www.diplomrus.ru ® Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок Содержание ОГЛАВЛЕНИЕ1. ВВЕДЕНИЕ...62. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...112.1. Современные представления о генерации мембранного^ потенциала покоя...112.1.1. Мембранный потенциал покоя - важнейшее свойство возбудимых клеток...112.1.2. Ионная проводимость мембраны возбудимых клеток...132.1.3. Распределение ионов в клетке...152.1 А. Калий как основной потенциалобразующий ион...152.1.5. Вклад ионов Na+ в мембранный потенциал покоя...182.1.6. Вклад ионов СГ в мембранный потенциал покоя...202.1.7. Модель Гольдмана-Ходжкина-Катца...212.2. Значение активного транспорта ионов для механизмагенерации мембранного потенциала покоя...222.2.1. Поддержание концентрационных градиентовионов Na+ и К+...222.2.2. Поддержание концентрации ионов СГ...24? 2.3. Влияние изменения ионной проницаемости на мембранный потенциал покоя...262.4. Влияние активации или ингибирования ионного транспортана мембранный потенциал покоя...272.5. Организация нервно-мышечной системыолигохет...302.6. Мембранный потенциал покоя клеток соматической3мускулатуры земляных червей...32^ 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...363.1. Объекты исследования...363.1.1. Дождевой червь...363.1.2. Лягушка...363.2. Методы исследования...363.2.1. Подготовка мышечного препарата...363.2.1.1. Мышечный препарат дождевого червя...363.2.1.2. Мышечный препарат лягушки...373.2.2. Электрофизиологические методы исследования...383.2.2.1. Растворы...383.2.2.2. Метод предварительной нагрузкимышечных волокон Na+...423.2.2.3. Электроды и регистрирующая аппаратура...423.2.2.4. Измерение мембранного потенциаламышечных клеток...433.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных...43^ 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ...444.1. Величина мембранного потенциала покоя соматических мышечных клеток дождевого червя...444.2. Влияние ионной среды на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя...444.3. Влияние изменения ионной проводимости на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатурыдождевого червя...5044.4. Вклад Na+,K+-Hacoca в величину мембранного потенциала покоя клеток соматической мускулатурыдождевого червя...524.5. Доказательства наличия котранспорта Na+,K+,C1~ в клетках соматической мускулатуры дождевого червя и его значениедля мембранного потенциала покоя...624.6. Влияние норадреналина и адреналина на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя...684.7. Кальциевый механизм активации ионного насоса норадреналиномв клетках соматической мускулатуры дождевого червя...164.8. Влияние некоторых медиаторов на мембранный потенциалпокоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя...824.9. Влияние холиномиметиков на мембранный потенциал покояклеток соматической мускулатуры дождевого червя...894.10. Влияние ионной среды на карбахолининдуцированную деполяризацию мембраны клеток соматическоймускулатуры дождевого червя...965. ЗАКЛЮЧЕНИЕ...1036. ВЫВОДЫ...109^ 7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ... 111 Введение СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙМПП - мембранный потенциал покояКХ — карбахолинН - никотиновыйМ - мускариновыйАХ - ацетилхолинГАМК - у-аминомасляная кислотаАТФ — аденозинтрифосфорная кислотацАМФ - циклический аденозинмонофосфатцГМФ - циклический гуанозинмонофосфатТТХ - тетродотоксинб1. ВВЕДЕНИЕАктуальность исследованияМембранный потенциал покоя (МПП) - основная характеристика возбудимых клеток, играющая ключевую роль в процессах передачи сигнала, вторичноактивном транспорте и мышечном сокращении [109]. Его величина формируется за счет разности концентраций потенциалобразующих ионов, а также избирательной ионной проводимости мембраны [133]. Работа активного ионного транспорта создает и поддерживает ионные градиенты, и, кроме того, может вносить прямой вклад в величину МПП в виде амперогенного компонента [6; 33].Согласно современным представлениям, тип кольчатые черви или аннелиды, по эволюционному положению находятся у истоков филогенетической линии первичноротых, развитие которых привело к возникновению более высокоорганизованных представителей животного мира. Кроме того, кольчатые черви наиболее древняя эволюционная группа, у которой впервые появляется мускулатура, по строению близко напоминающая поперечнополосатую мускулатуру позвоночных животных [11]. Однако в литературе имеются лишь несколько работ, посвященных изучению механизмов формирования и поддержания величины МПП аннелид, которые к тому же носят крайне противоречивый характер [52; 84; 85; 104]. Подробные и системные исследования, показывающие роль потенциалобразующих ионов в генерации МПП, роль активного ионного транспорта, существование вторичноактивного хлорного транспорта, участие проводимости мембраны для отдельных ионов в величине МПП, влияние веществ, обладающих медиаторной активностью на потенциал покоя соматической мускулатуры аннелид в литературе до настоящего времени отсутствуют. Поэтому изучение особенностей электрогенеза в соматической мускулатуре на примере одного из представителей аннелид дождевогочервя, представляется наиболее актуальным, поскольку оно позволит создать единую картину филогенеза механизмов электрогенеза, и, прежде всего, важнейшего из них, как генерация МПП в клетках возбудимых тканей высших беспозвоночных и позвоночных животных.Цели и задачи исследованияЦелью данной работы явилось изучение механизмов электрогенеза мембранного потенциала покоя в мембране клеток соматической мускулатуры дождевого червя. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:1. Исследовать влияние основных потенциалобразующих ионов на величину МПП мышечных клеток дождевого червя.2. Установить зависимость величины МПП мышечных клеток дождевого червя от дифференциальных проводимостей мембраны для ионов Na+ и СГ.3. Исследовать вклад активного Na+,K+-Hacoca в величину МПП мышечных клеток дождевого червя.4. Установить факт существования и возможную физиологическую роль активного транспорта СГ в мышечных клетках дождевого червя.5. Исследовать влияние некоторых медиаторов на величину МПП мышечных клеток дождевого червя.6. Изучить влияние холиномиметиков и холинолитиков на величину МПП мышечных клеток дождевого червя.Положения, выносимые на защиту:1. Величина МПП соматических мышечных клеток дождевого червя является суммой калиевого и хлорного диффузионных потенциалов, а также «потенциала» создаваемого работой электрогенных ионных насосов.82. Норадреналин, адреналин и ГАМК способны увеличивать трансмембранную разность потенциалов соматических мышечных клеток дождевого червя. Данный эффект связан с активацией рецепторных структур, обеспечивающих вход ионов Са2+ в клетку, при участии Са2+-акцепторных белков и усиления работы активного ионного транспорта.3. Мембрана соматических мышечных клеток дождевого червя обладает высокой чувствительностью к КХ и никотину, но не чувствительна к мускарину. Деполяризация под действием холиномиметиков не устраняется классическими Н— и М-холинолитиками, а также ганлиолитиками.Научная новизнаВ настоящем исследовании впервые показано, что в клетках соматической мускулатуры дождевого червя существует уабаинчувствительный электрогенный Na+,K+-Hacoc, вносящий значительный и постоянный вклад в интегральную величину МПП мышечных клеток по сравнению со скелетными мышечными волокнами. Также установлено, что в мышечных клетках дождевого червя имеется фуросемидчувствительный вторичноактивный Ыа+,К+,СГ котранспорт, который отклоняет равновесный хлорный потенциал от уровня МПП. Впервые показано, что активация Na+,K+-Hacoca норадреналином происходит через чувствительные структуры, сходные с семейством адренорецепторов позвоночных, без вовлечения циклических нуклеотидов, при участии экстраклеточного Са2+ и хлорпромазинчувствительных кальцийакцепторных структур подобных кальмодулину позвоночных. Также впервые установлено, что МПП клеток соматической мускулатуры дождевого червя не изменяется под действием серотонина, глутамата, глицина, АТФ и мускарина, тогда как никотин и КХ вызывают деполяризацию, а ГАМК - гиперполяризацию. Увеличение МПП мышечных клеток в присутствии ГАМКсвязано с активацией Na+,K+-Hacoca. Кроме того, показано, что в мембране клеток соматической мускулатуры дождевого червя существует особый фармакологический тип АХ-рецепторно-канального комплекса, не чувствительного к воздействию классических холинолитиков - d-тубокурарина, сс-бунгаротоксина, атропина и ганглиолитика - бензогексония.Научно-практическая ценностьПолученные данные позволяют дополнить картину эволюционного становления основных механизмов электрогенеза мембранного потенциала покоя у беспозвоночных животных. Наши исследования показывают, что мышечный препарат дождевого червя является удобной моделью для изучения базовых механизмов электрогенеза в скелетных мышцах высших животных. Установление факта наличия особого фармакологического типа никотиновых ацетилхолиновых рецепторов в клетках соматической мускулатуры дождевого червя, возможно, позволит ближе подойти к решению проблемы лечения нервно-мышечных патологий, в основе которых лежит синаптический дефект, в частности, таких как нарушение функционирования и синтеза ацетилхолиновых рецепторов.Апробация работыОсновные результаты диссертационной работы доложены на итоговых конференциях КИББ КНЦ РАН (Казань, 2002, 2003, 2004), XVIII Съезде физиологов России (Казань, 2001), VII и VIII Всероссийской школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 2000, 2001), VI региональной конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных «Простые Нервные Системы» (Москва-Пущино, 2000), VII региональной конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных «Простые нервные системы» (Калининград-Светлогорск-Отрадное, Россия, 2003), VI Всероссийского симпозиума и школы семинара молодых ученых и учителей «Растущий организм: адаптация к физической и10умственной нагрузке» (Казань, 2002), международной школе-семинаре «Фармакология синаптической трансмиссии в нервной системе» (Киев, Украина, 2002), II Международной конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2003) и 8-ой Международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2004).Структура и объем диссертацииДиссертация объемом 127 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 173 источника, из них 144 - иностранных авторов. Диссертация содержит 29 рисунков и 4 таблицы.• 11^ 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ2.1. Современные представления о генерации мембранного потенциала покоя^ 2.1.1. Мембранный потенциал покоя - важнейшее свойство возбудимыхклетокКлетки всех типов имеют цитоплазматическую мембрану, отделяющую внешнюю среду от внутренней. Как во внешней среде, так и в цитоплазме клетки находятся ионы, имеющие положительные и отрицательные заряды. В покое во внешней среде имеется избыток положительных зарядов, в то время как внутри - много отрицательных [17; 139]. Это разделение зарядов поддерживается тем, что липидный бислой мембраны препятствует диффузии ионов [86]. Разделение зарядов дает увеличение разности электрического потенциала или падение напряжения на мембране, называемое мембранным потенциалом. Мембранный потенциал определяется как:'m~'iri~'out jгде V(n - есть потенциал внутри клетки, а Уош — потенциал снаружи [133].Мембранный потенциал клетки в покое называется мембранным потенциалом ф покоя. Потенциал снаружи клетки принимается за нуль. В этом случае потенциал покояравен Ущ, то есть потенциалу внутри клетки [133]. Он обычно лежит в пределах от -60 до -70 мВ для нейронов [29] и от -50 до -100 мВ для скелетных мышц [69]. Все электрические сигналы вызваны короткими изменениями МПП вследствие протекания ионных токов через клеточную мембрану [89].Потоки, внутрь или наружу клетки, как положительно (катионы), так и отрицательно заряженных ионов (анионы), создают электрический ток. Направление12течения тока традиционно определяется, как направление движения положительных зарядов [139]. Таким образом, катионы, пересекающие мембрану клетки, движутся по направлению электрического тока, а анионы - в противоположном направлении. Перемещение катионов и анионов через мембрану, внутрь или наружу клетки, нарушает разность распределения зарядов по обе стороны мембраны или электрический градиент, что изменяет поляризацию мембраны. Как известно, уменьшение электрического градиента, снижающее величину отрицательного мембранного потенциала, называется деполяризацией, тогда как увеличение электрического градиента, приводящее к более отрицательному мембранному потенциалу, называется гиперполяризацией [93].Возникновение мембранного потенциала покоя обусловлено, прежде всего, ионной проницаемостью или проводимостью мембраны. Установлено, что проницаемость мембраны клетки для различных ионов неодинакова, благодаря чему поддерживается разделение зарядов [159]. В покое ионная проницаемость обычно не меняется, ее изменение может происходить, например, во время потенциала действия, когда проводимость мембраны резко увеличивается и создается электрический ток за счет движения ионов через мембрану [90].Таким образом, мембрана клетки в покое, выполняя роль эффективного барьера для ионов, вместе с тем проницаема для них, что обеспечивает распределение заряда на мембране и создание электрического градиента. Данный механизм наиболее выражен у возбудимых клеток, а именно мышечных и нервных, поскольку имеет для них принципиальное значение.13 2.1.2. Ионная проводимость мембраны возбудимых клетокДиффузия ионов и электрические сигналы на мембране клеток опосредованы потоком ионов через водопроницаемые поры. Поры, образованные трансмембранными белковыми молекулами, встроенными в жидкую фазу липидов, называются ионными каналами, которые и обеспечивают ионную проводимость мембраны [38; 50]. Одним из важных функциональных свойств ионных каналов, являются переходы между открытым и закрытым состояниями, которые совершаются мгновенно по принципу «все или ничего» [131].Существует множество типов ионных каналов, различающихся своими функциональными свойствами:1) По механизмам, обеспечивающим их открытие. Каналы чувствительные к электрическому полю на мембране, и открывающиеся при изменении этого поля, называются потенциалзависимыми каналами. Каналы имеющие рецепторную часть, чувствительную к определенным химическим веществам, при взаимодействии с которыми каналы открываются, называются хемочувствительными или лигандзависимыми [86]. Управление потенциалзависимым каналом, может осуществляться не только величиной МПП, но также зависеть от внутриклеточной концентрации катионов, как например, в случае потенциалзависимого Са+— активируемого калиевого канала [117].2) По своей способности пропускать, те или иные ионы (селективности). Так, потенциалзависимые каналы по этому признаку подразделяются на ионные каналы для К+, Na+, Ca2+ и СГ [107; 160]. Лигандзависимые каналы, в большинстве случаев неселективны, и в открытом состоянии по градиенту концентрации через пору такого канала проходят различные ионы [105].14В состоянии покоя на мембране, в открытом состоянии находятся каналы, участвующие в формировании МПП. Это прежде всего каналы для К+, Na+, и СГ [26]. Набор ионных каналов, обеспечивающих проводимость в состоянии покоя, различен в зависимости от вида клеток. Калиевую проводимость в покое могут обеспечивать Na+-активируемые калиевые [120] и Са2+-активируемые калиевые каналы [166]. Многие нервные клетки обладают так называемыми калиевыми каналами типа М, которые открыты при потенциале покоя и закрываются при участии внутриклеточных посредников [30; 45]. Показано, что активация 0,1 - 1% от общего числа потенциалзависимых калиевых каналов была бы достаточна, чтобы создать проводимость, сравнимую с проводимостью в покое [65]. В формировании МПП также участвуют калиевые каналы утечки, открытые при нормальных значениях потенциала покоя и обеспечивающие ток утечки [91].Вклад в натриевую проводимость мембраны в покое вносят потенциалзависимые натриевые каналы [132]. В некоторой степени вход Na+ может происходить через калиевые каналы, для большинства из которых проницаемость для Na+ составляет от 1 до 3% от калиевой проницаемости [86]. Кроме того, вход Na+ происходит при работе вторичноактивных натрийзависимых транспортных систем [39; 149].В нервных и мышечных клетках широко распространены хлорные каналы семейства CLC (chloride channel) [106], обеспечивающие проводимость для СГ в покое [76]. Эти каналы участвуют в установлении внутриклеточной концентрации СГ, взаимодействуя с системами хлорного транспорта [126; 157].Таким образом, открытие одних типов ионных каналов может происходить при изменении мембранного потенциала, других при связывании с лигандом. Диффузия ионов, участвующих в формировании МПП, а следовательно, и ионная проводимость клеточной мембраны в состоянии покоя, обеспечивается различными селективными15каналами, открытыми при нормальных значениях МПП. Набор этих каналов зависит от типа клетки, и включает в себя потенциалзависимые каналы и каналы утечки.2.1.3. Распределение ионов в клеткеИсследование мембранного потенциала началось при помощи анализа пассивных потоков ионов через ионные каналы, участвующих в образовании МПП. Известно, что распределение ионов по обеим сторонам мембраны носит неравномерный характер [2]. Обнаружено, что четыре иона присутствуют в больших концентрациях, чем все остальные по обеим сторонам мембраны. Ионы Na+ и СГ более сконцентрированы снаружи клетки, тогда как ионов К+ и органических анионов (А"~) больше внутри. Органические анионы - это главным образом, аминокислоты и белки [46; 62]. Распределение этих ионов снаружи и внутри клетки хорошо изучено на разных нервных и мышечных клетках. Хотя абсолютные значения ионных концентраций для позвоночных животных ниже чем для беспозвоночных, но концентрационные градиенты, то есть соотношения концентраций внешних ионов к внутренним, остаются теми же самыми [123].Таким образом, неодинаковые концентрации одного типа ионов по обе стороны мембраны клетки формируют концентрационный градиент, который обуславливает диффузию ионов, участвующих в генерации потенциала покоя.2.1.4. Калий как основной потенциалобразующий ионМембранный потенциал хорошо описывается на примере глиальной клетки, мембрана которой проницаема только для одного вида ионов. В целом, селективность мембраны для различных ионов определяется относительным соотношением16различных типов открытых ионных каналов в клетке. Глиальная клетка имеет мембранный потенциал порядка -75 мВ. В покое подавляющее большинство ионных каналов в мембране клетки проницаемы только для К+, и как результат, через мембрану проникают исключительно ионы К+ [63]. Глиальные клетки обладают высокой внутренней концентрацией ионов К+ и отрицательно заряженных органических анионов, а снаружи высокой концентрацией Na+ и СГ [115]. Поскольку К+ присутствует в большей концентрации внутри клетки, а глиальная клетка селективно проницаема для него, К+ стремится диффундировать наружу клетки, уменьшая свой химический концентрационный градиент. В результате, вследствие незначительного избытка К+, снаружи мембраны аккумулируется положительный заряд, а внутри - отрицательный заряд, поскольку возникает дефицит К+ и незначительный избыток анионов. С этого момента противоположные заряды, притягивая друг друга, равномерно собираются, образуя на внешней поверхности мембраны слой из положительных зарядов, а на внутренней слой из отрицательных [154].Диффузия К+ наружу продолжает расти некоторое время. Накопление заряда вследствие диффузии К+ дает увеличение электрической разности потенциалов. Чем больше К+ продолжает выходить, тем больше становится электрический градиент, и тем больше будет разность потенциалов. Поскольку ион К положительно заряжен, разность потенциалов будет стремиться препятствовать дальнейшему выходу К+. Таким образом, на ионы К+ действует две силы, которые управляют ими по обе стороны мембраны: концентрационная сила, зависящая от разности концентраций, и сила электрического поля, которая производится разностью потенциалов. Поскольку диффузия К+ продолжается до определенного момента, потенциал накапливается на мембране до тех пор, пока электрическая сила, управляющая входом К+, в точности не станет равной концентрационной силе, контролирующей выход К+ из клетки. То есть движение К+ наружу по концентрационному градиенту становится равным движению17К+ внутрь по электрическому градиенту. Значение электрической разности потенциалов, при котором наблюдается такое равновесие входа и выхода К+, называется равновесным калиевым потенциалом и обозначается Ек- В клетках проницаемых только для К+, равновесный калиевый потенциал определяет мембранный потенциал покоя, который в большинстве глиальных клеток равен примерно -75 мВ [Ю9].Равновесный потенциал для любого иона X может быть подсчитан из уравнения, полученного на основе термодинамических принципов немецким химиком Уолтером Нернстом:RT Г.АПЕх-------In------- (Уравнение Нернста),х zF [XIгде R - есть газовая постоянная, Т - температура по Кельвину, z - валентность иона, F - постоянная Фарадея, а [Х]о, [XJt — концентрации ионов снаружи и внутри, соответственно. Для более точного описания равновесного потенциала, концентрации ионов в формуле заменяются на активности ионов.Отношение RT/F при комнатной температуре (25° С) равно 25 мВ, а константа для преобразования натурального логарифма в десятичный равна 2,3. В таком случае уравнение Нернста приобретает вид:z °[X],Так как валентность для К+ равна 1, то есть z=l, то при известных концентрациях К+ снаружи и внутри клетки можно вычислить равновесный калиевый потенциал [118], так например для аксона кальмара он равен -75 мВ, для мышечных клеток млекопитающих -97 мВ [26].Уравнение Нернста может использоваться для нахождения равновесного потенциала любого иона, который присутствует по обе стороны мембраны, если онаСписок литературы