Курсовая работа Студента второго курса факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. ЛомоносоваСнегирёва Александра Викторовичана тему:«Эволюция числа ядрышкообразующих районов хромосом у животных»Научный руководитель:д.б.н. Зацепина О.В.ВведениеПроблематика. Данная курсовая работа посвящена очень важным компонентам клеточного ядра, без существования которых невозможен весь процесс синтеза белка в эукариотической клетке, - ядрышкам (см. рис. 1). Ядрышки во множестве производят рибосомы – клеточные «машины» синтеза белка. Как известно, ядрышки образуются вокруг кластеров рибосомных генов (рДНК), кодирующих основные классы рРНК (18 S, 5.8 S и 28S), которые получили название ядрышковых организаторов или ядрышкообразующих районов хромосом (ЯОР). Поэтому всестороннее изучение ядрышек является одним из ведущих факторов развития современной биологии. Довольно много работ связано со свойствами рибосомных генов, с функционально-морфологическими и биохимическими аспектами их работы, с влиянием деятельности ядрышка на жизнь клетки в целом и т.д., но крайне мало работ, в которых проводится анализ изменения числа ЯОР у различных организмов разных таксономических групп. Так, из лично мне известных работ по этой теме – это обзор Лонга и Давида «Repeated genes in eukaryotes» двадцатипятилетней давности [1], где представлены сводная таблица по числу и локализации рДНК и генов 5 S РНК у ~ 30 различных видов живых организмов. Однако после этого обзора новых работ об эволюции числа ЯОР у животных не было опубликовано ни в отечественной, ни в зарубежной литературе. И это понятно: количество ЯОР сильно варьирует не только у разных организмов, но и в клетках одного организма, поэтому трудно находить соответствия между их числом и свойствами определенных клеток и организмов в целом. Тем более необходимо учитывать эволюционные моменты, например родственные отношения между группами организмов разных видов, отделов, классов и т.д., степень сходства их рибосомных генов. Предполагается, что межклеточные, межиндивидуальные и межвидовые различия по числу и локализации ЯОР имеют важный биологический смысл. Но до сих пор не удалось найти причины данного явления и решение этой проблемы. В данном обзоре тоже нет ответов на эти вопросы, хотя делаются предположения о путях дальнейших исследований в данной области, сделаны попытки поиска корреляций между числом ЯОР и важным биологическими параметрами видов, такими как продолжительность беременности, размеры организма и др. Здесь в основном рассмотрены межклассовые (у позвоночных животных) и межвидовые (на примере отряда Грызуны) различия в числе ЯОР, но затронута и тема внутривидовых различий в числе ЯОР (на примере лабораторных мышей). ^ Структура ядрышка. Для дальнейшего обсуждения проблемы необходимо знать и понимать некоторые общие моменты, связанные с изучаемыми объектами. Рассмотрим кратко структуру, свойства и функции компонентов ядрышек [2]. В ядрышке выделяют три основные зоны: фибриллярный центр (ФЦ, в нём находится неактивные гены рРНК ядрышка), плотный фибриллярный компонент (ПФК, содержит транскрибируемую рДНК и созревающую рРНК) и гранулярный компонент (ГК, где располагаются готовые субъединицы рибосом). Совокупностью ФЦ ядрышка фактически соответствует ЯОР метафазных хромосом. ЯОР располагаются во вторичных перетяжках хромосом, на которых в телофазе происходит новообразование ядрышек интерфазного ядра. При новообразовании ядрышки могут сливаться друг с другом, поэтому количество ядрышек обычно меньше, чем число ЯОР. Получившиеся таким образом ядрышки имеют весь объём генетической информации соединившихся ядрышек. ЯОР не является точечным локусом хромосомы, а является множественным по своей структуре, содержит несколько одинаковых генных участков, каждый из которых отвечает за образование ядрышка (например, при разрыве хромосомы в области ЯОР каждая из частей способна образовывать ядрышки). Число активных генов рРНК постоянно на геном, оно не меняется в зависимости от уровня транскрипции этих генов, при репликации ДНК происходит и удвоение числа генов рРНК. Однако, существуют случаи, когда гены рРНК подвергаются избыточной репликации для обеспечения продукции большего количества рибосом (если необходимо быстро и сильно увеличить синтез белка), в результате образуются экстрахромосомные рРНК, не связанные с ЯОР – происходит амплификация генов рРНК (например, в ооцитах земноводных и других животных). ^ Структура рДНК. Синтез рРНК. При синтезе рРНК сначала образуется молекула-предшественник 45S РНК, которая распадается на фрагменты (так называемый процессинг): 28S, 18S и 5,8S РНК (молекула 5S РНК, тоже участвующая в сборке рибосом, синтезируется независимо и локализация гена 5S рРНК не связана с ЯОР). С помощью электронного микроскопа удалось увидеть рибосомные гены «в работе»: на депротеинизованных и сильно распластанных препаратах ядрышек наблюдались структуры в виде «ёлочек» (рис. 2). На нити рДНК располагаются молекулы фермента РНК-полимеразы I, ответственные за синтез рРНК, от которых отходят нити-транскрипты из синтезируемых молекул РНК. При этом самые длинные транскрипты находятся на одной стороне «ёлочки» (соответствуют 45S РНК), а на противоположной стороне транскрипция только начинается. Такой участок ДНК с транскриптами называется транскрипционной единицей. Между транскрипционными единицами находятся зоны спейсеров, имеющие нуклеосомное строение и не участвующие в транскрипции. Такое чередование транскрипционных единиц со спейсерами и определяет множественность рибосомных генов.^ Активация ЯОР. В неактивной форме ЯОР представлен в виде одного крупного фибриллярного центра, состоящего из рибосомных генов. В начале активации ядрышка происходит деконденсация рибосомных генов на периферии ФЦ, которые начинают транскрибироваться (синтезировать РНК). По мере усиления транскрипции единый ФЦ распадается на ряд более мелких ФЦ, связанных друг с другом декомпактизованными участками рДНК. При полной активации ядрышка все ФЦ деконденсируются и получается, что зоны ПФК содержат всю рДНК в активном состоянии. При инактивации ядрышка происходит обратный процесс конденсации рДНК. Такое инактивированное ядрышко структурно сходно с ЯОР в составе митотических хромосом. Процессы активации и инактивации играют весомую роль при определении числа и местоположения ЯОР. ^ Методы выявления ЯОР. Локализацию ЯОР можно довольно точно определить на митотических хромосомах с помощью окраски солями серебра, имеющих сродство к некоторым аргентофильным белкам ядрышка. Основными из них в митозе являются РНК-полимераза I и ее специфический транскрипционный фактор белок UBF. Этот метод получил название Ag-окраски или Ag-ЯОР окраски хромосом. Показано, что аргентофильными свойствами обладают только ЯОР, которые были активны в интерфазе, предшествующей митозу. Принято считать, что максимальное число Ag-ЯОР соответствует общему числу ЯОР в кариотипе, однако из этого правила есть многочисленные исключения. Более точным является определение числа ЯОР методом молекулярной гибридизации in situ. В первоначальном варианте для этого использовали метод радиоавтографии и меченную тритием рРНК, которая при взаимодействии с денатурированной ДНК в митотических хромосомах образует ДНК-рРНК-гибрид в тех местах, где последовательности ДНК комплементарны рРНК. В этих участках и происходит засвечивание фотографической эмульсии, т.е. появляются зерна восстановленного серебра. Однако в настоящее время для молекулярной гибридизации in situ используют нерадиографические методы и пробы рДНК, меченные маленькими молекулами (биотином или дигоксигенином), которые выявляются специфическими антителами, конъюгированными с флуорохромом. Этот вариант гибридизации in situ получил название флуоресцентной гибридизации (FISH). Сопоставление данных по окраске хромосом AgNO3 и FISH-метода обнаружения рДНК показало, что Ag-окраска выявляет кластеры функционально-активных рРНК генов, тогда как FISH-метод выявляет все ЯОР, включая неактивные. Как увидим в дальнейшем, существование этих двух методов является одной из причин несовпадения результатов по количеству и локализации ЯОР.^ Сборка рибосом. 60S рибосомная субъединица состоит из трёх фрагментов: 28S, 5,8S, 5S РНК. 40S рибосомная субъединица состоит из 18S РНК. Субъединицы покидают ядрышко и через ядерные поры попадают в цитоплазму. Из 40S и 60S в цитоплазме образуется полная работающая 80S рибосома: сначала 40S субъединица связывается с иРНК, а затем и с большой субъединицей (коэффициенты седиментации и механизм образования рибосом приведён для эукариотических клеток). Рис. 1 Ультраструктура ядрышка^ Рис.2 Рибосомные геныЦели и задачиГлавная цель данной работы – сделать некоторые предположения и выводы о связи между числом ЯОР и общебиологическими различиями организмов, то есть проследить эволюцию ЯОР на конкретных примерах организмов. Поэтому мы выявили следующие основные задачи работы: сравнение изменения числа ЯОР с изменением числа хромосом в диплоидном наборе по классам организмов; сравнение изменения числа ЯОР в эволюционном ряду: от беспозвоночных до человека; сравнение числа ЯОР в отдельно взятом отряде (Грызуны – в этом отряде наибольший разброс числа ЯОР); сравнение данных по числу ЯОР у домашней мыши Mus musculus.Материалы и методыВ ходе работы была использована интернет база данных PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Все результаты, полученные в этой работе, собраны из статей этой базы данных (см. список литературы). Также использована некоторая дополнительная литература и статьи, указанные в конце работы в списке литературы. В PubMed был произведен поиск по ключевым словам: nucleolus (-ar) organizing (-er) region и некоторым другим, связанным с ЯОР. При этом отбирались резюме статей, где указано число ЯОР в конкретных видах или родах в нормальных (без патологий) клетках взрослых животных. Как правило, число ЯОР производили в клетках костного мозга или лимфоцитах, активированных к пролиферации. Метафазные пластинки хромосом готовили по стандартной методике. Если в базе данных была ссылка на полную бесплатную версию, то рассматривалась вся статья. Также во многих статьях указывалась хромосомная локализация ЯОР, методы выявления ЯОР и число хромосом на диплоидный набор. Данные о числе хромосом у разных видов также вносили в таблицы.Результаты и обсуждениеПолученные материалы (число ЯОР, локализация ЯОР, методы выявления ЯОР, число хромосом в кариотипе вида, а также систематическое положение многих организмов) были сведены в общую таблицу № 1. Дадим необходимые пояснения к этой таблице: № - порядковый номер организма, введён для удобства; название организма – в основном на латинском языке, иногда на английском, редко в скобках указывается русское название рода или организма; метод – метод, с помощью которого были получены результаты; число ЯО и № хром. – число пар хромосом с ЯОР или номера этих хромосом; число хром. - число хромосом на диплоидный набор; № статьи – номер, под которым следует искать источник информации в списке литературы. Виды в таблице поделены согласно таксономическим категориям: надкласс Рыбы, класс Земноводные, класс Пресмыкающиеся, класс Млекопитающие, Беспозвоночные животные. Класс Млекопитающие разделён на несколько отрядов. Примечание. Отряды Парнокопытные (Artiodactyla) и Непарнокопытные (Perissodactyla) и отряд Мозоленогие (Tylopoda) для удобства объединены под названием Копытные животные.Таблица № 1. Число ЯОР у видов таксономических групп. № название организма метод число ЯО (№ ЯО- хромосом) Число хром. №статьи ^ Надкласс Рыбы (Pisces) 1 Gymnotus carapo (гимнот) Ag-окр. 1 17 2 Apteronotus albifrons Ag-окр. 1 17 3 Sternopygus macrurus Ag-окр. 1 17 4 Eigenmannia virescens Ag-окр. 1 17 5 Salmo gairdneri (лососевые) Ag-окр. 1 18, 24 6 Salmo brown trout (лососевые) Ag-окр. 1-2 18 7 Salmo Atlantic salmon (лососевые) Ag-окр. 1 18 8 Salvelinus fontinalis Ag-окр. 4-6 18 9 Salvelinus lake trout Ag-окр. 4-6 18 10 Salvelinus arctic char (голец) Ag-окр. 4-6 18 11 Oncorhynchus tshawytscha Ag-окр. 1 19 12 Oncorhynchus kisutch Ag-окр. 1 19 13 Oncorhynchus keta (кета) Ag-окр. 1 19 14 Oncorhynchus nerka (нерка) Ag-окр. 1 19 15 Oncorhynchus gorbuscha (горбуша) Ag-окр. 1 19 16 Oncorhynchus masou Ag-окр. 1 19 17 Danio rerio Ag-окр. 3 (№ 1, 2, 8) 2n = 50 20 18 Cobitis vardarensis (вьюновые) Ag и FISH 2-5 2n = 50 21 19 Odontocheila confusa Ag и FISH 1-2 2n = 22 22 20 Odontocheila nodicornis Ag и FISH 1-2 2n = 36 22 21 Leporinus friderici Ag-окр. 1 (№ 2) 2n = 54 23 22 Leporinus obtusidens Ag-окр. 1 (№ 2) 2n = 54 23 23 Leporinus elongatus Ag-окр. 1 (№ 2) 2n = 54 23 24 Umbra pygmaea (евдошковые) Ag и FISH 4 2n = 22 87 25 Umbra limi (евдошковые) Ag и FISH 4 2n = 22 87 26 Cobitis taenia (вьюновые) Ag и FISH 1 2n = 48 38 27 Tinca tinca (линь) Ag-окр. 1 (№3) 84 ^ Класс Земноводные (Amphibia) 28 Odontophrynus Ag-окр. 2 (№4,11) 27 29 Xenopus tropicalis Ag-окр. 1 (№5) 2n = 20 26 30 Xenopus epitropicalis Ag-окр. 1 (№5) 2n = 20 26 31 Rana blairi (лягушка) Ag-окр. 1 (№10) 2n = 26 25 ^ Класс Пресмыкающиеся (Reptilia) 32 Coleodactylus amazonicus Ag-окр. 1 2n = 36 71 ^ Класс Млекопитающие (Mammalia) Отряд Китообразные (Cetacea) 34 Tursiops truncatus (афалина) FISH 2 35 Stenella attenuata 2 72 36 Stenella longirostris 2 72 37 Stenella dubia 2 72 Копытные животные 38 Sus scrofa (свинья) Ag и FISH 2 (№ 8,10) 2n = 38 73-79 39 Sus verrucosus Ag-окр. 2 (№ 8,10) 77 40 Sus celebensis Ag-окр. 2 (№ 8,10) 77 41 Sus salvanius Ag-окр. 2 (№ 8,10) 77 42 Indian muntjac FISH 2 3 43 Equus caballus (лошадь Пржевальского) Ag-окр. 3 (№1,26,31) 2n = 64 42 44 Bos taurus (бык) Ag-окр. 5 (№2,3,4,11,29) 2n = 60 31 45 Bubalus bubalus (буйвол) Ag-окр. 5-6 (№3,4,6(8),23,24,(21)) 2n = 50 31, 32 46 Swamp buffalo Ag-окр. 5 (№4,8,20,22,23) 2n = 48 33 47 Capra ibex (коза) Ag-окр. 5 (№2,3,4,5,28) 34 48 Rupicapra rupicapra (серна) Ag-окр. 5 (№1,2,4,5,28) 34 49 Bison bison (бизон) Ag-окр. 5 (№2,3,4,11,28) 34 50 Lama glama (лама) Ag-окр. 5 51 51 Ovis aries (овца) Ag-окр. 5 (№1,2,3,4(6),25) 2n = 54 61, 62, 63 ^ Отряд Насекомоядные (Insectivora) 52 Talpa occidentalis (крот) Ag и FISH 1 (№ 3) 81 ^ Отряд Сумчатые (Marsupialia) 53 Monodelphis domestica Ag-окр. 1 (№Х, 5) 2n = 18 53 54 Didelphidae (опоссумы) Ag и FISH 1 2n = 14 40 55 Didelphidae (опоссумы) Ag и FISH 1 2n = 18 40 56 Didelphidae (опоссумы) Ag и FISH 1 2n = 22 40 57 Macropus rufogriseus (гигантский кенгуру) Ag-окр. 1 (№X) 30 58 Potorous tridactylus (rat kangaroo) FISH 1 (№X) 2n = 12 3, 13 ^ Отряд Рукокрылые (Chiroptera) 59 Artibeus lituratus Ag и FISH 3 (№ 5,6,7) 28 60 Artibeus jamaicensis Ag и FISH 3 (№ 5,6,7) 28 61 Artibeus fimbriatus Ag и FISH 3 (№ 5,6,7) 28 62 Artibeus cinereus Ag и FISH 3 (№ 9,10,13) 28 63 Desmodus rotundus (вампиры) Ag и FISH 1 (№ 8) 29 64 Diphylla ecaudata Ag и FISH 1 (№ 13) 29 65 Phyllostomus (копьенос) Ag и FISH 1 28 66 Phylloderma Ag и FISH 1 28 67 Trachops Ag и FISH 1 28 68 Tonatia Ag и FISH 1 28 69 Sturnira Ag и FISH 1 28 70 Platyrrhinus Ag и FISH 1 28 71 Glossophaga Ag и FISH 1 28 72 Fruit bat (Carollia perspicillata) FISH 1 (№X) 2n = 20 3 73 Carollia castanea FISH 0 2n = 22 3 ^ Отряд Приматы (Primates) 74 Gorillas (Gorilla gorilla) Ag-окр. 2 (№1,2) 37 75 Orangutan (Pongo pygmaeus) Ag-окр. 8 (№13,14,15,18,21,22+2) 37 76 Gibbon (Hylobates hoolock) Ag-окр. 1 37 77 Human (Homo sapiens) Ag-окр. 5 (№13,14,15,21,(22)) 2n = 46 43-49 78 Orangutan (Pongo pygmaeus) Ag-окр. 9 (№11-17,22,23) 2n = 48 65 79 Tupaia glis Ag-окр. 4 2n = 60 7 80 Tupaia belangeri Ag-окр. 2 2n = 62 7 81 Tupaia chinensis Ag-окр. 2 2n = 62 7 82 Chimpanzee (Pan troglodytes) Ag-окр. 5 (№13,14,18,21,22) 37 83 Chimpanzee (Pan troglodytes) FISH 9 (№15-23) 37 ^ Отряд Зайцеобразные (Lagomorpha) 84 Oryctolagus cuniculus (кролик) Ag-окр. 4 (№13,16,20(21)) 2n = 44 60 ^ Отряд Хищные (Carnivora) 85 Canis familiaris (собака) Ag-окр. 2 (3+№Y) 2n = 78 35 86 Canis familiaris (собака) Ag-окр. 8 (№5,8,14,16,19,21,32,37) 2n = 78 36 Беспозвоночные животные (Achordata) 87 Tapinoma nigerrimum Ag и FISH 1 (№ 6) n = 9 82, 83 88 Tapinoma erraticum 1-2 n = 8 83 89 Melipona marginata (пчела) Ag-окр. 1 2n = 18 52 90 Mellitobia australica (оса) Ag-окр. 1 2n = 12 52 91 Cycloneda sanguinea Ag-окр. 1 2n = 18 52 92 Euglossa sp. Ag-окр. 5 n = 21 52 93 Plebeia sp. Ag-окр. 1 2n = 34 52 94 Parascaris univalens (нематода) Ag и FISH 1 2n = 2 64 95 Drosophila (плодовая муха) Ag-окр. 1 (№ Х) 41 96 Ixodes scapularis (клещ) Ag-окр. 3 (№ 7,10,Х) 2n = 28 50 На основании табличных данных можно сделать ряд наблюдений и выводов: число хромосом с ЯО у рыб практически одинаково и равно одной паре хромосом (хотя разброс даже до 6 пар хромосом), такое количество ЯОР выявляется у 63% рассмотренных рыб. Как ни странно, но у рыб при увеличении числа хромосом в диплоидном наборе количество ЯОР почти не увеличивается, скорее можно было бы сказать, что оно уменьшается, например, рыбы рода Leporinus (2n = 54) имеют 1 п.х. (пару хромосом) с ЯО, тогда как рыбы рода Umbra (2n = 22) имеют 4 п.х. с ЯО, так что соответствие общего числа ЯОР числу хромосом не прослеживается; число хромосом с ЯОР у земноводных колеблется между одной и двумя парами хромосом (у 75% - 1 п.х.), что-то определенное о корреляции между числом ЯОР и хромосом сказать трудно из-за малого количества материала по данной группе организмов; единственный представитель рептилий в нашей подборке имеет одну пару хромосом с ЯОР; далее рассмотрим число ЯОР в отдельных отрядах млекопитающих: 1) отряд Китообразные: 2 п.х. с ЯОР; 2) у крупного рогатого скота 5 п.х. с ЯОР, у более мелких копытных животных – 2 п.х. с ЯОР. Здесь, в общем, рассматриваемая тенденция к увеличению числа ЯОР с увеличением генотипа тоже не прослеживается (у крупных животных 2n = 48, 50, 54, 60, а число ЯОР остаётся постоянным), так у лошади с самым большим хромосомным набором всего 3 п.х. с ЯОР; 3) у крота – 1 п.х. с ЯОР; 4) у сумчатых животных в основном 1 п.х. с ЯОР (80%); 5) у рукокрылых – от 0 до 3 п.х. с ЯОР, хотя одна п.х. с ЯОР встречается в два раза чаще, чем другое число. Интересно, что у Carollia castanea методом FISH не выявлено ни одной хромосомы с ЯОР. Поскольку организмы не могут существовать без рДНК, транскрипция которой необходима для образования рибосом, очевидно, данные об отсутствии ЯОР у данного вида являются артефактом. Его появление можно объяснить сложностью выявления ЯОР у Carollia castanea. 6) у приматов – от 1 до 8 (9) п.х. с ЯОР, рассматриваемая тенденция прослеживается у высших приматов, у орангутана и шимпанзе число ЯОР больше, чем у человека; 7) у кролика 3 п.х. с ЯОР; 8) у собаки – от 4 до 8 п.х. с ЯОР, с чем связан такой разброс непонятно;5. у беспозвоночных обычно одна п.х. с ЯОР (встречается у 70%), но их число порой доходит до пяти (Euglossa, у которой самый большой генотип). Итак, мы рассмотрели зависимость числа ЯОР от числа хромосом в диплоидном наборе в разных таксономических группах. Почти с уверенностью можно сказать, что строгой корреляции между числом ЯОР и хромосом не наблюдается, а редкое её выполнение у некоторых групп организмов скорее связано со случайными факторами. Теперь решим задачи, поставленные во втором пункте раздела «Цели и задачи»: сравним изменение ЯОР в эволюционном ряду организмов. На рис. 3 представлена схема, где показано среднее число ЯОР в крупных таксонах. Если смотреть в общих чертах, то при осложнении организации животных наблюдается увеличение числа ЯОР. Так, например, у млекопитающих их число заметно больше, чем нижестоящих групп в эволюционной лестнице, а у высокоорганизованных приматов их среднее число равно 5,4. Такое увеличение ЯОР возможно связано с резким увеличением метаболических процессов в клетках млекопитающих, в том числе синтезов белков на рибосомах, связанное также с переходом данной группы к теплокровности. Различия в отделах млекопитающих по числу ЯОР может быть результатом широкого распространения этих животных, различия их ареалов и форм обитания, активности их жизни, длительности беременности, частоты размножения, размеров тела, численности потомства. Так у крупных Копытных животных и приматов – самое большое среднее число ЯОР. В тоже время у не менее крупных представителей отряда Китообразных их среднее число равно 2,0. Те же животные имеют самых длинных период беременности, хотя у лошади этот период равен 11 месяцев, а число ЯОР тем не менее равно 3. У хищных животных, ведущих активных образ жизни и также, в общем, являющимися крупными животными, число ЯОР велико, а у неактивных насекомоядных и рукокрылых – крайне мало. У активно размножающихся животных (грызуны, кролики) число ЯОР занимает промежуточное значение, а у редко размножающихся – крайние. Грызуны и кролики ещё являются и мелкими животными, также как рукокрылые и насекомоядные. При этом значение 6,0 числа ЯОР у хищных не следует воспринимать всерьёз, так как оно получено как среднее арифметическое двух несовпадающих данных по числу ЯОР у одного организма – собаки, но известно, что, например, у кошки число ЯОР равно 2, так что средним числом ЯОР у хищных является что-то между числом ЯОР у приматов и грызунов. Промежуточное положение хищных по числу ЯОР подтверждает таблица № 2.Таблица №2. Сравнение жизненных параметров и числа ЯО у отделов млекопитающих. Отдел Б Р А ИР ПЖ ЯО Насекомоядные ↓ ↓ ↓ ↑ ↓ 1,0 Сумчатые ↓ ↑↓ ↓ ↑↓ ↓ 1,2 Рукокрылые ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ 1,5 Грызуны ↓ ↓ ↑ ↑ ↓ 2,7 Зайцеобразные ↓ ↓ ↑ ↑ ↓ 3,0 Хищные ↑↓ ↑↓ ↑ ↑↓ ↑ 6? Китообразные ↑ ↑ ↓ ↓ ↑ 2,0 Копытные ↑ ↑ ↓ ↓ ↑ 3,8 Приматы ↑ ↑ ↓ ↓ ↑ 5,4 Здесь Б – продолжительность беременности, Р – размер животного, А – активность и подвижность, ИР – интенсивность размножения, ПЖ – продолжительность жизни, ЯО – среднее число пар хромосом с ядрышковым организатором. Сопоставляя табличные данные можно выделить три группы организмов: с высокой интенсивностью размножения и активностью: грызуны, зайцеобразные. с продолжительным периодом беременности и с крупными размерами: копытные, приматы, китообразные, а также хищные – переходная форма между 1. и 2. все остальные, с малыми активностью, относительно коротким периодом беременности и небольшими размерами. При этом, как видно из таблицы, у животных 3-ей группы число ЯОР колеблется от 1 до 1,5, то есть мало; у животных 1-ой группы оно стремится к 2,5-3; у животных 2.-группы оно больше 3,8. Исключение составляют китообразные, у которых два ЯОР, но, например, у свиньи, кошки, некоторых приматов их тоже два, что только подтверждает правило о том, что сравнение средних значений порой приводит к неполному рассмотрению и пониманию картины. И, тем не менее, это дало вполне наглядный результат без применения каких-либо сложных математических формул. Как результат, мы получили не строгую, но наглядную и ясную модель, где ряд параметров организма приводится в соответствие с числом ЯОР. Конечно, можно было бы рассмотреть ещё некоторые параметры, но это бы только усложнило восприятие информации. Здесь мы не станем вдаваться в подробности насчёт изменения числа ЯОР у более низших позвоночных, так как эта тема очень сложна, а информационная база недостаточна, чтобы делать какие-либо выводы. Возможно, тут играют роль те же параметры, но несколько изменённые (например, вместо периода беременности – период созревания яйца), что и у млекопитающих.Рис. 3 Схематичное изображение таксономических групп и среднего значения числа ЯОР в каждой группе.Теперь перейдём к разбору отдела Грызуны с наиболее вариабельным числом ЯОР. С чем же связана такая изменчивость? В первую очередь стоит покритиковать методы выявления ЯОР: даже вроде бы аккуратный FISH-метод может дать у разных исследователей разные результаты. Во-первых, у методов существует ряд модификаций, что может быть причиной расхождений между данными, полученными разными авторами. Особенно много модификаций у метода серебрения, что делает этот и без того неточный метод (о неточности см. во введении) ещё и очень вариабельным, что в полной мере проявляется при анализе числа ЯОР у Грызунов. Очень сложно сравнивать такие данные, но вероятно в этом виновны не только методы. Число ЯОР изменяется от 0 до 11 (см. таблицы № 3 и № 4). При этом стоит учесть, что в статьях иногда описывают все хромосомы, на которых ЯОР выявляется в серии опытов, а разные опыты могут показать ЯОР на разных хромосомах, а среднее число ЯОР указать забывают. Так, 11 хромосом у мыши – результат такой забывчивости (конечно, их не 11, а значительно меньше). Во-вторых, Ag-метод пользуется несравненно большим спросом из-за своей простоты, быстроты и дешевизны, и мы должны довольствоваться большей частью сомнительными результатами. В-третьих, действительно, в разных клетках одного организма может выявляться разное число ЯОР, но и данный феномен скорее есть методическая ошибка (все клетки организма тотипотентны и содержат всю полноту генетической информации, в том числе всю рДНК). Наиболее стабильны данные по числу ЯОР у крысы Rattus norvegicus – все сходятся во мнении, что у неё 3 п.х. с ЯОР. Также 3 п.х. с ЯОР имеют виды рода Mus (кроме Mus musculus, об этом позже) и кактусовый хомячок (FISH), полёвки имеют 1 п.х. с ЯОР, сони и лемминги – 2 п.х. с ЯОР. Расхождения в числе ЯОР обнаружены у двух видов хомячков - сирийского и китайского. При выявлении ЯОР у китайского хомячка были использованы оба метода: Ag-метод показал активные ЯОР на № 4 и 5 хромосом, тогда как FISH-метод в двух других случаях, кроме 4 и 5, показал также ЯОР на хромосомах 6 и X. У сирийского хомячка в одном случае Ag-методом было выявлено 5 п.х. с ЯОР, а в другом – тоже 5 п.х. с ЯОР: № 6, 9, 16, 17, 19, но в этом случае иногда ЯОР выявлялись и на 2, 10 и 13 хромосомах. Результаты по грызунам ещё раз подтверждают, что число ЯОР не зависит от числа хромосом в диплоидном наборе: у Microtus agrestis (2n = 50) вообще не найдено ЯОР, тогда как у Akodon arviculoides (2n = 14) они обнаружены на 4 п.х.Таблица №3. Число ЯОР у грызунов (Rodentia). № Название организма Метод число ЯОР (№ЯО-хромосомы) число хром. №статьи 1 Mus spretus 3 (№4,13,19) 56 2 Rattus norvegicus (крыса) Ag-окр. 3 (№3,11,12) 2n = 42 66,70 3 Rattus norvegicus (крыса) Ag-окр. 3 2n = 42 67,68,69 4 Chinese hamster (Cricetulus griseus) Ag-окр. 2 (№4,5) 2n = 22 5 5 Eliomys quercinus (садовая соня) Ag-окр. 2 6 6 Akodon arviculoides Ag-окр. 4 (№3,4,5,X) 2n = 14 8 7 Chinese hamster (Cricetulus griseus) FISH 4 (№4,5,6,X) 2n = 22 13 8 Syrian hamster (Mesocricetus auratus) Ag-окр. 5 2n = 44 12 9 Phodopus sungarus (джунгарский хомячок) Ag-окр. 4 2n = 28 12 10 Myopus schisticolor (лемминг) Ag и FISH 2 (№5,12) 15 11 Microtus rossiaemeridionalis (полёвка восточноевропейская) Ag-окр. 1 (№16) 16 12 Microtus transcaspicus (полёвка) Ag-окр. 1 (№11) 16 13 Mus platythrix 3 (№5,8,12) 2n = 26 57 14 Syrian hamster (Mesocricetus auratus) Ag-окр. 5-8 (№6,9,16,17,19 (2 10 13)) 2n = 44 80 15 Trichomys apereoides Ag-окр. 1 (№1) 2n = 30 85 16 Cricetulus migratorius (армянский хомячок) Ag-окр. 4 (№2,4,6,7,8) 39 17 Microtus agrestis (тёмная полёвка) FISH 0 2n = 50 3 18 Peromyscus eremicus (cactus mouse) FISH 3 (№8,9,10) 2n = 48 3 19 Chinese hamster (Cricetulus griseus) FISH 4 (№4,5,6,X) 2n = 22 3 20 Apodemus (wood mice) 1- 2 86 Теперь отдельно изучим поведение числа ЯОР у мыши Mus musculus, где их число колеблется от 3 до 11 (таблица № 4). Как правило, при определении числа ЯОР используют метод серебрения, что привносит дополнительные трудности в оценку их числа. Но только ли в этом причина? Возможно, такие несоответствия – это свойство самих рибосомных генов, которые относятся к умеренно повторяющимся генам и подвержены генетической рекомбинации. Однако это может быть связано с высокой плодовитостью мышей и другими характерными для грызунов признаками. Таблица № 4. Лабильность ЯОР у мыши (2n = 40). № Название организма Метод число ЯОР (№ ЯО-хромосом) №статьи 1 Mus musculus Ag-окр. 11 (№4,8,9,10,11,12,15,16,17,18,19) 55 2 Mus musculus Ag-окр. 3 (№15,18,19) 11 3 Mus musculus Ag-окр. 4--7 9 4 Mus musculus Ag-окр. 5 10 5 Mus musculus Ag-окр. 6 (№12,15,16,17,18,19) 54 6 Mus musculus Ag-окр. 5 (№12,15,16,17,18) 58 7 Mus musculus 8 (№5,6,9,12,17,18,19,X) 59 8 Mus musculus Ag-окр. 4 (№12,15,16,18) 35 Рис. 4 Ag-ЯОР окраска метафазных пластинок хромосом, полученных из фибробластов мыши линии L. – стрелками указаны 9 Ag-ЯОР.Рис. 5 Гибридизация in situ с пробами рДНК метафазных хромосом из фибробластов мыши культуры L. ^ Синий цвет – окраска хромосом ДАПИ, красный цвет – FISH-сигналы. Стрелки – FISH-ЯОР, большая стрелка указывает на хромосому с асимметричным ЯОР.ВыводыНа основании результатов и их обсуждения можно сделать выводы, то есть дать ответы на задачи, поставленные вначале работы: Число ЯОР не зависит от числа хромосом на клетку. Данный факт доказан рядом примеров – прямого соответствия нет.Число ЯОР, как правило, увеличено у организмов с более высокой организацией и, очевидно, является эволюционно благоприятным признаком. Сравнение основных методов выявления ЯОР показало, что FISH - более предпочтителен, поскольку позволяет выявлять все ЯОР в кариотипе вида. При этом Ag-метод остаётся по-прежнему главным методом выявления ЯОР у животных.Сравнение ЯОР в отдельно взятом отряде показало, что даже в небольших таксономических единицах число ЯОР может заметно отличаться у разных видов. 5. У мыши вида Mus musculus по данным разных авторов число ЯОР сильно различается. Определение их числа с помощью FISH может являться предметом будущих исследований.ЛитератураEric O. Long, Igor B. Dawid (1980) Ann. Rev. Biochem. 49: 727-64Ю.С. Ченцов «Введение в клеточную биологию», ИКЦ «Академкнига», 2004Hsu TC, Spirito SE, Pardue ML. (1975) Chromosoma 53: 25-36А.С. Графодатский, С.И. Раджабли «Хромосомы сельскохозяйственных и лабораторных млекопитающих», «Наука», Новосибирск, 1988 Ray M. Cytobios. 1979;25(97):37-43Zurita F, Jimenez R, Diaz de la Guardia R, Burgos M. Chromosome Res. 1999;7(7):563-70Toder R, von Holst D, Schempp W. Cytogenet Cell Genet. 1992;60(1):55-9Yonenaga-Yassuda Y, Assis Mde F, Kasahara S, L'Abbate M, Souza MJ. Cytogenet Cell Genet. 1983;35(2):143-7Chaudhuri A, Ghosh S. J Cancer Res Clin Oncol. 1983;106(3):192-4Mirre C, Knibiehler B. J Cell Sci. 1982 Jun;55:247-59Spence MA, Luthardt FW. Cytogenet Cell Genet. 1975;15(4):276-80Bigger TR, Savage JR. Cytogenet Cell Genet. 1976;16(6):495-504Blin N, Stohr M, Hutter KJ, Alonso A, Goerttler K. Chromosoma. 1982;85(5):723-33Olmos S, Reinoso MF, Marquez MG, Roux ME. Metabolism. 2001 Sep;50(9):1025-9Liu WS, Fredga K. Chromosome Res. 1999;7(3):235-40Mazurok NA, Rubtsova NV, Isaenko AA, Nesterova TB, Meier MN, Zakiian SM. Genetika. 1998 Aug;34(8):1073-80Foresti F, Almeida Toledo LF, Toledo SA. Cytogenet Cell Genet. 1981;31(3):137-44Phillips R, Ihssen PE. Can J Genet Cytol. 1985 Aug;27(4):433-40Phillips RB, Zajicek KD, Utter FM. Can J Genet Cytol. 1986 Aug;28(4):502-10Daga RR, Thode G, Amores A. Chromosome Res. 1996 Jan;4(1):29-32Rabova M, Rab P, Ozouf-Costaz C. Genetica. 2001;111(1-3):413-22Proenca SJ, Serrano AR, Collares-Pereira MJ. Genetica. 2002 Apr;114(3):237-45Koehler MR, Dehm D, Guttenbach M, Nanda I, Haaf T, Molina WF, Galetti PM Jr, Schmid M. Chromosome Res. 1997 Feb;5(1):12-22Ueda T, Sato R, Kobayashi J. Jpn J Genet. 1988 Jun;63(3):219-26Ward OG. Can J Genet Cytol. 1977 Mar;19(1):51-7Tymowska J, Fischberg M. Cytogenet Cell Genet. 1982;34(1-2):149-57Ruiz IR, Soma M, Becak W. Cytogenet Cell Genet. 1981;29(2):84-98Santos N, Fagundes V, Yonenaga-Yassuda Y, De Souza MJ. Hereditas. 2002;136(2):137-43Santos N, Fagundes V, Yonenaga-Yassuda Y, De Souza MJ. Hereditas. 2001;134(3):189-94Dhaliwal MK, Pathak S, Shirley LR, Flanagan JP. Cytobios. 1988;56(224):29-38Di Berardino D, Arrighi FE, Kieffer NM. J Hered. 1979 Jan-Feb;70(1):47-50Di Berardino D, Iannuzzi L, Bettini TM, Matassino D. Can J Genet Cytol. 1981;23(1):89-99Di Berardino D, Iannuzzi L. J Hered. 1981 May-Jun;72(3):183-8Mayr B, Tesarik E, Auer H, Burger H. Genetica. 1987 Dec 15;75(3):207-12Pathak S, Van Tuinen P, Merry DE. Cytogenet Cell Genet. 1982;34(1-2):112-8Shibasaki Y, Poulsen BS, Johansen B, Ronne M. In Vivo. 1990 Jul-Aug;4(4):243-6Cavagna P, Marzella R, Rocchi M, Chiarelli B. Somat Cell Mol Genet. 1998 Sep;24(5):303-6Boron A. Genetica. 1999;105(3):293-300Pathak S, Lau YF, Drwinga HL. Chromosoma. 1979 Jun 21;73(1):53-60Svartman M, Vianna-Morgante AM. Genetica. 2003 May;118(1):11-6Privitera E. Chromosoma. 1980;81(3):431-7Romagnano A, Richer CL, Messier PE, Jean P. Cytobios. 1987;49(196):23-30Verma RS, Rodriguez J, Shah JV, Dosik H. Mol Gen Genet. 1983;190(2):352-4Martin AO. Stain Technol. 1985 Sep;60(5):275-84Miller OJ, Miller DA, Dev VG, Tantravahi R, Croce CM. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976 Dec;73(12):4531-5Tantravahi R, Miller DA, Dev VG, Miller OJ. Chromosoma. 1976 Jun 30;56(1):15-27Mikelsaar AV, Schmid M, Krone W, Schwarzacher HG, Schnedl W. Hum Genet. 1977 Jun 10;37(1):73-7Goodpasture C, Bloom SE, Hsu TC, Arrighi FE. Am J Hum Genet. 1976 Nov;28(6):559-66Ozen M, Hopwood VL, Pathak S. Am J Med Genet. 1995 Nov 6;59(2):225-8Chen C, Munderloh UG, Kurtti TJ. J Med Entomol. 1994 May;31(3):425-34Mayr B, Auer H, Schleger W, Czaker R, Burger H. J Hered. 1985 May-Jun;76(3):222-3Maffei EM, Pompolo SG, Silva-Junior JC, Caixeiro AP, Rocha MP, Dergam JA. Cytobios. 2001;104(406):119-25Merry DE, Pathak S, VandeBerg JL. Cytogenet Cell Genet. 1983;35(4):244-51Dev VG, Tantravahi R, Miller DA, Miller OJ. Genetics. 1977 Jun;86(2 Pt. 1):389-98Suzuki H, Kurihara Y, Kanehisa T, Moriwaki K. Mol Biol Evol. 1990 May;7(3):271-82Winking H, Nielsen K, Gro