Содержание
Введение
1. Характеристикаконечной продукции производства
2. Химическая схемапроизводства
3. Технологическаясхема производства
4. Характеристикасырья, материалов
.1 Приготовление стерильныхпитательных сред
4.2 Приготовление посевного материала
4.3 Условия культивирования
5. Получение препаратов лизина
5.1 Жидкий концентрат лизина
5.2 Сухой концентрат лизина
5.3 Кристаллический лизин
Введение
Впоследние годы в Российской Федерации резко сократилась продукцияживотноводства и, как следствие этого, возрос до недопустимых размеров импортмясопродуктов.
Одной изпричин уменьшения производства мясопродуктов является ухудшение качества кормови повышение их стоимости, что вызвано практически полной остановкой предприятийпроизводивших кормовой белок в силу их неконкурентоспособности при изменившейсяструктуре цен. Сегодня кормовой белок почти полностью импортируется.
Однако,есть альтернативное решение проблемы повышения качества кормов. Известно, чтодефицит белка может быть компенсирован введением в корма незаменимыхаминокислот, причем в первую очередь устраняется дефицит аминокислоты,находящейся в относительном минимуме, затем следующей – и так далее, т.к.привесы определяются не общим содержанием белка, а именно по содержаниюнаиболее дефицитной незаменимой аминокислоты в нем. Порядок лимитированияопределяется применяемыми компонентами кормов и потребностями в аминокислотах уживотных и птицы. Аминокислотный состав кормовых ингредиентов и потребности вразличных аминокислотах хорошо изучены и давно известны.
Так, длязерна злаковых и всех сельскохозяйственных животных и птицы лимитирующимиаминокислотами являются метионин, лизин, триптофан и треонин.
Внастоящее время в России в сельском хозяйстве птицеводство является ведущейотраслью. При кормлении птицы первой лимитирующей аминокислотой является лизин,второй — метионин, который производится как в России, так и за рубежом методомхимического синтеза, и в достаточных количествах поступает на российский рынок.
Эффектприменения незаменимых аминокислот, в частности L-лизина, основывается на том,что белок зерновых – основного компонента кормов для сельскохозяйственныхживотных и птицы – имеет неблагоприятный состав, образующих его аминокислот.Одна из них – L-лизин – находится в дефиците и не может бытьсинтезирована в организме животного.
Обычнодефицит устраняется внесением в рацион т.н. «протеиновых» (белковых) добавок,богатых L-лизином – таких, как рыбная и мясокостная мука, соевый иподсолнечниковый шрот, гидролизные и кормовые дрожжи. Однако дефицит, как былосказано выше, можно устранить и просто введением в корм соответствующегоколичества кристаллического L-лизина.
В развитых странах впоследнее время потребление L-лизина интенсивно растет – 12-15% приростаежегодно – и приблизилось сегодня к 500 тыс.т./год. До начала экономическихреформ СССР являлся крупнейшим производителем L- лизина (до 1/3 мировогопроизводства в середине 80-х годов).
1. Характеристикаконечной продукции производства
Лизин – этонезаменимая аминокислота, входящая в состав практически любых белков, необходимадля роста, восстановления тканей, производства антител, гормонов, ферментов, альбуминов.
В настоящее время установлено, что лизин в организме являетсяне только структурным элементом белка, но и выполняет ряд важных биохимическихфункций — является предшественником карнитина и оксилизина, способствуеттранспорту кальция и стронция в клетки и др.
Доказано, что лизин улучшает аппетит, способствует секрециипищеварительных ферментов, предотвращает кариес зубов у детей.
В основномL-лизин используется в качестве кормовой добавки, что связано с низкимколичеством этой аминокислоты в растительных кормах.
Лизинсодержащиепрепараты могут использоваться в растениеводстве. Применение таких препаратов,содержащих кроме аминокислот и другие биостимуляторы, дает значительноеувеличение урожая тепличных и полевых сельскохозяйственных культур.
Кроме того,предложено использовать препараты лизина в качестве пищевых атрактантов длядезориентации личинок проволочников.
Пантотенатлизина может быть использован против лейкопении. Противоанемическим ианаболизирующим действием обладают соли фитиновой кислоты и лизина, оксилизина.Ацетиласпартат лизина может использоваться для лечения миокарда, интоксикацийэндогенного или экзогенного происхождения, заболеваний печени и т. д.
Образующиесяпосле ферментации клетки микроорганизмов, наряду с маточными растворами, обычноутилизируют в белковый кормовой продукт по технологии производства кормовыхдрожжей.
Лизин (2,6-диаминогексановая кислота) — алифатическаяаминокислота с выраженными свойствами основания; незаменимая аминокислота. Лизинизвестен в виде двух оптически активных D- и L-форм. Бесцветные кристаллы.Природный L-лизин (tпл 224—225°С, с разложением) хорошорастворим в воде, кислотах и основаниях, плохо — в спирте. Выделен в 1889 изгидролизата казеина, синтезирован в 1902; входит в состав почти всех белковживотного и растительного происхождения (в большом количестве лизин содержитсяв гистонах и протаминах, в малом — в белках злаков. Отсутствие лизина в пищезамедляет рост у детей, у взрослых приводит к отрицательному балансу азота инарушению нормальной жизнедеятельности организма. Суточная потребность в лизинеу взрослых составляет 23 мг/кг массы тела, у младенцев — 170мг/кг.
Химическаяформула: C6H14N2O2
2.Химическая схема производства
Химизмобразования молекулы лизина показан на рис. 1.
/>
Рис. 1. Химизм биосинтеза лизина
Приполучении лизина необходимо исключить нежелательные побочные процессы. Так, принедостаточной аэрации может идти образование аланина или молочной кислотывместо синтеза лизина. Очень важным фактором является концентрация дефицитныхаминокислот — гомосерина, метионина и треонина в среде. Для нормального роста ибиосинтеза лизина культурой Brevibacterium sp. 22оптимальной считается концентрация треонина в 800 мг, метионина — 200 мг на литрпитательной среды. Кроме того, для развития культуры необходим тиамин вконцентрации 200 мкг на 1 л среды. Важным регулятором процесса является биотин.Одна и та же культура Brevibacterium sp. 22 приконцентрации биотина в среде, равной 1—4 мкг/л, продуцирует глутаминовуюкислоту, а при концентрации 15— 20 мкг/л — лизин. Считают, что биотин изменяет проницаемость клеточной оболочки. Приконцентрации биотина 2,5 мг/л стимулируется также образование молочной кислоты.
Важную рольиграет треонин, являясь обязательным фактором роста на начальном этапеферментации. Однако концентрация его не должна быть большой, так как надальнейших этапах ферментации (при синтезе лизина) он может действовать какингибитор фермента аспартаткиназы. Присутствие лизина усиливаетингибирующие свойства треонина.
Впроизводственных условиях, если выход лизина составляет 35,7% от используемыхсахаров, суммируемое превращение глюкозы,аммиака и кислорода в лизин иклеточную биомассу можно описать уравнением:
100C6H12O6+ 219O2 + 86NH3 35C6H14N2O2+ 16C8H13O4N + 262CO2 + 380H2O+ 1669кДж
В правойчасти данного уравнения первый член показывает количество лизина, получаемогоиз глюкозы. Из 1 молекулы глюкозы образуется 0,35 молекулы лизина. Второй членхарактеризует образование биомассы. Из уравнения видно, что на переработкукаждой молекулы глюкозы требуется 2,19 молекулы кислорода. Это значит, чтоинтенсивность аэрации во время роста культуры должна составлять 2—4 г 02в час на 1 л среды.
3. Технологическаясхема производства
В зависимостиот назначения из культуральной жидкости можно получить различныемикробиологические препараты (рис. 1): жидкий концентрат лизина (ЖКЛ), сухойкормовой концентрат лизина (ККЛ), кристаллический лизин.
/>
Рис. 2. Технологическая схема производствапрепаратов лизина
Длябиосинтеза лизина используют гомосериндефицитные мутанты ауксотрофных бактерийродов Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium.
4. Характеристикасырья, материалов
Впромышленных условиях в качестве источника углерода применяют фуражное зерно,мелассу, гидрол, гидролизаты целлюлозосодержащего сырья, крахмал, а такжеуксусную кислоту.
4.1 Приготовлениестерильных питательных сред
Всепродуценты лизина являются биотинзависимыми микроорганизмами. Количествобиотина в среде должно быть значительно выше (29 мкг/л), чем это необходимо длянормального роста и развития микробной клетки (4–5 мкг/л). Если снизитьколичество биотина до 1–2 мкг/л, биосинтез лизина замедляется, но одновременноусиливается образование глутаминовой кислоты.
Источникомбиотина, витаминов и ряда аминокислот являются обычно кукурузный экстракт исвекловичная меласса. Максимальный биосинтез лизина наблюдается на средах ссахарозой (табл. 1).
Таблица1.
Влияние источника углерода (концентрация 7,5 %) на биосинтез
L-лизина продуцентом Brevibacterium flavum
Источник углерода
АСБ*, г/л
Лизин, г/л
Ассимилляция сахара, %
YP/S Глюкоза 15,2 22,0 7,6 0,37 Сахароза 18,2 25,0 7,1 0,42 Галактоза 2,0 1,0 0,7 0,02 Ксилоза 5,2 3,5 2,5 0,06 Манноза 9,3 6,0 4,5 0,10 Рамноза 3,6 2,0 1,3 0,03 Арабиноза 1,0 Следы 0,7
Существенноезначение в процессе ассимиляции углеродсодержащих соединений имеет ихконцентрация в питательной среде. Наибольшее количество лизина получено насредах, содержащих 10–12 % сахарозы. При более высоких концентрациях сахарозыудельная скорость роста продуцента снижается и уменьшается коэффициент конверсиисахара (YP/S).
4.2 Приготовлениепосевного материала
Посевнойматериал готовится в две стадии: сначала в колбах, а затем в посевных аппаратахпри аэрации (11/мин) и интенсивном перемешивании и автоматическом регулированиитемпературы (300С) и рН=7 в соответствии с регламентом.
Если вкачестве источника углерода используют уксусную кислоту (ацетат аммония), то,вследствие угнетающего действия ацетат-ионов на рост клеток при концентрациивыше 2 %, осуществляют дробную подачу субстрата по мере его потребления.
Промышленнымипродуцентами лизина являются гомосериндефицитные мутанты ауксотрофных бактерий родов Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium.
Клетки Brevibacterium sp. 22культуры представляют собой неподвижные грамположительные палочки длиной 1,2—2,5мкм, но иногда могут иметь овальную или круглую форму.
Клетки имеютмаксимальную длину в логарифмической фазе роста. У быстрорастущих клеток хорошовыражен рибосомальный белоксинтезирующий аппарат, а у медленно растущих, ноинтенсивно синтезирующих лизин — мембранная система. У клеток, интенсивносинтезирующих лизин, большую активность проявляют и ферменты цикла Кребса,многие из которых связаны с мембранами.
Средиисточников азота наиболее часто используют соли аммония и кукурузный экстракт(получают обработкой кукурузных жмыхов серной кислотой при 90–100 °С),кислотные гидролизаты дрожжей или казеина. Последние содержат необходимыеауксотрофному штамму аминокислоты и витамины. Оптимальное соотношение углеродаи азота в среде составляет 11: 1 (при его увеличении выход лизина падает, приуменьшении накапливается аланин). В питательной среде также должны содержатьсясоли калия, магния и фосфора (табл. 2).
Таблица2.
Состав питательных сред при выращивании продуцента лизина (%)
Компоненты
Посевной аппарат
Промышленный ферментер
Мелассная среда Меласса (по содержанию сахара) 7,5 7–12 Кукурузный экстракт (содержание СВ 50 %) 2 1,2–1,5 Сульфат аммония 2 2 Однозамещенный фосфат калия 0,05 0,05 Двухзамещенный фосфат калия 0,05 0,05 Мел 1 1 Пеногаситель синтетический 0,1 0,1 Вода Остальное Остальное рН среды 6,9–7,0 7,0–7,2 Ацетатная среда Ацетат аммония 1,5 1,5 Глюкоза 1,0 1,0 Однозамещенный фосфат калия 0,02 0,02 Сульфат магния 0,04 0,04 Сульфат аммония 3,0 3,0 Гидролизат соевой муки 1,5 1,5
4.3 Условиякультивирования
Общая схемапроизводства препаратов лизина представлена на рис. 2
Процессполучения лизина требует строгих асептических условий.
Выращиваниепроизводственной культуры продуцента лизина обычно осуществляется периодическимспособом в ферментаторах, объем которых составляет 50, 63 или 100 м3. Посевной материал в количестве 5–10 об. % от объема питательной среды поступает вферментатор. Сразу после засева в него подается воздух, нагретый до 50 °С, израсчета 1 объем воздуха на 1 объем питательной среды в минуту при давлении0,12–0,13 МПа.
Продолжительностьферментации составляет 55–72 ч, процесс проводят при интенсивном перемешиваниисреды, температуре 28–32 °С, рН = 7,0÷7,5 (поддерживается добавлением всреду аммиачной воды) и периодической подачей стерильного пеногасителя.
Процесскультивирования состоит из двух стадий. В первые сутки клетки потребляют около25 % углеводов и азотистых веществ; в это время накапливается почти всябиомасса. На второй стадии скорость накопления биомассы резко снижается, но вКЖ происходит накопление лизина. По окончании процесса перестает потреблятьсятитрующий агент (аммиачная вода) и концентрация лизина составляет 60–100 г/л,биомассы накапливается 10–15 г/л (СВ), коэффициент потребления сахара в расчетена лизин составляет 25–35 %.
5. Получение препаратов лизина
В зависимостиот назначения из КЖ можно получить различные микробиологические препараты (рис.2): жидкий концентрат лизина (ЖКЛ), сухой кормовой концентрат лизина (ККЛ),кристаллический лизин.
5.1 Жидкийконцентрат лизина
Для полученияЖКЛ и ККЛ культуральную жидкость, содержащую 10–13 % СВ, подкисляют HCl до рН =5,0 и добавляют 0,15% раствор гидросульфита натрия для стабилизации лизина.Стабилизированную культуральную жидкость упаривают под вакуумом до 35–40 % СВ.
5.2Сухойконцентрат лизина(ККЛ) получают, высушивая ЖКЛ в распылительных сушилках до влажности 5–6 %.Сухой ККЛ очень гигроскопичен, поэтому сразу после сушки его упаковывают вполиэтиленовые мешки.
Менеегигроскопичный ККЛ получают, высушивая ЖКЛ вместе с наполнителями (костноймукой, кормовыми дрожжами, пшеничными отрубями и др.).
В составкормовых препаратов входят помимо лизина и другие аминокислоты, а такжевитамины, макро- и микроэлементы (табл. 3).
Таблица3.
Химический состав кормовых препаратов лизина
Компонент
Содержание
Аминокислоты, масс. %от массы СВ Лизин 15–20 Глутаминовая кислота 2,5–3,7 Валин 1,2–4,8 Аланин 1,3–3,1 Аспарагиновая кислота 0,8–1,4 Лейцин 0,6–1,1 Пролин 0,3–2,8 Глицин 0,6–0,9 Аргинин 0,3–0,8 Тирозин 0,4–0,7 Метионин 0,4–0,6 Изолейцин 0,4–0,6 Фенилаланин 0,2–0,6 Триптофан 0,5–0,6 Серин 0,4–0,6 Треонин 0,3–0,6 Гистидин 0,2–0,3 Цистеин 0,2–0,3
Азотистые вещества, масс. %от массы СВ Общий азот 5,2–7,9 Протеин (N6,25) 37,5–49,4 Азот: белковый 1,9–3,6 α-аминный 0,9–2,0 аммиачный 0,3–1,4 Бетаина 0,82–1,66 Бетаин 6,0–13
Витамины, мкг/г
Тиамин (витамин В1) 1,7–9,7
Рибофлавин (витамин В2) 84,2–160
Пантотеновая кислота (витамин В3) 30–60
Фолиевая кислота (витамин В4) 10–20
Пиридоксин (витамин В6) 100–340 Никотиновая кислота (витамин РР) 8–10 Другие органические вещества, масс. % от массы СВ: редуцирующие вещества 4,6–12,7 Жиры 1,3 клетчатка 0,3
Минеральные вещества, масс. %от массы золы Зола, масс. % от массы СВ 19,0–28 Кальций 5,2–12,5 Калий 28,6–33,6 Натрий 0,8 Магний 1,1–1,5 Железо 0,1–0,25 Фосфор 2,2–4,4 Кремний 10,9–11,5
Микроэлементы, мг/100 г Цинк 1821 Кобальт 67,8 Кадмий 476,7 Молибден 545,9 Марганец 3071 Медь 280
5.3 Кристаллическийлизин выделяют изКЖ после отделения биомассы.
Для получениякормовых продуктов пригодны препараты лизина с содержанием основного вещества(лизинмонохлоргидрата) от 70 % и выше. При этом допускается окраска кристалловв желтый и светло-коричневый цвета. К препаратам медицинского назначенияпредъявляются более жесткие требования; для парентерального питания содержаниеосновного вещества должно быть не ниже 99 %.
Принормальном течении процесса доля побочных аминокислот не превышает 3 % отсодержания лизина, доля микробных клеток — 1,5 %. Для отделения биомассы от КЖиспользуют саморазгружающиеся сепараторы, а также фильтрование с намывным слоемлибо на барабанном вакуум-фильтре, либо на рамных фильтр-прессах с последующейпромывкой осадка водой.
Растворы,содержащие лизин, после подкисления соляной кислотой (рН = 5,0÷5,2) ивведения стабилизатора (NaHSO3) концентрируют выпариванием в вакуумедо 45–50 % СВ. Полученный концентрат подвергают кристаллизации, которуюпроводят при 5–12 °С в течение 1–2 сут. Осадок отделяют от маточника впроточных промышленных центрифугах и далее высушивают в распылительной сушилкеили в кипящем слое. Готовый продукт, как правило, окрашен в коричневый цвет исодержит не менее 70 % основного вещества.
Другимспособом выделения лизина является ионообменный процесс. Для этого растворпродукта подкисляют H2SO4 до рН = 1,6÷2,0, врезультате чего образуется дикатион аминокислоты. После хемосорбции накатионите (КУ-2х8), используемом в Н+ илиNH4+ форме, отделяются примеси нейтральной и кислотнойприроды. Аминокислоты элюируют из катионита 0,5–5 % гидроксида аммония, растворупаривают, подкисляют HCl до рН = 4,9÷5,0, а концентрат кристаллизуютпри 5–12 °С, получая кристаллы монохлоргидрата лизина светло-желтого илисветло-коричневого цвета, которые после высушивания содержат 90–95 % основноговещества и 1,0–12,5 % золы. Для получения препарата более высокой степеничистоты в схему очистки включают стадию обработки раствора активным углем,перекристаллизацию из 50% этанола и др.