На правах рукописи Наконечный Олег Игоревич«Коксиеллез-ассоциированная инфекция крупного рогатого скота и усовершенствование лабораторных методов ее диагностики»16.00.03. – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунологияАвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наукОмск – 2009Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет»Научные руководитель: доктор ветеринарных наук профессор Красиков Александр ПантелеевичНаучный консультант: доктор медицинских наук профессор Рудаков Николай ВикторовичОфициальные оппоненты: доктор биологических наук профессор Сидоров Геннадий Николаевичдоктор ветеринарных наук профессор Бажин Михаил Аристоклевич Ведущее учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (ИЭВС и ДВ) СО РАСХНЗащита состоится 25 декабря 2009 г. в 12.30 часов на заседании диссертационного совета Д. 220.050.03 при ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет» в институте ветеринарной медицины по адресу: 644122, г. Омск-122, ул. Октябрьская, 92, тел.: (3812) 23-74-71.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института ветеринарной медицины ОмГАУ.Автореферат разослан «23» ноября 2009 г. Ученый секретарьдиссертационного совета, доцент Н. П. Жабин^ 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы. На протяжении всего времени существования человечества остается серьезной проблема борьбы с опасными инфекционными болезнями. Даже при условии их успешной профилактики угроза вспышек не теряет актуальности. Это, в первую очередь, связано с тем, что ряд болезней относится к убиквитарным, их возбудители в традиционных нормальных условиях существования закономерно переживают в организме животных. При концентрации на ограниченных площадях и ухудшении окружающих условий, способствующих снижению резистентности организма, эти животные могут тяжело переболевать соответствующими болезнями. (Л. Д. Тимченко и др., 2008). Одной из таких патологий является широко распространенная во всех странах мира зооантропонозная природно-очаговая болезнь коксиеллез (Ку-лихорадка). Она выявлена на территории бывшего СССР и более чем в 50 субъектах Российской Федерации (И. В. Тарасевич, 2003; К. М. Лобан и др., 2002 и др.). У сельскохозяйственных животных болезнь протекает энзоотически, преимущественно бессимптомно с накоплением специфических антител в крови и аллергизацией организма (Р. Г. Госманов и др., 1985; Р. X. Юсупов, 1987; Р. И. Ситдиков и др., 1989). Крупный рогатый скот весьма восприимчив к Ку-риккетсиальной инфекции (Ю. С. Башалов, 1973). Одним из серьезных пробелов в изучении лихорадки Ку является отсутствие подробных данных по ее краевой эпизоотологии. Значительным тормозом в профилактике и ликвидации этой болезни становится недостаточно высокая ценность диагностических методов и диагностикумов (Р. Р. Юсупов, 1995). В настоящее время в ветеринарной практике для серологической диагностики коксиеллеза крупного рогатого скота рекомендована РСК, которая, дает положительные результаты только при наличии определенной концентрации антител в сыворотке крови подозреваемых в заражении животных. Причем, по данным Б. П. Богомолова и др. (1980), Н. П. Петровой и др. (1982) с помощью РСК Ку-лихорадку удается диагностировать лишь в 70% случаев у больных людей. Такой метод как биологическая проба на белых мышах и морских свинках требует продолжительного времени наблюдения за подопытными животными – до 12-24 суток. С другой стороны, такой тест как ПЦР является высокочувствительным, однако в силу необходимости специального оборудования, значительной стоимости исследованных проб его проводят в основном для научных целей, поэтому он пока недоступен для проведения массовых диагностических исследований в производственных условиях на базе районных и городских ветеринарных лабораторий.^ Цель работы. Изучить распространение возбудителя коксиеллеза крупного рогатого скота, а также инфицированность основных его переносчиков в Омской области, и усовершенствовать методы серологической диагностики данной инфекционной болезни.^ Задачи исследований: – изучить эпизоотическую ситуацию по коксиеллезу крупного рогатого скота и ассоциативным формам его проявления в хозяйствах Омской области; – выяснить инфицированность коксиеллами Бернета основных переносчиков и диких теплокровных хозяев в природных стациях; – разработать и испытать в производственных условиях экспресс-методы диагностики коксиеллеза крупного рогатого скота и его ассоциативных форм проявления.^ Научная новизна. Установлено довольно широкое распространение коксиеллеза крупного рогатого скота в хозяйствах Омской области, при этом коксиеллез носит ассоциативный характер. Изучена инфицированность основных переносчиков и диких теплокровных хозяев возбудителя коксиеллеза (иксодовых клещей и мышеобразных грызунов). Изготовлены антисыворотки и антигены для реакции непрямой иммунофлуоресценции. Сконструирован коксиеллезный эритроцитарный диагностикум для реакции непрямой гемагглютинации. Усовершенствованы экспресс-методы серологической диагностики – для выявления коксиелл и их антигенов в био- и патматериале, а также антител в сыворотке крови и молоке с помощью РНИФ и РНГА. Получены приоритетные справки: на способ получения сыворотки для диагностики коксиеллеза крупного рогатого скота в реакции непрямой иммунофлуоресценции путем гипериммунизации кроликов № 2009119959 и на способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации № 2009119958.^ Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации вносят определенный вклад в развитие риккетсиологии и микропаразитоценологии. Внедрение в практику разработанных способов получения коксиеллезных антигенов и антисывороток для РНИФ и коксиеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА имеет большое значение в серологической диагностике коксиеллеза крупного рогатого скота в условиях промышленного животноводства. Материалы проведенных исследований легли в основу методических рекомендаций «Применение РИФ и РНГА для диагностики Ку-лихорадки крупного рогатого скота», которые позволят ветеринарным специалистам своевременно выявлять больных животных и носителей, разрабатывать меры борьбы и профилактики, контролировать эпизоотическую обстановку по данной инфекции.^ Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ, 2007 г.; Межрегиональной научно-практической конференции «Патология сельскохозяйственных животных и пути её профилактики» (Омск, 2007, СО РАСХН ВНИИБТЖ); 14-й научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ, 2008 г. «Проблемы ветеринарной и зоотехнической наук и пути их решения» (Омск, 2008); 7-й Межрегиональной научно-практической конференции «Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в условиях Сибири и Урала» (Омск, 2008, СО РАСХН ВНИИБТЖ); 15-й научно-практической конференции преподавателей, аспирантов и соискателей ИВМ ОмГАУ, 2009; Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики хронических инфекций и патологии животных» (Омск, 19-22 мая 2009 г., СО РАСХН ВНИИБТЖ); Втором этапе всероссийского конкурса на лучшую научную работу Министерства сельского хозяйства РФ (Омск, 2009); Международной научно-практической конференции «Достижения современной ветеринарной науки и практики в области охраны здоровья животных» (Краснодар, 2009, КубГАУ).^ Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования РФ («Труды Кубанского государственного аграрного университета»). ^ Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована таблицами и рисунками. Список литературы включает 218 источников, в том числе 78 зарубежных авторов.^ Внедрение результатов исследований. Результаты научных исследований для практического внедрения отражены в методических рекомендациях: «Применение РИФ и РНГА для диагностики Ку-лихорадки крупного рогатого скота» (Утверждены Ученым советом ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ, протокол № 2 от 6.10.2009 г. и секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Министерства сельского хозяйства и продовольствия Омской области, протокол № 6 от 9.10.2009 г.). Материалы диссертации внедряются в хозяйствах Омской области и используются в учебном процессе кафедр эпизоотологии, паразитологии инфекционных и инвазионных болезней; микробиологии, вирусологии и иммунологии института ветеринарной медицины ОмГАУ, Омской государственной медицинской академии, НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора.^ Основные положения, выносимые на защиту: 1. Распространение коксиеллеза крупного рогатого скота в Омской области. 2. Приготовление опытных серий коксиеллезного антигена и антисыворотки для РНИФ и коксиеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА. 3. Изучение в производственных условиях диагностической ценности РПИФ, РНИФ и РНГА.^ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Материалы и методы Тема диссертационной работы является составной частью комплексной государственной программы «Профилактика (диагностика) и меры борьбы с ассоциативными инфекционными и инвазионными болезнями животных и птиц» и имеет № гос. регистрации 01.2.001100602. Исследования проводились в период с 2006 по 2009 гг. на кафедре эпизоотологии, паразитологии, инфекционных и инвазионных болезней ИВМ ОмГАУ, в лаборатории зоонозных инфекций НИИПОИ Роспотребнадзора, в Омской областной ветеринарной лаборатории и хозяйствах Омской области. Объектом исследований являлся крупный рогатый скот различных половозрастных групп с выраженными клиническими признаками бронхитов, маститов, эндометритов, абортов, а также мышеобразные грызуны и иксодовые клещи. Материалом для исследований служили сыворотка крови, секрет вымени, цервико-вагинальная слизь от коров и нетелей, сыворотка крови, бронхоальвеолярные смывы, фекалии от телят, сыворотка крови, сперма и препуциальные смывы от быков производителей, патологический материал от погибших животных и абортированных плодов. В экспериментальных условиях использовали: 4 кроликов (2-х для получения коксиеллезной сыворотки, 2-х для получения кампилобактериозной сыворотки) и 3 морских свинок для постановки биопробы. Для диагностики применяли эпизоотологический, клинический, патологоанатомический и лабораторные методы. При изучении эпизоотологических особенностей коксиеллеза крупного рогатого скота в Омской области использованы материалы собственных наблюдений, полученные в период выездов в хозяйства, а также данные об инфицированности скота лаборатории микстинфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней ИВМ ОмГАУ за 9 лет (1997-2006 гг.). Для изучения природных очагов Ку-лихорадки было проведено исследование мышеобразных грызунов и иксодовых клещей, собранных на территории Омской области. Данный раздел работы выполнялся при участии научных сотрудников лаборатории зоонозных инфекций НИИПОИ Роспотребнадзора А. К. Танцева и кандидата медицинских наук Г. В. Березкиной. Сбор иксодовых клещей проводился при учёте на волокушу маршрутным методом, а отлов грызунов при помощи ловушек Геро. Для серологических исследований применяли реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА), с целью обнаружения антител в сыворотке крови; реакцию непрямой и прямой иммунофлуоресценции (РНИФ и РПИФ), для обнаружения антител и антигенов в пробах био- и патологического материала, полученного от больных, погибших и вынужденно убитых животных. Фиксацию мазков проводили по методу Моди с соавт. (1958), а постановку РНИФ по методике, предложенной Уэллером и Кунсом (1945). Для люминесцентной микроскопии использовали микроскоп ЛЮМАМ Р-8 с увеличением в 900 раз, а степень флуоресценции оценивали по 4-х крестной системе. Для постановки серологических тестов использовали стандартные антигены, применяемые для постановки РА и РСК, и полученный нами коксиеллезный антиген, а в качестве антител – гомологичные антигенам кроличьи и бычьи антисыворотки, антивидовые для РНИФ и специфические: сальмонеллезную, коксиеллезную для РПИФ люминесцентные сыворотки, меченные ФИТЦ (ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи), а также полученные нами кроличьи сыворотки против коксиеллеза, кампилобактериоза и ранее полученные в лаборатории микстинфекций против хламидиоза, пастереллеза, диплококкоза (Н. В. Лобанова, 2004). Коксиеллезный антиген для постановки РНИФ и РНГА получали из вакцинного штамма C. burnetii M-44. Коксиеллезную антисыворотку получали путем гипериммунизации кроликов вышеуказанным антигеном по схеме D. Schimmel, в модификации А. П. Красикова, Н. Н. Новиковой (2000). Для изготовления эритроцитарного диагностикума для РНГА в качестве клеточной основы использовали эритроциты барана, а для стабилизации 20%-й раствор формальдегида. Фиксацию эритроцитов проводили по методу Фили в модификации А. П. Красикова (2002). Постановку биопробы на морских свинках проводили, по методике, предложенной А. Б. Дайтером (1980).^ 2.2. Изучение эпизоотической ситуации по коксиеллезукрупного рогатого скота, а также ассоциативным формам егопроявления в хозяйствах Омской области На первом этапе в скрининговых исследованиях биоматериала от коров, телят и быков было установлено, что в настоящее время коксиеллез имеет довольно широкое распространение в Омской области. Так, из 34 обследованных хозяйств коксиеллез зарегистрирован в 15 (44%), при этом в большинстве случаев наряду с коксиеллами выделялись лептоспиры, листерии и хламидии, т.е. инфекционный процесс, носит ассоциативный характер. Инфицированность скота, в среднем составила 9,3% (табл. 1). Наиболее тяжёлая эпизоотическая ситуация по коксиеллезу наблюдалась в хозяйстве «Россия» Любинского района, где процент инфицированных животных составил 63%, а по лептоспирозу, листериозу и хламидиозу – 32, 37 и 24% соответственно. В другом хозяйстве этого же района – ЗАО им. «Розы Люксембург» риккетсии, листерии и хламидии выделяли у 25% коров и телок, а лептоспиры – у 40%. Не менее тяжёлая ситуация сложилась в Кормиловском, Иссилькульском, Павлоградском и некоторых других районах. Так, в колхозе «Украинский» Иссилькульского района 50% от количества исследуемых проб было инфицировано коксиеллами; такие же показатели по инфицированности лептоспирами и листериями. В Кормиловском районе хозяйства Ермолаевское и Алексеевское также мало, чем отличаются по эпизоотологическим показателям: 30% животных там было инфицировано коксиеллами. Таблица 1 – Инфицированность скота в хозяйствах Омской области 1997-2006 гг. №п.п. Хозяйства К-вопроб Инфицировано, % коксиел-лы лепто-спиры листе-рии хлами-дии 1 Знамя 12 - - - 17 2 им. Карбышева 20 10 - - 60 3 им. Розы Люксембург 20 25 40 25 25 4 Боевое 180 5 5 - 30 5 Лесное 7 - - - - 6 Заря свободы 10 20 10 20 70 7 Россия 75 63 32 37 24 8 Искра 10 - - - 40 9 Русский хлеб 10 - - - - 10 Сосновское 10 20 - 10 - 11 Колос 10 - - - - 12 Нива 10 - 10 20 60 13 Украинский 10 50 50 50 60 14 Ачаирский-1 10 10 10 - 30 15 Новороссийское 20 10 20 20 20 16 Агрофирма Кормиловская 21 14 10 5 24 17 Молзавод Кормиловский 10 - 40 30 40 18 Ермолаевское 15 30 - 10 20 19 Алексеевское 12 30 - - 20 20 Большевик 20 - - - - 21 Новоазовское 20 5 - - 5 22 Цветочное 10 20 20 - 90 23 Береговое 20 - - - 80 24 Евгащинское 10 - - - 10 25 Новорождественское 20 5 20 - 5 26 Дружба 10 - - - 40 27 Чистовское 40 - - - - 28 Добровольское 12 - - - 67 29 Руспол 6 - - - 60 30 Екатеринославское 10 - - - - 31 Рагозинское 96 - - - - 32 Любимовское 40 - - - 33 33 Кам-Курское 24 - - - 40 34 им. Кирова 3 - 33 - 33 Всего 813 9,3±1 8,8±1 6,7±0,9 29,5±1,6 В 2007-2009 гг. нами были продолжены комплексные исследования хозяйств на ряд инфекционных болезней. Было подтверждено, что коксиеллез крупного рогатого скота имеет место в хозяйствах Омской области, наряду с другими патологиями. Проводились исследования материала из хозяйств Таврического, Муромцевского, Любинского, Омского, Кормиловского, Марьяновского, Оконешниковского, Горьковского, Крутинского, Исилькульского, Тюкалинского, Щербакульского, Павлоградского, Тарского, Тевризского, Усть-Ишимского, Саргатского и Азовского районов. Так, из 29 обследованных хозяйств Ку-лихорадка выявлена в 17 (59%), при этом инфицированность скота составляла от 3 до 65% (в среднем 10,6%). Ретроспективный анализ инфицированности коксиеллами крупного рогатого скота по области за предыдущие 9 лет (1997-2006) показывает примерно такое же процентное соотношение: зараженность скота была в среднем 9,3%. В результате последних исследований установлено, что во многих хозяйствах области обнаруживаются разные инфекционные патологии, в различных сочетаниях. Так, яркий микробный пейзаж отмечен в ОПХ «Боевое» Исилькульского района, где помимо коксиелл Бернета, выявляли лептоспиры 80%, листерии, хламидии, вирус ИРТ в 30% случаев. В СПК «Некрасовский» Кормиловского района обнаружены лептоспиры и листерии в 60%, вирус ИРТ – 80%, хламидии в 30%, коксиеллы в 20% случаев; в СПК «Любимовском» показано наличие микоплазм у 90% обследованных животных, хламидий – у 80%, вируса ИРТ – у 30. В КФХ «Прометей» в 50% случаев обнаруживали энтерококки, кампилобактерии и вирус ИРТ, у 70% отмечены микоплазмы, у 60% - сальмонеллы, у 40% - хламидии. Для изучения ассоциированного течения Ку-лихорадки крупного рогатого скота нами были проведены исследования биоматериала от коров, телят и быков, а также патологического материала на несколько инфекционных болезней (табл. 2).Таблица 2 – Ассоциативные формы проявления Ку-лихорадки крупного рогатого скота №п.п. Хозяйства К-вопроб Общий% инф. кокс. %-от числа исследованных и инфицированных коксиеллами в ассоциации с другими возбудителями лепт лист хлам ирт саль кам энт мик Телята 1 Кирова 10 20 – 50 – 50 – – – 100 Патологический материал 2 Кам-Курское 14 7 – 100 100 – – 100 – – Коровы 3 Овцевод 10 20 50 50 50 – 50 – 50 – 4 Некрасовский 10 20 50 50 100 50 – – – – 5 Любимовский 10 10 – – 100 – – – – – 6 Ударный 3 33 – – – – – – – 100 7 Кирова 30 3 100 100 100 – 100 – – 100 8 Кам-Курское 5 20 100 – – 100 100 – – – 9 Боевое 29* 34 100 80 80 60 20 60 40 – Всего 121 18,6±3,5 44±4,5 48±4,5 59±4,5 29±4,1 30±4,2 18±3,5 10±2,7 33±4,3 Примечание: * – 2 быка-производителя; кокс. – коксиеллы, лепт. – лептоспиры, лист. – листерии, хлам. – хламидии, ирт – вирус ИРТ-ПВ, саль. – сальмонеллы, кам. – кампилобактерии, энт. – энтерококки, мик. – микоплазмы.Исследования показывают на возможность ассоциативных форм проявления коксиеллеза в различных сочетаниях с хламидиями, лептоспирами, листериями, вирусом ИРТ-ПВ, сальмонеллами, диплококками, кампилобактериями, микоплазмами. Число сочленов ассоциации микроорганизмов, участвующих в едином инфекционном процессе может достигать 5-7 (табл. 2). При этом наиболее часто коксиеллы регистрируется с микоплазмами (33%), лептоспирами (44%), листериями (48%), а наибольший процент в ассоциации принадлежит хламидиям – 59%. По всей видимости, такой высокий процент в ассоциации говорит о том, что коксиеллы, как и хламидии, будучи внутриклеточными паразитами, являются симбионтами и синнергируют свое патогенное действие на организм животного.^ 2.3. Изучение инфицированности основных переносчиков в Омской области С целью изучения резервуарной роли основных переносчиков и диких теплокровных хозяев возбудителя коксиеллеза были проведены исследования в РПИФ биоматериала на инфицированность коксиеллами Бернета мышеобразных грызунов и иксодовых клещей, собранных в Омском, Муромцевском и Любинском районах Омской области. Немаловажно, что в естественных условиях заражение скота может происходит аэрогенно, алиментарно при приеме воды и корма, инфицированных выделениями грызунов-коксиеллооносителей, а также трансмиссивно через укусы клещей.^ 2.3.1. Исследование мышеобразных грызунов В лаборатории после определения вида и генеративного состояния грызунов для исследования на инфицированность использовали селезенку, так как в ее ретикулярных клетках коксиеллы лучше сохраняются. При необходимости более длительного сохранения материала и его перевозки использовали замораживание или 50% стерильный глицерин. Из селезенок готовили мазки-отпечатки, которые фиксировали и обрабатывали так же, как при исследовании биоматериала от крупного рогатого скота. При исследовании 109 проб селезенок коксиеллы и их антигены были выделены в 17 случаях, что соответствует 15,5% (табл. 3).Таблица 3 – Инфицированность коксиеллами Бернета мышеобразных грызунов в Омской области № п.п. Видживотного Исследовано особей Положительно в РПИФ самцы самки всего самцы самки всего 1 Clethrionomys rutilis(Красная полевка) 39 43 82 5 9 14 2 Microtus oeconomus (Полевка-экономка) 8 9 17 1 1 2 3 Apodemus agrarius (Полевая мышь) 3 5 8 0 1 1 4 Sicista betulina(Лесная мышовка) 0 2 2 0 0 0 Всего грызунов 109 17 (15,5±3,5%) ^ 2.3.2. Исследование клещей В лаборатории после определения вида клещей, их промывали стерильным физиологическим раствором, отсекали конечности и из выделяющихся капель гемолимфы готовили мазки отпечатки на предметных стеклах. С этой же целью использовали извлеченный из клеща кишечник. В результате исследований установлен довольно высокий процент (20,4%) инфицированности иксодовых клещей, из 304 проб положительными на коксиеллез оказались 62 (табл. 4).Таблица 4 – Инфицированность коксиеллами Бернета иксодовых клещей в Омской области № п.п. Видживотного Исследовано особей Положительно в РПИФ самцы самки всего самцы самки всего 1 Dermacentorreticulatus 131 171 302 23 39 62 2 Ixodespersulcatus 1 1 2 0 0 0 Всего клещей 304 62 (20,4±2,3%) Таким образом, основным резервуаром и переносчиками инфекции в природных стациях являются мышеобразные грызуны и иксодовые клещи, доля инфицированности которых составляет 15,5 и 20,4%, соответственно. РПИФ является простым, наиболее доступным тестом для определения инфицированности переносчиков и диких теплокровных хозяев. Метод позволяет выяснить эпизоотическую ситуацию по коксиеллезу в конкретной местности (область, район, хозяйство, пастбище). Данные наших исследований показывают на необходимость проведения профилактических мероприятий, направленных на пути и механизмы передачи возбудителя, т.е. на уничтожение клещей и грызунов, а также на своевременность проведения профилактических и оздоровительных мероприятий на крупном рогатом скоте. Своевременное определение возбудителя в клещах и грызунах необходимое условие для проведения эпизоотологического контроля за благополучием территории по коксиеллезу.^ 2.4. Серологические методы диагностики коксиеллеза2.4.1. Получение коксиеллезного антигена и диагностической коксиеллезной антисыворотки для РНИФ Для гипериммунизации использовали антиген, полученный из вакцинного штамма C. burnetii М-44. Вакцину разводили стандартным разбавителем до объема 1 мл. Затем стерильным физиологическим раствором доводили до концентрации 1,7x109 микробных тел в 1 мл по ОСМ ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Гипериммунизацию проводили на 2 кроликах породы шиншилла весом 2,5-3 кг. Суть данной схемы гипериммунизации состоит в последовательном дробном внутривенном введении антигена кроликам каждые 3-4 дня в нарастающих дозах с применением иммуностимулятора левамизола подкожно при первых двух введениях антигена. Титры антител учитывали на 7, 14, 21 и 30 сутки после введения коксиелл в РНИФ, антиген для которой готовили из этого же штамма и использовали после прогревания в водяной бане при 70оС в течение 30 мин в концентрации 0,85 млрд. м.т., т.к. было установлено, что при данной концентрации антигена реакция более демонстративна. Таблица 5 – Динамика синтеза антител у кроликов, гипериммунизированных коксиеллезным антигеном Сроки взятия крови (дни) Титр антител 1 кролик 2 кролик 7-й день 1:40 1:40 14-й день 1:160 1:320 21-й день 1:320 1:640 30-й день 1:1280 1:1280 Установлено, что на 7-й день после первого введения антигена антитела в РНИФ выявлялись в низких титрах 1:40. На 14-й день положительная реакция в РНИФ была при более высоких разведениях в пределах 1:160-1:320, на 21-е сутки – 1:320-1:640, а к 30-му дню синтез антител достиг максимального уровня 1:1280 (табл. 5)