Інструктивно-методичні матеріали до практичних (семінарських) занять з курсу „Спецпрактикум з фізіології та біохімії рослин” (спеціалісти, магістри)Тема: Азотний обмін у рослинахМета – розуміння фізіологічних уявлень про функціональну організацію і інтеграцію метаболічних і транспортних процесів на клітинному, тканининному, органному і організменному рівнях в рослинах, спрямованих на засвоєння мінерального азоту Заняття 1 1. Розібрати наступні питання за темою Відновлення азоту - Компартментація нітратів: Надати характеристику нерівномірності розподілу поглинутих нітратів у просторі рослинної клітини. Охарактеризувати активний і запасний компартменти нітратів. - Локалізація нітратвідновлюючих ферментів Описати у формулах процес ферментативного відновлення нітрата до амміака. Охарактеризувати ферменти нітрат- і нітритредуктазу, їх локалізацію в рослинній клітині. Розібрати метод визначення активності нітратредуктази^ Хід роботи. Наважку рослинного матеріалу розтирають з 1 мл 1% розчину азотнокислого калію і 1 мл 5% розчину глюкози. Проби витримують у вакуум-ексикаторі при температурі 300С протягом 24 год. Потім переносять у мірні колби, доводять водою до 50 мл і фільтрують через щільний фільтр. Випаровують 10 мл витяжки у фарфоровій чашці на водяній бані. До сухого залишку доливають 1 мл дисульфофенолової кислоти, а через 10 хв 10 мл безамміачної води. Потім нейтралізують 10% розчином гідроксиду натрію до появи темного забарвлення, що свідчить про наявність нітратів. Забарвлений розчин доводять до 50 мл безамміачною водою. Визначають оптичну густину при 440 нм в 1 см кюветі. Активність нітратредуктази знаходять за калібрувальною прямою, побудованій по чистому азотнокислому калію. Для цього 0.1631 г нітрату калія розчиняють в 1 мл бідистильваній воді, 100 мл маточного розчину доводять до 1л бідистилюваною водою (робочий розчин). В 1 мл робочого розчину міститься 0.01 мг нітрату калія. Цей розчин розміщують у фарфорові чашки по 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 і 20 мл. Вміст випаровують на водяній бані до абсолютно сухого стану. До сухого залишку додають 1 мл дисульфофенолової кислоти. Через 10 хв доливають 10 мл безамміачної води і нейтралізують 10% розчином лугу. Після появи темного забарвлення розчин доводять до 50 мл і визначають оптичну густину при 440 нм.Завдання: - побудувати калібрувальну криву, якщо оптична густина в пробах мала такі значення: 0.025, 0.050, 0.077, 0.096, 0.125, 0.153, 0.178, 0.201, 0.233, 0.269, 0.298; визначити активність нітратредуктази, якщо оптична густина в дослідних пробах мала такі значення: 1. 0.155; 2. 0.177; 3. 0.213.Формула, за якої визначається активність ферменту: А = D440. k . розведення, m наважки . t . V аліквоти де D440, оптична густина при 440 нм, k – коефіцієнт, який дорівнює 0.35, розведення дослідної проби (1 : 4), m наважки – маса рослинної наважки (0.2 г), V аліквоти - об'єм розчину в мл. Активність ферменту виражається в мг NO3- , відновленого за добуЗаняття 2. Асиміляція амонію Розібрати такі теоретичні питання: 1. „^ Процес включення аммонія в глутамат” Описати дві послідовні реакції включення аммонію в глутамат. Кофактори, необхідні для цього процесу. Охарактеризувати фермент глутамінсинтетазу (ГС) . Охарактеризувати фермент глутаміноксиглута-ратамінотрансферазу (ГОГАТ). Охарактеризувати фермент глутамат-дегідрогеназу (ГДГ). За яких умов ГДГ не може функціонувати в клітині? Описати, в яких формах азот може поступати в рослину. Які амінокислоти утворюються в результаті асиміляції аммоні.? 2. ^ Зв'язок реакцій асиміляції СО2 з обміном азотмістких сполук в листях рослин Охарактеризувати форми амінування кетопопередників амінокислот: 2-оксоглутарат, щавелевооцтова і фумарова кислоти, піруват. Охарактеризувати стадії азотного обміну в хлоропластах, мітохондріях, цитозолі. Ферментні системи, відповідальні за вторинні перетворення амінокислот у хлоропластах. Реакції трансамінування в мітохондріях. Сучасні методи визначення ферментів азотного обміну.Заняття 3. Розібрати наступні питання до теми „Азотний обмін у проростаючому насінні” Основні фізіологічні процеси при проростанні насіння. Синтез білку та його залежність від різних факторів. Етапи утилізації білків при проростанні насіння. Ферменти гідролізу білків у проростаючому насінні (протеази). Внутрішньоклітинні структурні зміни в запасаючих органах і зародку насіння. Процес розпаду білка в різних частинах насіння на прикладі ячменю, пшениці, кукурудзи. Процеси мобілізації запасів насіння і розвиток активності ферментів, які забезпечують їх гідроліз. Процеси регуляції деградації білків у проростаючому насінні.^ Відповісти на запитання. Як здійснюється синтез білку? Із яких етапів складається цей процес? Які умови впливають на синтез білка? З якими функціями рослинного організма пов'язан синтез білку і чому? Як здійснюється розпад білку? На які етапи поділяють цей процес? Яка речовина є кінцевим продуктом розпаду білка? Які фактори прискорюють цей процес ? Назвіть механізми, які попереджають накопичення вільного амміака в рослинах. Яку фізіологічну роль відіграють аміди? Описати цикл Прянишникова.Література: Измайлов С.Ф. Азотный обмен в растениях. . – М.: Наука, 1986. – 320 с. Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений. – М.: Высшая школа, 2006. – 742 с. Мусієнко М.М. Фізіологія рослин. – К.: Фітосоціоцентр, 2001. – 392 с.Підготувати наступні теми аналітичних оглядів: Зародковий шлях і стовбурові клітини у вищих рослин (Бурда В.) Роль білків у загальній стратегії адаптації рослин до стресів (Вакуліна К.) Вуглеводний обмін рослин в умовах промислового міста (Самко О.) Електрофоретичні методи дослідження рослинних білків (Свергун О.) Інгібітори протеїназ рослин та методи їх виділення і очищення (Шленськова М.) Вплив шкідливих речовин атмосфери на фізіолого-біохімічні процеси деревних рослин (Богомаз А.) Стресові білки рослин (Садоха О.) Роль ферментативних і неферментативних систем захисту рослинних клітин від несприятливих умов середовища (Раковець О.). Обмін речовин у проростаючому насінні (Варданян С.) Рослинні аквапорини (Бабоченко О.) Хроматографічні методи визначення фракційного складу білкових речовин у рослинах (Халізова А.) Методи імуноаналізу рослин (Вакуліна К.) Біохімічні методи визначення життєздатності насіння (Свергун О.) Сучасні методи кількісної оцінки білків (Раковець О.) Білкові маркери у вирішенні проблем селекції і насінництва (Богомаз А.) Дія дефіциту води та посухостійкість (Бабоченко О.) Вплив сумісної дії різних факторів середовища на цитофізіологічні процеси в рослинах (Садоха О.) Вплив важких металів на структурну організацію меристеми (Бурда В.) Механізми стійкості рослин до важких металів (Самко О.) Фізіологічні механізми адаптації рослин до гербіцидів (Шденськова М.) Фізіологічні і молекулярні механізми адаптації рослин до низьких температур (Халізова А.) Вплив гіпоксії на фізіолого-біохімічні процеси коренів рослин (Варданян С.)