения штамма «Орлов-Д» первоначально была проведена работа по определению способности различных видов диплоидных линий клеток эмбриона человека поддерживать репродукцию вируса краснухи. В экспериментах были использованы: 4 линии клеток ДКЛЧ – 175/312, 275/6, 776/14, 780/25; 3 линии клеток ДКПЧ – 882/25, 1182/12, 1182/8. В числе других, была использована линия диплоидных клеток фибробластов кожно-мышечного лоскута эмбриона человека, «М-22», любезно предоставленная автором линии, профессором Л.Л. Мироновой (получена на уровне 19 пассажа). Максимальный уровень инфекционной активности вируса (4,9 -5,3 lg ТЦД50/мл), в 10 раз превышавший показатель его репродукции в клетках ППК, регистрировали при использовании фибробластов легкого эмбриона человека (линии клеток ДКЛЧ); минимальный: 3,1-3,2 lg ТЦД50/мл – в клетках фибробластов почки эмбриона человека (линии клеток ДКПЧ). Линия клеток «М-22» занимала промежуточное положение по чувствительности к вирусу краснухи. Тем не менее, средние показатели инфекционной активности вируса в клетках ППК и «М-22» практически совпадали и составили 3,9 lg ТЦД50/мл и 4,2 lg ТЦД50/мл, соответственно. Неоспоримым преимуществом линии клеток «М-22» перед другими исследованными линиями является наличие банка посевных клеток «М-22», сертифицированного в ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Это обстоятельство определило дальнейший ход исследования, в котором в качестве тканевого субстрата для разработки способа получения вакцины против краснухи была использована линия диплоидных клеток человека «М-22». В ходе получения нового варианта штамма «Орлов» адаптация вируса к иному тканевому субстрату не потребовалась: стабильный уровень репродукции, стабильный rct40 ±-фенотип регистрировали с первого по десятый пассаж вируса в клетках «М-22». Этот факт определил возможность