Реферат по предмету "Разное"


«Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

На правах рукописиКонькова-Рейдман Алена БорисовнаЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯИ КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕВЫХ БОРРЕЛИОЗОВ (МОНО- И МИКСТ-ИНФЕКЦИЯ С КЛЕЩЕВЫМ ЭНЦЕФАЛИТОМ)В ЮЖНО-УРАЛЬСКОМ РЕГИОНЕ РОССИИ 14.02.02 – эпидемиология 14.01.09 – инфекционные болезниАвтореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наукОмск - 2011Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»Научные консультанты:доктор медицинских наук,профессор, академик РАМН Злобин Владимир Игоревич доктор медицинских наук, профессор Ратникова Людмила Ивановна Официальные оппоненты:доктор медицинских наук Ястребов Владимир Константинович доктор медицинских наук Козлова Ирина Валерьевнадоктор медицинских наук, Лепехин Алексей Васильевич профессор Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»Защита состоится «_____»_____________2011 г. в «______» часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.208.065.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» по адресу: 644043, Омск, ул. Ленина, 12; тел.(3812) 23-13-32. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омской государственной медицинской академииАвтореферат разослан «______»_____________2011 г.И.О. ученого секретаря диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор В.А. Ширинский^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность проблемы Природноочаговые инфекции, передающиеся иксодовыми клещами, такие как иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ), клещевой энцефалит (КЭ) и их микст-формы представляют серьезную проблему здравоохранения для большинства территорий Российской Федерации. На протяжении последней четверти ХХ века заболеваемость этими инфекциями неуклонно росла и достигла беспрецедентно высокого уровня (Злобин В.И., Горин О.З., 1996; Коренберг Э.И., 1996; Борисов В.А., 2002; Злобин В.И., 2010). В пределах России находится значительная или даже большая часть мирового ареала ^ B. burgdorferi sensu lato (Коренберг Э.И. и др., 1995). По мере улучшения диагностики показатели заболеваемости неуклонно приближаются к прогнозированной величине, которая составляет не менее 10-12 тыс. случаев в год. Наибольшее число случаев приходится на Урал, Западную Сибирь и Волго-Вятский регион (Коренберг Э.И., 2001; Ястребов В.К., Утенкова Е.О., 2010). На территории России практически все очаги ИКБ и КЭ являются сочетанными. Районы интенсивного роста заболеваемости ИКБ в основном совпадают с зоной высокого риска заражения КЭ (Матущенко А.А., 2002; Вельгин С.О. и др., 2007; Козлова И.В., 2008; Баранова Н.С. и др., 2010). Показано нередкое наличие микст-форм при заражении двумя и более геновидами боррелий, а также боррелий в сочетании с вирусом КЭ. Удельный вес микст-инфекции среди больных с ИКБ составляет от 5 до 30% по данным разных авторов (Коренберг Э.И., 2002; Леонова Г.Н. и др., 2002; Оберт А.С. и др., 2001; Ястребов В.К., 2010). Имеются отдельные работы, которые затрагивают некоторые аспекты эпидемиологии клещевых моно- и микст-инфекций на территории Уральского региона (Волкова Л.И. и др. 2003; Колясникова Н.М., 2008 г.), но в них не проведен комплексный анализ, необходимый для выявления тенденций в динамике заболеваемости, определения ее структуры, клинических форм, прогноза и планирования противоэпидемических и лечебных мероприятий. Отсутствуют данные об уровне зараженности переносчиков возбудителями клещевых инфекций, в т.ч. микст-инфицированности, не известны генетическая структура возбудителей, современный ареал, процессы формирования антропоургических очагов. Не дана оценка влияния объемов и качества профилактических мероприятий на уровень заболеваемости, нет обоснований современных подходов к профилактике клещевых инфекций. Вместе с тем особую проблему составляют в настоящее время энцефалитно-боррелиозные микст-заболевания. В Екатеринбурге сочетание двух инфекций отмечено у 10,72,2% всех больных КЭ и ИКБ, что составляет 6,3 на 100 тыс. человек (Лесняк О.М., 1999), в Северо-Западном регионе России – в 15% наблюдений (Лобзин Ю.В., Усков А.Н., 2000); в Томской области от 25-30% до 40% случаев ИКБ протекает одновременно с КЭ (Лепехин А.В. и др.,2000; Ундинцева В.А. и др., 2010). Ряд авторов отмечает явление патоморфоза КЭ, различия в тяжести течения, преобладании определенных клинических форм, летальности в пределах нозоареала (Злобин В.И., 2006; Иерусалимский А.П., 2000; Волкова Л.И., Ковтун О.П., 2010; Захарычева Т.А., 2010; Толоконская Н.П. и др., 2010). Если клинико-патогенетические аспекты моно-инфекции КЭ и ИКБ достаточно глубоко изучены, то механизмы взаимовлияния, интерференции и взаимоисключения при микст-инфекции (МИ) этих возбудителей остаются практически не исследованными. Вовлечение в процесс нервной системы при обеих инфекциях усложняет диагностику и изучение микст-инфекции (Лобзин Ю.В. и др., 2000; Деконенко Е.П. и др., 2002). К настоящему времени глубоко исследованы на системном и локальном уровне цитопатические проявления и апоптотические процессы при КЭ (Olsen C.W., Kehren J.C.,1999; Komatsu, Т., 1999; Boje K. et al., 2002). Практически не исследованы механизмы иммуноопосредованного воспаления при МИ. Интерес представляет анализ нарушений иммунного гомеостаза на системном уровне и в пределах ЦНС, в частности, популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов, количественное изучение продуктов индуцированной секреции медиаторов воспаления, образуемых активированными клетками нервной ткани, макрофагальными элементами нейроглии (интерлейкины, оксид азота, комплемент, БТШ), что не исследовано при КЭ, микст-инфекции с ИКБ и собственно ИКБ, протекающих с преимущественным поражением нервной системы. Секреторные продукты иммуноцитов, как показано в большом цикле работ различных авторов, несомненно, обладают нейромедиаторными и психотропными эффектами. На эмоциональную сферу человека оказывают влияние нейропептиды костного мозга и тимуса, установлена нейротрансмиттерная роль секреторных продуктов иммуноцитов: ИЛ-1, ИЛ-6, ИФН-(Кравцов А.Н. и др., 2004; Connor T.J.et al., 1998; Dinan T.G. et al., 1998; Segman R.H. et al., 2002). Наличие нейропсихологических изменений, выявленных у пациентов, перенесших клещевые инфекции, является одним из показателей завершенности процесса или его прогредиентности, поскольку с разрешением основного заболевания становится более благоприятным восстановление мнестических расстройств (Ерман Б.А., 2001; Иерусалимский А.П., 2003). При КЭ были отмечены мнестико-интеллектуальные и характерологические нарушения (Помогаева А.П., 2006; Надеждина М.В., 2007). До 54% реконвалесцентов, перенесших ИКБ, беспокоили снижение памяти и нарушение концентрации внимания, не имеющие объективного подтверждения, но отражающиеся на качестве жизни пациентов (Деконенко Е.П., 2005; Бондаренко А.Л. и др., 2006; Steere A.C., 1989; Logigan E.L., 1996). Однако, несмотря на проводимые исследования, психосоматические феномены при КЭ и ИКБ остаются недостаточно изученными, а при МИ – неизвестными. Установлено изменение характера нитроксидергической регуляции на системном и локальном уровне при КЭ (Конькова А.Б., 2001), однако не исследованы эти процессы при микст-инфекции с ИКБ. Между тем усиление системной и локальной продукции NO может приводить к инициации процессов апоптоза, свободнорадикального окисления и требует патогенетически обоснованной медикаментозной коррекции. Указанные мотивы послужили основанием для проведения настоящей работы. ^ Цель исследования: на основании результатов комплексных эпидемиологических и клинико-иммунологических исследований установить региональные особенности этиологии, эпидемиологии, иммуноопосредованные механизмы патогенеза при различных клинических формах иксодовых клещевых боррелиозов (моно- и микст-инфекция с КЭ) на эндемичной территории Южного Урала, обосновать рациональные подходы к патогенетически ориентированной терапии.^ Задачи исследования: 1) охарактеризовать основные эпидемиологические закономерности иксодовых клещевых боррелиозов, клещевого энцефалита, микст-инфекций в Южно-Уральском регионе; 2) осуществить сравнительный молекулярно-эпидемиологический анализ возбудителей клещевого энцефалита и иксодовых клещевых боррелиозов на территории Челябинской области; 3) выявить региональные этиологические и клинико-эпидемиологические особенности «клещевых» инфекций на территории Южно-Уральского региона России; 4) изучить клиническую характеристику «клещевых» инфекций, этиологически обусловленных различными патогенами, и их генетическими вариантами, микст-инфекции, вызванной сочетанным инфицированием вирусом КЭ и боррелиями; 5) изучить тип иммунного ответа на системном и локальном уровне, в том числе анализ нарушений иммунного гомеостаза в пределах ЦНС и проницаемости ГЭБ при подостром течении иксодовых клещевых боррелиозов с преимущественным поражением нервной системы, КЭ и микст-формах по семиотике поражения ЦНС; 6) разработать патогенетическую схему клеточно-молекулярных иммунных нарушений при ИКБ (моно и микст-инфекция с КЭ), протекающих с поражением ЦНС; 7) оптимизировать тактику лечения микст-инфекции (КЭ+ИКБ) и собственно КЭ на основе внедрения патогенетически ориентированных методов коррекции нитроксидергических процессов.^ Научная новизна Получена достоверная информация о генетической вариабельности возбудителей ИКБ в основных переносчиках (B. garinii NT 29, B. garinii 20047, В. afzelii) и в биологических материалах от больных (B. garinii, B. afzelii и Borrelia burgdorferi sensu stricto), что подтверждает роль геновидов боррелий патогенного комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato в развитии ИКБ у больных в Челябинской области. Показано спонтанное инфицирование иксодовых клещей вирусом КЭ, относящимся к сибирскому субтипу, субгенотипу «Заусаев». Проведен количественный анализ содержания в клещах ДНК боррелий и РНК ВКЭ посредством ПЦР с электрофоретической или гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакций в реальном времени. Разработан новый подход к изучению центральных механизмов регуляции иммунного ответа на системном и локальном уровнях при клещевых нейроинфекциях, протекающих с поражением ЦНС на основе анализа клеточных (иммунотипирование мононуклеаров ликвора) и гуморальных про- и противовоспалительных факторов (метаболиты нитроксид-молекулы, цитокины, белки системы комплемента, иммуноглобулины, ферритин). Новыми являются сведения об иммунологических особенностях патогенеза иксодовых клещевых боррелиозов (моно- и микст-инфекция с КЭ), в том числе нарушений проницаемости ГЭБ при микст-инфекции (ИКБ+КЭ), что является основанием для определения направлений коррекции выявленных нарушений. Разработана клеточно-молекулярная схема патогенеза ИКБ и микст-инфекции, протекающих с поражением ЦНС. ^ Практическая значимость работы Разработана система повышения качества лабораторной диагностики трансмиссивных клещевых инфекций на эндемичной территории Челябинской области за счет использования современных молекулярно-генетических тестов и расширения спектра определяемых патогенов. Для улучшения лабораторной диагностики внедрены в практическую работу ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области" современные молекулярно-генетические методы исследования основных переносчиков КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ, что будет способствовать повышению качества экстренной профилактики клещевых инфекций и, в конечном итоге, реальному снижению заболеваемости трансмиссивными клещевыми инфекциями в регионе. Структуры нуклеотидных последовательностей фрагмента гена белка оболочки ВКЭ (ген Е) депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank: 1) TBEV Cheliabinsk GU 143821, 2) TBEV Cheliabinsk GU 143822, 3) TBEV Cheliabinsk GU 143820 под № 1281338, № 1281349, № 1281351. Оригинальным направлением в лечении изучаемых инфекций является применение патогенетической коррекции нарушений нитроксидергической регуляции при моно- и микст-инфекциях. Новизна способа защищена патентом на изобретение. (№ 2007103435/14(003704): «Применение цитофлавина для лечения клещевых нейроинфекций»).^ Основные положения, выносимые на защиту:1. Территория Челябинской области является эндемичной по иксодовым клещевым инфекциям (иксодовые клещевые боррелиозы, клещевой энцефалит, микст-инфекция); уровни заболеваемости в течение последних 12 лет превышали показатели по РФ в 2-8 и 5-14 раз соответственно; начиная с 1999 г. в области отмечается тенденция снижения заболеваемости.2. Молекулярная эпидемиология возбудителей «клещевых» инфекций на территории Челябинской области характеризуется гомогенностью генетической структуры циркулирующего вируса КЭ, изоляты которого принадлежат сибирскому субтипу, субгенотипу «Заусаев» и несоответствием между спектром геновидов боррелий у основных переносчиков (B. garinii NT 29, B. garinii 20047, В. аfzelii) и в биологическом материале от больных (B. afzelii , B. garinii B. burgdorferi s.s). 3. Челябинская область характеризуется своеобразием эпидемиологии клинических форм и явления патоморфоза клещевого энцефалита по сравнению с другими эндемичными регионами РФ, что выражается в утяжелении клинического течения КЭ, росте менингеальных и очаговых форм. Преимущественная циркуляция геновида В. garinii находится в полном соответствии с клинической картиной заболевания и доказанной нами нейротропностью данного геновида борелий (частота поражений нервной системы, в том числе центрального отдела, составляет по нашим данным - 38,3 %, что существенно превышает данные ряда авторов по Пермскому краю (28 %), Иркутской области (27%), Северо-Западному региону России (37,6%). Южный Урал является самой восточной точкой Евразии, где был обнаружен геновид B. burgdorferi s.s.4. Клещевые нейроинфекции (ИКБ, КЭ и их сочетанные формы) приводят к формированию иммунного ответа на системном и локальном уровнях. Основными патогенетическими механизмами являются: 1) L-аргинин-зависимый механизм с гиперпродукцией метаболитов нитроксид-молекулы в крови и ликворе, 2) прогрессирующий апоптоз как результат прямого проапоптогенного действия NO на клетки-мишени и опосредованного действия нейропатогенов через активацию TNF-, рецептора CD95, 3) воспалительная цитокиновая реакция, 4) оксидативный стресс мембран нейронов и глии.5. Данные параллельного исследования в сыворотке крови и ликворе флогогенных и антифлогогенных гуморальных факторов отражают характер, выраженность и направленность патологического процесса на различных этапах течения клещевых нейроинфекций (острый период, период реконвалесценции) и позволяют контролировать эффективность комплексной, в том числе, и патогенетически ориентированной терапии. Использование цитофлавина, как средства нейромедиаторной поддержки, с целью коррекции гиперпродукции оксида азота у больных клещевыми нейроинфекциями, является патогенетически обоснованным.Внедрения Основные положения и результаты исследования используются в повседневной практической работе инфекционных отделений, ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области». В результате проведенного исследования разработаны и внедрены в практику работы отделений инфекционного корпуса № 1, № 4 ГКБ № 8, городского центра нейроинфекций г. Челябинска способ патогенетически ориентированной терапии клещевых нейроинфекций, подтвержденный патентом на изобретение РФ, и способ этиологической диагностики иксодовых клещевых боррелиозов методом ПЦР. Для осуществления практической деятельности с учетом результатов исследования разработаны и опубликованы методические рекомендации для врачей «Иксодовые клещевые боррелиозы: моно и микст-инфекция (клиника, диагностика, лечение, профилактика)», утвержденые приказом МЗ Челябинской области № 637 от 16.07.2008 г., подготовлен и находится на утверждении в МЗ РФ «Стандарт специализированной медицинской помощи больным иксодовыми клещевыми боррелиозами» (2008 г.) Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней с курсом эпидемиологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия». ^ Апробация материалов диссертации Основные положения и результаты работы были представлены на втором Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2004 г.), Всероссийском конгрессе по иммунологии и аллергологии (Уфа, 2005 г.), научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2005); Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней военно-медицинской академии им. С.Н.Кирова (СПб., 2006 г.), областных научно-практических конференциях врачей-инфекционистов и эпидемиологов (Челябинск, 2006, 2008), Юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии в клинической практике», посвященной 70-летию кафедры инфекционных болезней (Уфа, 2007 г.), 7-ом Всероссийском съезде инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Н. Новгород, 2006), научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины» (СПб., 2007), на юбилейной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 175-летию со дня рождения С.П.Боткина (Санкт-Петербург., 2007), научно-практической конференции, посвященной 75-летию Дагестанской государственной медицинской академии «Инфекционные болезни: актуальные вопросы в клинике и эксперименте» (Махачкала, 2007), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы внутренних болезней: традиционные и психосоматические подходы» (Челябинск, 2007), научно-практической конференции «Инфекции в практике клинициста: антибактериальная и антивирусная терапия на догоспитальном и госпитальном этапах» (Харьков, 2008 г.), 1 Ежегодном Российском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2009), Российской научно-практической конференции, посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Сибирского государственного медицинского университета «Актуальные проблемы инфекционной патологии» (Томск, 2009 г.), межрегиональной научно-практической конференции «Полипатии в семейной и клинической медицине, посвященной 65-летию ЧелГМА и памяти профессора П.Д. Синицина (Челябинск, 2009), 7 итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2009), Второй Национальной конференции с международным участием «Нейроинфекции. Современные аспекты клещевых нейроинфекций» (Екатеринбург, 2010), научной конференции с международным участием «Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней» (Иркутск, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2010). По материалам диссертации опубликовано 37 печатных работ, из них 13 в рекомендуемых ВАК изданиях. Имеется патент на изобретение (№ 2007103435/14(003704): «Применение цитофлавина для лечения клещевых нейроинфекций»), методические рекомендации для врачей.^ Структура и объем диссертационной работы Диссертационная работа изложена на 359 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов, восьми глав собственных исследований, обсуждения результатов работы и заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Работа иллюстрирована 39 рисунками и 59 таблицами. В работе представлено 8 выписок из истории болезни. Библиографический указатель содержит 478 источников, из которых 230 работ отечественных и 247 зарубежных авторов.^ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫОбъекты, методы и объем исследований Для анализа эпидемиологической ситуации по трансмиссивным клещевым инфекциям в г. Челябинске и Челябинской области изучены архивные данные заболеваемости ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области» за период с 1998 по 2010 гг. Источники информации: данные государственной статистической отчетности: Ф. №2 «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях», Ф. №5 «Сведения о профилактических прививках, Ф. №60 «Журнал учета инфекционных больных», Ф. №003/У «Медицинская карта стационарного больного», Ф. №025/У «Медицинская карта амбулаторного больного», первичная отчетно-учетная документация лечебно-профилактических учреждений, Центра гигиены и эпидемиологии в Челябинской области (ЧО), Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по ЧО. В ходе работы по определению антигена ВКЭ исследованы 10411 экземпляров клещей. Определение зараженности возбудителями ИКБ осуществлено у 3185 переносчиков методом темнопольной микроскопии. Генетическая вариабельность боррелий изучена при исследовании 1522 экземпляров клещей Ix. persulcatus, 80 образцов крови больных ИКБ, 30 проб мочи и 10 проб СМЖ. На наличие ДНК E. muris и A. phagocytophilia исследовано 453 клеща. Общее количество проведенных лабораторных исследований приведено в табл. 1. Для достижения цели и решения поставленных задач был использован комплекс эпидемиологических, серологических, вирусологических, молекулярно-генетических и статистических методов. При анализе эпидемиологической ситуации в отношении трансмиссивных клещевых инфекций в ЧО и г. Челябинске использовали методы описательной и аналитической эпидемиологии (Черкасский Б.Л., 2001). Изучали уровни, возрастную и профессиональную структуру, территориальную приуроченность, сезонность, обстоятельства заражения лиц заболевших КЭ, ИКБ. При проведении ретроспективного анализа заболеваемости основное внимание уделяли ее многолетней и внутригодовой динамике, изучали объем и качество профилактических мероприятий, осуществляемых на территории рекреационных зон г. Челябинска и ЧО. Особое внимание обращали на сведения о наличии профилактической вакцинации против КЭ, объем, полноту и качество проведенных экстренных профилактических мероприятий в отношении возбудителей КЭ и ИКБ. Для обнаружения боррелий в клещах применяли метод темнопольной микроскопии фиксированных препаратов содержимого кишечника клеща (Коренберг Э.И., 1991). Полученные препараты окрашивали по Романовскому-Гимза и докрашивали кристаллическим фиолетовым. Просмотр мазков осуществляли посредством иммерсионной микроскопии с использованием микроскопа МИКМЕД-2. Таблица 1 Объем проведенных лабораторных исследований Вид и метод исследования КоличествоИсследований Определение антигена вируса КЭ в клеще (ИФА) 10 411 Определение зараженности клещей боррелиями (микроскопия) 3185 Определение наличия ДНК боррелий в клеще (ПЦР) 1522 Определение наличия ДНК боррелий в крови (ПЦР) 80 Определение наличия ДНК боррелий в моче (ПЦР) 30 Определение наличия ДНК боррелий в ликворе (ПЦР) 10 Определение наличия ДНК эрлихий и анаплазм в клеще (ПЦР) 453 Определение наличия ДНК эрлихий и анаплазм в крови (ПЦР) 453 Определения наличия РНК вируса КЭ в клеще (ПЦР) 180 Всего 16324 Для детекции специфического фрагмента ДНК боррелий в клещах использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с набором реагентов для амплификации фрагмента 16SpРНК Borrelia burgdorferi sensu lato (Borrelia burgdorferi sensu stricto B. garinii, B.afzelii) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации с тест-системой «AmplisensBorrelia burgdorferi sensu lato-Eph» согласно инструкции производителя.Для количественной оценки заражённости таёжных клещей ВКЭ и боррелиями исследовали 169 особей ^ Ixodes persulcatus Schulze. Голодных имаго таёжного клеща собирали в мае 2009 г. с растительности в Каштакском бору вблизи поселка Каштак Челябинской области и в Еткульском районе Челябинской области (5509' с.ш., 61026' в.д.). Видовую принадлежность клещей определяли по морфологическим признакам (Павловский А.Е., 1959). Для обнаружения вируса КЭ в клещах применяли комплекс методов. ИФА клещевых суспензий выполняли с применением тест-системы «ВектоВКЭ-антиген-стрип» и «ВекторВКЭ-антиген» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск, серия № D1154). Результаты ИФА учитывали на спектрофотометре ELx800 (BIO-TEK Instruments, USA) при длине волны 450 нм. Детекцию РНК вируса КЭ в клещах осуществляли с помощью коммерческой ПЦР-тест-системы «ВектоВКЭ-РНК-ампли-100» согласно инструкции производителя («Вектор-Бест», Новосибирская область).Выделение штаммов ВКЭ проводили на культуре клеток СПЭВ. Клетки почки эмбриона свиньи (СПЭВ) в среде МЕМ с 10 % эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) выращивали до полного монослоя и проводили заражение клещевыми суспензиями, положительными в ИФА, в минимальном объеме среды МЕМ без сыворотки 1 ч при 37 0С. Наблюдение за развитием цитопатического эффекта проводили в течение последующих 3-5 дней. Нуклеиновые кислоты из индивидуальных клещевых суспензий выделяли с использованием набора РИБО-сорб производства «ИнтерЛабСервис» (г. Москва) в соответствии с инструкцией производителя. Детекцию ДНК боррелий проводили посредством ПЦР с тест-системой «Ампли-Лайм» (# КА-002-2) производства ООО "Омникс" (г. Санкт-Петербург) в следующем режиме: 940С, 1 мин., 520С, 1 мин., 720С, 1 мин., 7 циклов, 940С, 1 мин., 560С, 1 мин., 720С, 1 мин., 23 циклов, 720С 10 мин. на амплификаторе «Терцик» производства «ДНК-технология» (г. Москва). Электрофорез продуктов ПЦР проводили в 2% агарозном геле в ТБЕ (Maniatis et al., 1982). ПЦР в реальном времени проводили с использованием RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия) в следующем режиме 940С 10 сек., 600С 60 сек. 50 циклов. Для количественных оценок ДНК боррелий использовали праймеры и зонд, соответствующие гену основного белка жгутика flaB боррелий комплекса B.burgdorferi s.l. в соответствии с (Hodzic E. et al., 2003). Для построения калибровочной прямой использовали ДНК B. burgdorferi sensu stricto штамм B31 из чистой бактериальной культуры, предоставленную проф. F.Cabello (Medical College.Valhalia. New York, CША) с известной оптической плотностью при длине волны 260 нм. Детекцию РНК вируса КЭ в клещах осуществляли с помощью коммерческой ПЦР-тест-системы «ВектоВКЭ-РНК-ампли-100» согласно инструкции производителя («Вектор-Бест», Новосибирская область). Генотипирование штаммов вируса КЭ осуществляли методом ОТ-ПЦР с детекцией продуктов реакций в режиме реального времени с TaqMan зондами, специфичными для разных генетических типов ВКЭ и путем секвенирования по методу Сэнгера с помощью автоматического секвенатора ABI 373 (Applied Biosystems, США). Мишенью для праймеров (TBE-291 TTCCTGGAYTTGAGAGAGAGGAACCAACCAACACA TBE-31,3 CATGAGCAGTTYCTGARGTCAGTGACCA) и зондов (TBE-FE FAM-CATGGCAGTCCACACAGACCAGA-BQH1, TBE-FE-Ch FAM-CFTGGGAGTTCACACAGATCFGA-BQH1 (дальневосточный генотип), TBE-S FAM- CFTGGCGGTCCACFCTGACCAAA-BQH1 (сибирский генотип), TBE-E ROX-AGTGCCTGTGTCATTTTTCATTGAT-BQH2 (европейский генотип) является участок NS1 гена. Филогенетический анализ определённой нуклеотидной последовательности исследуемых штаммов или изолятов и нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) проводили с использованием программы MEGA версии 4 (Kumar S, Tamura K, Nei M., 2004). Для количественных оценок использовали серию разведений рекомбиниантной плазмиды p BR322-TBEVS*, содержащей клонированную полномеразную ДНК-копию генома ВКЭ ( штамм Софьин). ДНК эрлихий и анаплазм в образцах клещей выявляли с помощью двухраундовой ПЦР с тест-системой «АмплиСенс». ^ Общая характеристика обследованных больных, материалов и клинико-лабораторных методов исследования За период с мая 2002 года по ноябрь 2009 года было обследовано 537 больных с различными клиническими формами инфекций, передающихся иксодовыми клещами. Исследование проводилось методом сплошной выборки среди госпитализируемых больных в остром периоде, в фазе ранней реконвалесценции, а так же после проведения соответствующего этиотропного и патогенетического лечения. Обследование и лечение больных осуществлялось на базе клиники кафедры инфекционных болезней ГОУ ВПО «ЧелГМА», городского центра нейроинфекций, 1-го и 4-го инфекционных отделений ГКБ № 8 г. Челябинска. Среди больных было мужчин 310 (57,7%) и женщин 227 (42,3) в возрасте от 17 до 65 лет. Возраст большинства (84,8%) пациентов не превышал 50 лет. Все пациенты отрицали ранее перенесенные ИКБ и КЭ. Большинство переболевших находились под диспансерным наблюдением в течение 6 месяцев - 1 года. Гендерная характеристика, распределение больных по формам заболевания представлены в табл. 2. Больные ИКБ в соответствии с клинико-патогенетической классификацией (Лобзин Ю.В., 2001) были разделены на 3 группы: острое течение (n= 220), подострое течение (n = 34) , хроническое течение (n= 16). По клиническому маркеру заболевания больные с острым течением инфекционного процесса были разделены нами на две подгруппы: 1 группа – 160 человека (72,7 %) с эритемной формой заболевания и 60 пациентов (27, 3%) с безэритемной формой ИКБ. Легкая степень острых манифестных форм ИКБ наблюдалась у 190 больных, и характеризовалась субфебрильной температурой тела, коротким периодом лихорадки (3-4 дня), умеренно выраженными симптомами общей интоксикации. Мультисистемные симптомы были выражены слабо, либо отсутствовали. К средней степени тяжести относили заболевание (69 человек) с выраженными признаками поражения различных тканей и органов: периферической и центральной нервной системы, сердца, суставов. У этой категории больных температура тела повышалась до 38.0-39.0оС, был ярко выражен синдром общей инфекционной интоксикации. Диагноз хронического ИКБ подтверждали при наличии клинических симптомов, характерных для данного периода развития болезни, и при обязательном обнаружении в сыворотке крови антител к боррелиям в ИФА. У части пациентов подострое и хроническое течение было диагностировано в процессе активного диспансерного наблюдения за реконвалесцентами, перенесшими острый ИКБ. Все пациенты с хроническим течением ИКБ, с целью уточнения характера и уровня поражения НС, кожи, суставов и сердца, осматривались неврологом и терапевтом. Инфицированность одновременно несколькими патогенными боррелиями, входящими в одну группу спирохет B. burgdorferi s.l., позволило рассматривать данную ситуацию как боррелиозную микст-инфекцию с различными вариантами сочетания обнаруженных геновидов (n= 25). Таблица 2 Распределение больных по возрасту, полу и формам заболевания (n= 537) Группы больных Мужчины Женщины абс. % Средний возраст абс. % Средний возраст ИКБ (n=267)эритемная форма (n= 200)безэритемная форма (n=67) 150 48,4 41,5 +2,8 117 51,5 43,1+1,3 113 36,3 44,8+1,8 84 37 44,4+2,5 37 11,9 38,3+1,4 30 13,2 42,1+2,0 МИ (ИКБ+КЭ) (n=100) 60 19,4 35,7+2,3 40 17,6 36,61,8 КЭ (n= 170) 100 32,3 37,5±3,3 70 30,8 38,4±2,1 ВСЕГО: 310 100 39,5± 3,5 227 100 40,9±3,1 С целью изучения иммунного гомеостаза на системном и локальном уровнях обследовали более 300 сывороток крови и более 80 проб СМЖ больных с различными формами изучаемых инфекций. Ликворологические исследования проводили по преимущественным синдромам поражения нервной системы у обследованных контингентов больных (менингит, менингоэнцефалит, менингорадикулоневрит). Общее количество больных с данными синдромами составило 186 человек, из них 47 - больные с боррелиозной (преимущественно подострое течение с развитием серозных менингитов) и микст - инфекцией (КЭ+ИКБ). Исследуемые группы были сопоставимы по возрасту, ведущему клиническому синдрому, этиологии поражения нервной системы. Спектр неврологических синдромов у обследованных лиц представлен в табл.3. У большинства больных ИКБ, КЭ и МИ в периоде реконвалесценции проводилась оценка нервно-психического статуса и изучались когнитивные функции (300 исследований). Контрольную группу подбирали методом случайной выборки. Ее составили 30 условно-здоровых лиц, сопоставимые по полу и возрасту, не предъявлявшие на момент обследования жалоб и не обнаруживающие отклонений при физикальном исследовании, не имеющие хронических инфекционных и соматических заболеваний, подвергнутые аналогичным по объему исследованиям. Контрольную группу (n=25) для ликворологических исследований составили больные, поступавшие в инфекционное отделение с подозрением на серозный менингит, у которых цитологическое, биохимическое, бактериологическое и молекулярно-биологическое исследование ликвора не выявило отклонений от соответствующих нормальных показателей: цитоз не превышал 5 клеток в 1 мкл ликвора, белок 0,15-0, 45 г/л, глюкоза 2,0-4,18 ммоль/л при одновременном определении аналогичного показателя в сыворотке крови, где он в норме в 2 раза выше, хлориды 120,0-130,0 ммоль/л, имуноглобулин G Таблица 3 Семиотика неврологических расстройств у обследуемых контингентов больных Синдромы ^ Клинические, клинико-лабораторные и инструменталь­ные методы обследования Для обследования было использовано динамическое неврологи­ческое наблюдение с момента поступления больного в стационар и до его выписки, которое включало изучение чувствительной и двигательной сфер, выявление менингеального симптомокомплекса (определение ригидности затылочных мышц, симптомов Кернига и Брудзинского). Когнитивные функции исследовались с помощью MMS-теста. Психологическое обследование включало определение: 1) реактивной и личностной тревожности; 2) выявление текущего «депрессивного эпизода» с помощью шкалы Гамильтона для оценки депрессии, 3) факторы интроверсии-экстраверсии, нейротизма. Стандартная процедура обследования состояла из общеклинических исследований (гемограмма, общий анализ мочи), биохимических исследований (содержание билирубина и его фракций, активность АлАТ, АсАТ (367 исследований)). Наряду с общепринятыми клиническими методами обследования больных, проводились дополнительные исследования, которые включали серологические, молекулярно-биологические (ПЦР) методы диагностики ИКБ и КЭ. По показаниям исследовали ликвор для выявления воспалительных изменений, обусловленных поражением ЦНС при клещевых инфекциях. Для ИФА использовали тест-системы «Боррелиоз-ИФА-IgM» и «Боррелиоз-ИФА-IgG» производства НПФ «Хеликс» (г.Санкт-Петербург) с композицией рекомбинантных белков разных геномовидов боррелий, сорбированных на внутренней поверхности лунок полистироловых стрипов. Специфические антитела сыворотки после взаимодействия с сорбированными антигенами, детектировались с помощью моноклональных антител против иммуноглобулинов человека (IgM и IgG). Определение специфических антител класса IgM и IgG к ВКЭ осуществляли методом ИФА с использованием коммерческих наборов тест-систем производства «Вектор-Бест» (пгт. Кольцово). Подтверждением клинического диагноза КЭ являлось обнаружение антител класса IgM. Для изучения генетической вариабельности боррелий в биологическом материале от больных нами использовалась тест-система «Векто-Лам-ДНК-ампли-100», производства «Вектор-Бест», Новосибирск с системой праймеров к fla-гену Borrelia burgdorferi sensu lato. Материал для исследования: сыворотка крови, ликвор, моча. Популяционный и субпопуляционный спектр лимфоцитов ликвора изучали методом лазерной проточной цитометри


Не сдавайте скачаную работу преподавателю!
Данный реферат Вы можете использовать для подготовки курсовых проектов.

Поделись с друзьями, за репост + 100 мильонов к студенческой карме :

Пишем реферат самостоятельно:
! Как писать рефераты
Практические рекомендации по написанию студенческих рефератов.
! План реферата Краткий список разделов, отражающий структура и порядок работы над будующим рефератом.
! Введение реферата Вводная часть работы, в которой отражается цель и обозначается список задач.
! Заключение реферата В заключении подводятся итоги, описывается была ли достигнута поставленная цель, каковы результаты.
! Оформление рефератов Методические рекомендации по грамотному оформлению работы по ГОСТ.

Читайте также:
Виды рефератов Какими бывают рефераты по своему назначению и структуре.