Приложение 1к Правилам хранения, переливаниякрови, ее компонентов и препаратов Техника иммуносерологических исследований 1. Определение группы крови системы АВ0 изогемагглютинирующими сыворотками 1. Групповая принадлежность крови определяется реакцией агглютинации при помощи реактивов, содержащих антитела по отношению к агглютиногенам эритроцитов А и В. Реакция производится при комнатной температуре на пластинке с плоскостью со смачиваемой поверхностью (далее - пластинка). 2. На пластинку в три точки под обозначениями анти-А, анти-В, анти-АВ помещают по 2 капли (0,1 мл) реагента и рядом по одной капле осадка эритроцитов (0,01-0,02 мл). Сыворотку и эритроциты перемешивают стеклянной палочкой. Пластинку периодически покачивают, наблюдая за ходом реакции в течение 5 минут. По истечении 5 мин в реагирующую смесь можно добавить по 1-2 капли (0,05-0,1 мл) физиологического раствора для снятия возможной неспецифической агрегации эритроцитов. 3. Оценка результата: реакция в каждой капле может быть положительной (наличие агглютинации эритроцитов) и отрицательной (отсутствие агглютинации). Различные сочетания положительных и отрицательных результатов дают возможность судить о групповой принадлежности исследуемой крови (таблица 1). Таблица 1 ^ Групповая принадлежность исследуемой крови Результат реакции с изогемагглютинирующими сыворотками группы Исследуемая кровь принадлежит к группе Oab(I) Аb (II) Вa(III) АВ0(IV) - - - О (I) + - + A (II) + + - B (III) + + + - AB (IV) Примечание: Знаком (+) обозначена агглютинация, знаком (-) - ее отсутствие. 4. В тех случаях, когда положительный результат получен с сывороткой всех трех групп, для исключения неспецифической агглютинации производится контрольное исследование со стандартной сывороткой АВ0 (IV), не содержащей групповых агглютининов. Лишь отсутствие агглютинации в этой контрольной пробе позволяет учесть положительный результат с сыворотками групп Оab (I), Аb (II), Вa (III) как истинный, то есть, принадлежность исследуемой крови к группе АВ0 (IV). ^ 2. Определение группы крови АВ0 моноклональными антителами 5. Определение группы крови производится с помощью реакции гемагглютинации на плоскости, в солевой среде или на пластинке. Для определения А и В антигенов эритроцитов используют стандартные реагенты моноклональные антитела (Цоликлоны анти-А и анти-В). 6. В случае определения группы крови системы АВ0 с помощью моноклональных типирующих реагентов в виду их высокой активности и выраженности агглютинирующего эффекта, а также полной стандартности используют по одной серии Цоликлонов анти-А и анти-В. 7. На пластинке антитела и кровь смешивают в соотношения 10:1 и наблюдают за реакцией агглютинации в течение 3-х минут. 8. Учет результатов реакции гемааглютинации, проведенной с моноклональными АВ0-типирующими реагентами: 1) если агглютинации нет ни с Цоликлоном анти-А, ни с Цоликлоном анти-В, то исследуемая кровь принадлежит к группе 0 (I); 2) если агглютинация наблюдается только с Цоликлоном анти-А, то исследуемая кровь принадлежит к группе А (II); 3) если агглютинация наблюдается только с Цоликлоном анти-В, то исследуемая кровь принадлежит к группе В (III); 4) если агглютинация наблюдается как с Цоликлоном анти-А так и с Цоликлоном анти-В, то исследуемая кровь принадлежит к группе АВ (IV). 9. При подозрении на спонтанную агглютинацию у больных с группой крови АВ (IV) необходимо провести контрольное исследование крови, взяв вместо Цоликлона изотонический раствор хлористого натрия. Реакция агглютинации должна быть отрицательной. 3. Определение резус-принадлежности крови больного 10. Резус-принадлежность определяется в соответствии с инструкцией, прилагаемой к сыворотке антирезус. 11. В лаборатории проводят следующие исследования: 1) реакцию агглютинации на плоскости с Цоликлонами анти-D супер; 2) методом конглютинации с применением желатина; 3) с помощью универсального реагента антирезус. 12. При всех методах определения резус-принадлежности обязательна постановка контролей, а именно включение в реакцию стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов, а также обязательное исследование крови на возможную аутоагглютинацию, с 10 % раствором желатина (если используется метод с применением желатина) или с 33 % раствором полиглюкина (если используется стандартный универсальный реагент антирезус). 4. Реакция агглютинации на плоскостис помощью цоликлонов анти-D супер 13. Наносят большую каплю (около 0,1 мл) реагента на пластинку или планшет. 14. Наносят рядом маленькую каплю (0,02-0,03 мл) исследуемых эритроцитов. Тщательно смешивают реагент с эритроцитами стеклянной палочкой. 15. Через 10-20 секунд мягко покачивают пластинку. 16. Результаты реакции учитывают через 3 минуты после смешивания, несмотря на то, что четкая агглютинация наступает в первые 30 секунд. 17. При наличии агглютинации исследуемая кровь маркируется как резус положительная, при отсутствии - как резус отрицательная. 18. Для определения резус-принадлежности ускоренным методом на плоскости при комнатной температуре могут быть использованы поликлональные сыворотки анти-D с неполными антителами, приготовленные в комбинации с коллоидами (альбумином, полиглюкином). ^ 5. Метод конглютинации с применением 10 % раствора желатина 19. Используют реагенты, содержащие неполные поликлональные антитела (сыворотки анти-D) или неполные моноклональные антитела (цоликлоны анти-D). 20. В 2 пробирки вносят по 0,02-0,03 мл осадка эритроцитов, для чего выдавливают из пипетки небольшую каплю эритроцитов и касаются ею дна пробирки. Затем в первую пробирку добавляют 2 капли (0,1 мл) желатина и 2 капли (0,1 мл) реагента, во вторую (контрольную) пробирку добавляют 2 капли (0,1 мл) желатина и 2 капли (0,1 мл) 0,9 % изотонического раствора натрия хлорида. 21. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, после чего их помещают в водяную баню на 15 минут или термостат на 30 минут при температуре +460С - 480С. По истечении указанного времени в пробирки добавляют по 5-8 мл 0,9 % изотонического раствора натрия хлорида и перемешивают содержимое путем 1-2-кратного переворачивания пробирок. 22. Результат учитывают, просматривая пробирки на свет невооруженным глазом или через лупу. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о том, что исследуемый образец крови резус положительный, отсутствие агглютинации - о том, что испытуемая кровь резус отрицательная. В контрольной пробирке агглютинация эритроцитов должна отсутствовать. 23. Для определения резус-принадлежности ускоренным методом в пробирке при комнатной температуре может быть использован универсальный реагент, представляющий собой сыворотку анти-D с неполными антителами, разведенную 33 % полиглюкином. ^ 6. Пробы на индивидуальную совместимостькрови донора и реципиента 24. Проба на индивидуальную совместимость позволяет убедиться в том, что у реципиента нет антител, направленных против эритроцитов донора и таким образом предотвратить трансфузию эритроцитов, несовместимых с кровью больного. 25. Проба на совместимость, выполняемая на плоскости при комнатной температуре, имеет целью выявить у реципиента полные групповые агглютинины системы АВ0, MNSs, Lewis и другие. 26. Проба на совместимость с применением 10 % желатина, 33 % полиглюкина, непрямая проба Кумбса предназначена для выявления у реципиента неполных групповых антител. 27. Наиболее чувствительной и рекомендуемой является двухэтапная проба в пробирках с антиглобулином, затем комбинация двух проб - пробы на плоскости при комнатной температуре и непрямой пробы Кумбса. 28. Вместо непрямой пробы Кумбса может быть применена реакция конглютинации с 10 % желатином или реакция конглютинации с 33 % полиглюкином. 7. Проба на совместимость по группам крови системы АВ0 29. На пластинку наносят 2-3 капли сыворотки реципиента и добавляют небольшое количество эритроцитов с таким расчетом, чтобы соотношение эритроцитов и сыворотки было 1:10 (для удобства рекомендуется сначала выпустить через иглу несколько капель эритроцитов из контейнера на край пластинки, затем оттуда стеклянной палочкой перенести маленькую каплю эритроцитов в сыворотку). Далее эритроциты перемешивают с сывороткой, пластинку слегка покачивают в течение 5 минут, наблюдая за ходом реакции. По истечении указанного времени в реагирующую смесь можно добавить 1-2 капли 0,9 % изотонического раствора натрия хлорида для снятия возможной неспецифической агрегации эритроцитов. 30. Учет результатов. Наличие агглютинации эритроцитов означает, что кровь донора несовместима с кровью реципиента и не должна быть ему перелита. Если по истечении 5 минут агглютинация эритроцитов отсутствует, то это означает, что кровь донора совместима с кровью реципиента по групповым агглютиногенам. ^ 8. Проба на совместимость по системе резус 31. Ввиду того, что при иммунизации резус-фактором образуются в подавляющем большинстве случаев неполные антитела, для пробы на совместимость рекомендуется использовать 33 % раствор полиглюкина, 10 % раствор желатина, антиглобулиновая сыворотка. 32. Проба на совместимость переливаемой крови по резус-фактору с использованием 33 % раствора полиглюкина проводится в пробирке без подогрева в течение 5 минут. На дно пробирки, с предварительно сделанными обозначениями, вносят 2 капли сыворотки больного, одну каплю донорской крови и одну каплю 33 % раствора полиглюкина, специально приготовленного для лабораторных целей. Содержимое пробирки перемешивают путем встряхивания, затем пробирку наклоняют почти до горизонтального положения и медленно поворачивают таким образом, чтобы содержимое растекалосъ по стенкам пробирки. Эту процедуру продолжают 5 минут. После того в пробирку доливают 3-4 мл изотонического раствора хлорида натрия, перемешивают содержимое путем 2-3 кратного перевертывания пробирки (не взбалтывать) и просматривают на свет невооруженным глазом. Наличие агглютинации эритроцитов на фоне просветленной или полностью обесцвеченной жидкости указывает на то, что кровь донора несовместима с кровью больного и не может быть ему перелита. Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным, без признаков агглютинации эритроцитов, кровь донора совместима с кровью больного в отношении резус-фактора-Rh0. 33. Проба на совместимость с использованием 10 % раствора желатина производится в пробирках при температуре +460С +480С в течение 10 минут. На дно пробирки, соответственно обозначенной, помещают одну каплю эритроцитов донора, затем добавляют туда 2 капли подогретого до разжижения 10 % раствора желатина и 2-3 капли сыворотки больного. Раствор желатина перед употреблением необходимо тщательно просмотреть. При помутнении или появлении хлопьев он непригоден. Содержимое пробирки перемешивают путем встряхивания и помещают в водяную баню при температуре от +460 до +480С на 10 минут. Затем пробирку извлекают из водяной бани, добавляют в нее 5-8 мл изотонического раствора хлорида натрия, перемешивают содержимое путем 1-2 кратного перевертывания пробирки и просматривают в проходящем свете невооруженным глазом или через лупу. Наличие агглютинации в виде взвеси мелких, реже крупных комочков на фоне просветленной или полностью обесцвеченной жидкости означает, что кровь донора несовместима с кровью больного и не должна быть ему перелита. Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным, слегка опалесцирует и не наблюдается агглютинация эритроцитов, кровь донора совместима с кровью больного в отношении резус-фактора-Rh0D. 34. Непрямая проба Кумбса (антиглобулиновая проба). В пробирку вносят одну каплю (0,02 мл) осадка трижды отмытых эритроцитов донора, для чего выдавливают из пипетки небольшую каплю эритроцитов и касаются ею дна пробирки, и добавляют 4 капли (0,2 мл) сыворотки реципиента. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, после чего их помещают на 45 минут в термостат при температуре +370С. По истечении указанного времени эритроциты вновь трижды отмывают и готовят 5 % взвесь в 0,9 % изотонического раствора натрия хлорида. Далее 1 каплю (0,05 мл) взвеси эритроцитов на фарфоровую пластинку, добавляют 1 каплю (0,05 мл) антиглобулиновой сыворотки и перемешивают стеклянной палочкой. Пластинку периодически покачивают в течение 5 минут. Учет результатов проводят невооруженным глазом или через лупу. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о том, что кровь реципиента и донора несовместимы, отсутствие агглютинации является показателем совместимости крови донора и реципиента. ^ 9. Метод агглютинации в геле для определенияантигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител 35. Метод основан на агглютинации эритроцитов в агаровом геле сефадекс, позволяет стандартизовать реакции гемагглютинации и получать достоверные результаты. 36. Диапазон выполняемых тестов включает в себя определение фенотипа эритроцитов (включая слабые варианты антигенов), антиглобулиновый тест, скрининг и идентификацию антител, тесты на совместимость и некоторые другие. 37. Гелевая технология предусматривает разделение эритроцитов при центрифугировании, при этом неагглютинированные эритроциты проходят через гель и оседают на дне пробирок (отрицательный результат), в то время как агглютинированные эритроциты задерживаются на поверхности или в толще геля (положительный результат). ^ 10. Причины ошибок при определении группы крови,резус-принадлежности и проведении проб на индивидуальнуюсовместимость и меры их предупреждения 38. Ошибки при определении группы крови, резус-принадлежности и проведении проб на индивидуальную совместимость возникают при нарушении техники выполнения исследования или в случаях трудноопределимых групп крови. ^ 11. Технические ошибки 39. Ошибочный порядок расположения реагентов. При правильной оценке результата в каждом отдельно взятом реагенте можно сделать неправильное заключение о группе крови и резус-принадлежности если нарушен порядок расположения реагентов в штативе или на пластинке. Каждый раз при определении группы крови следует проверять расположение реагентов, а также визуально оценивать их качество, исключать использование помутневших, частично высохших реагентов, реагентов с истекшим сроком годности. 40. Определение группы крови производят при температуре не ниже 15°С, поскольку исследуемая кровь может содержать холодовые агглютинины, вызывающие неспецифическое склеивание эритроцитов при пониженной температуре. Видимость агглютинации может создавать образование «монетных столбиков». Неспецифическая агрегация эритроцитов распадается после добавления 1-2 капель физиологического раствора и покачивания пластинки. При повышенной температуре агглютинины утрачивают активность, поэтому определение группы крови производят при температуре не выше 25°С. 41. Оптимальное для реакции агглютинации соотношение эритроцитов и тестовых реагентов - 1:10 при использовании гемагглютинирующих сывороток, 2-3:10 при использовании моноклональных реагентов. При значительном избытке эритроцитов агглютинация может быть не замечено, а особенно в тех случаях, когда агглютинационные свойства эритроцитов снижены - подгруппа А2. При недостаточном количестве эритроцитов агглютинация медленно появляется, что также может привести к неправильной трактовке результатов. 42. Агглютинация эритроцитов появляется в течение первых 10 секунд, однако наблюдение за ходом реакции следует проводить не менее 5 минут, особенно в тех каплях, где появилась агглютинация. Это позволяет выявить слабый антиген А2, характеризующийся замедленной агглютинацией. ^ 12. Трудноопределяемые группы крови 43. Подгруппы крови. Антиген А, содержащийся в эритроцитах группы А (II) и АВ (IV) может быть представлен двумя вариантами (подгруппами А1 и А2). Эритроциты А2 отличаются от эритроцитов А1 низкой агглютинационной способностью по отношению к антителам анти-А. Подгруппы крови в клинической трансфузиологии значения не имеют, поэтому при переливании эритроцитов их не учитывают. Лицам, имеющим антиген А2, можно переливать эритроциты А1. Исключение составляют реципиенты, имеющие экстраагглютинины альфа 1 и альфа 2. Эти антитела не вызывают посттрансфузионных осложнений, однако, проявляют себя в пробе на индивидуальную совместимость. 44. Неспецифическая агглютинация эритроцитов. О ней судят на основании способности эритроцитов агглютинироваться сыворотками всех групп, включая АВ (IV). Неспецифическая агглютинация наблюдается при аутоиммунных заболеваниях сопровождающихся адсорбцией аутоантител на эритроцитах, при гемолитической болезни новорожденных, эритроциты которых нагружены аллоантителами матери. С целью отличия неспецифической агглютинации от специфической, при наличии агглютинации эритроцитов с реагентами анти-А, анти-В, анти-АВ, анти-D необходимо провести пробу со стандартной сывороткой АВ (IV) и 0,9 % изотоническим раствором натрия хлорида. В противном случае реципиент может быть ошибочно отнесен к группе АВ (IV) резус-положительной, что повлечет за собой неправильный выбор донора. Если из-за неспецифической агглютинации эритроцитов группу крови больного установить не удается, заключение о групповой принадлежности крови не выдают, образец крови направляют в специализированную лабораторию, где делают подбор по антигенной структуре. 45. Кровяными химерами называют одновременное пребывание в кровяном русле двух популяций эритроцитов, отличающихся по группе крови и другим антигенам. Трансфузионные химеры возникают в результате многократного переливания эритроцитной массы или взвеси группы О(I) реципиентам другой группы. Истинные химеры встречаются у гетерозиготных близнецов, а также после пересадки аллогенного костного мозга. Приложение 2к Правилам хранения, переливаниякрови, ее компонентов и препаратов ^ Подбор эритроцитов для переливания новорожденным по системе АВ0 Мать Ребенок Переливаемая среда Цельнаяконсервированная донорскаякровь Эритроцитнаямасса иливзвесь Плазмасвежезамороженнаяили нативная 1 2 3 4 5 О (I) О (I) О (I) О (I) Любая А (II) А (II) А (II) А (II),О (I) А (II),АВ (IV) B (III) B (III) B (III) B (II),О (I) B (III),АВ (IV) АВ (IV) А (II) А (II) А (II),О (I) А (II),АВ (IV) АВ (IV) B (III) B (III) B (III),О (I) B (III),АВ (IV) АВ (IV) АВ (IV) АВ (IV) Любая АВ (IV) О (I) А (II) О (I) О (I) А (II),АВ (IV) О (I) B (III) О (I) О (I) B (III),АВ (IV) А (II) B (III) - О (I) B (III),АВ (IV) B (III) А (II) - О (I) А (II),АВ (IV) А (II) АВ (IV) - А (II),О (I) АВ (IV) B (III) АВ (IV) - B (III),О (I) АВ (IV) А (II) О (I) О (I) О (I) Любая B (III) О (I) О (I) О (I) Любая