Оглавление1. Введение2. Химическая природа грамицидина Аи его общие свойства
3. Биологическаяроль грамицидина А
4. Структураграмицидина А
4.1Конформации грамицидина А в органических растворителях
4.2Структура грамицидина А в липидных мембранах и мембрано- подобных средах
4.3Влияние связывания катионов на конформацию грамицидина А
4.4Взаимоотношения между конформационными состояниями грамицидина А и проводящимиформами.
4.5 Инженерияграмицидинового канала
5. Фундаментальноеи практическое значение грамицидина А
6. Выводы
7. Списокиспользованной литературы
1. Введение
Грамицидин А известен уже более 50лет, но до сих пор остается в центре внимания. Являясь очень простым по своейхимической структуре (всего 15 аминокислот) он обладает свойством образовыватьионселективный трансмембранный канал, не уступающий по характеристикам огромнымпо сравнению с ним белковым каналам, которые представлены, например, в нервнойсистеме. Возможно, он является предшественником этих самых каналов и за времяэволюции “оброс” всевозможными сенсорами напряжения, селективными фильтрами идругими регуляторными элементами. Если продолжать такое сравнение, то в планедетальной трехмерной структуры так мы пока не знаем ни один другой ионныйканал, и применение грамицидина А для построения всевозможных моделей итеоретических исследований стало одним из путей к детальному пониманиюразличных молекулярных механизмов и структурно-функциональных взаимодействий.И, пожалуй, грамицидин А является одной из лучших таких моделей.
2. Химическая природа грамицидина А и общие свойства
.
Грамицидин А входит в группу линейныхполипептидов, продуцируемых бактериями Bacillus Brevis, на стадии спорообразования.Выделяют несколько особенностей данной группы пептидных антибиотиков:
1) Все 15 аминокислот входящие в составпоследовательности грамицидинов являются гидрофобными;
2) В их последовательности наблюдаетсячередование L- и D- конфигураций аминокислот;
3) С — и N- конец грамицидинов блокированны спомощью этаноламина и формила соответственно.
Природня смесь (грамицидин D) состоит из трех основных компонентов,отличающихся одной аминокислотой в 11 положении,. Согласно этому отличиюграмицидины классифицируют на: грамицидин А — в 11 положении Trp, грамицидин B — в одиннадцатом положении — Phe, и грамицидин С — в одннадцатом положении — Tyr.
Общая последовательность грамицидинов:
HCO-(L)Val-Gly-(L)Ala-(D)Leu-(L)Ala-(D)Val-(L)Val-(D)Val-(L)Trp-(D)Leu-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
X-(D)Leu-(L)Trp-(D)leu-(L)Trp-NH2CH2CH2OH
11 12 13 14 15
где Х= L-Trp для грамицидина А,
L-Phe для грамицидина В,
L-Tyr для грамицидина С.
Грамицидин А, В и С представленны всоотнощении 85:5:15 соответственно. Ко всему прочему имеется некоторая гетерогенность по первойаминокислоте: в природной смеси 90% грамицидинов имеют в первом положении Val, в то время как остальные 10% имеют Ile. Большинство начальных исследованийбыло проведенно на этой 6-ти компонентной смеси.
Грамицидин К – имеющий ковалентноприсоеденную жирную кислоту к С-концу так же был выделен в различныхсоотношениях, в зависимости от метода выделения.
Грамицидин S ( Советский ), так же продуцируется видом Bacillus Brevis, но являетсяциклодекапептидом и действует по механизму ионного переносчиика (транспортера), и таким образом эта молекула неимеет отношения к линейным грамицидинам ни структурно, ни функционально.
Благодаря тому, что впоследовательности грамицидина А нет ни одной заряженной аминокислоты иблокированны N-и С-конец (таким образомисключается возвожность образования цвиттер-иона при любых значениях рН), этамолекула практически нерастворима в воде ( меньше 10 мг в литре), но за тоимеет сильное сродство с гидрофобному региону липидной мембраны. Грамицидин Аслабо растворим в углеводородах, за то сильно во многих низших спиртах,органических кислотах и других органических растворителях, таких как:диметилсульфоксид, ацетон, диоксан и трифторэтанол. Он так же может бытьрастворенн в воде в присутствии лизолецитина, ганглиозидов, додецилсульфатанатрия и некоторых других детергентов.
Начальные исследования грамицидинабыли проделанны на природной смеси, но после выяснения состава данной смесидальнейшие эксперименты проводились на грамицидине А, как основном компонентеприродной смеси.3. Биологическая роль грамицидина А
Грамицидин играет важнуюроль в процессе спророобразования у Bacillus brevis, определяяформирование нормальных спор. Показано, что штаммы, деффекные по синтезуграмицидина формируют споры с повышенной термочуствительностью. Грамицидин Аспецефически ингибирует экспрессию отдельных (вегетативных) генов, определяя,таким образом, переход микроорганизма в покоящуюся стадию. Механизм такойрегуляции до конца не ясен, но известно, что грамицидин А препятствуетобразованию комплекса РНК-полимеразы с ДНК, необходимого для инициациитранскрипции. Предложенно две мишени связывания грамицидина: 1) грамицидин Аспецифически связывается с определенным участком ДНК и препядствуеттранскрипции. Такой механизм похож на действие другого пептидного антибиотика — тироцидина, так же синтезируемоего Bacillus brevis, который, связываясьс молекулой ДНК, препятствует образованию комплекса РНК-полимераза/ДНК, и какследствие ингибирует экспрессию определенных генов; 2) грамицидин А связываетсяс определенным участком РНК-полимеразы, чо приводит к изменению ее конформациии невозможностью связывания с ДНК .
Возможно грамицидин Аучавствует в сложном каскаде биохимических процессов вместе с другимиантибиотиками (тироцидины-серияциклических пептидов, так же синтезируемых видом Bacillus brevis настадии спорообразования), результатом которых является переход от вегетативногороста к споре.
Линейные грамицидиныобладают антибиотическим и спермицидным эффектом направленным противграмположительных бактерий. Антибиотический эффект грамицидина определяется егоспособностью обрзовывать трансмембранный ионный канал, при чем этот эффектносит бактериостатический характер, что, по-видимому связано с истощениемзапасов АТФ, в организме на который действует грамицидин, который использует Na-K-АТФаза для востановления ионногоградиента .4. Структура грамицидина А
Не смотря на довольно простуюпервичную последовтельность грамицидина, определение природы его трехмернойструктуры, не было стремительным и быстрым. Из-за его небольших размеров и, какследствие, сильной подвижности грамицидин, в зависимости от окружения, можетсуществовать в виде семейства конформаций. Выделяют два основных типа структурыграмицидина: 1) Семейство двойных спиралей, предложенных Витчом (1974, [10] ) и существующих в органическихрастворителях; 2) Семейство одиночных спиралей, предложенных Урри [11] исуществующих в липидных мембранах.
В связи с необычностью химическойструктуры грамицидина, связаной с чередованием конфигураций входящих в егопоследовательность аминокислот стандартная номенклатура не может быть примененадля данной модели, так как грамицидин не формирует ни одного типа структур,имеющихся в глобулярных белках.
Анализируя спектры КДграмицидина, а так же основываясь на теоретических расчетах конформационныхэнергий Урри и сотр. (1971 г. [11]) постулировали существование особойвторичной структуры, названной p4(L,D)-спиралью, являющейся гибридом 4,416 и 4,314спиралей (4,4 – количество остатков на виток, 16 – количество атомов в витке).Рамачандран и Чандрасекаран [12],базируясь в основном на конформационно-энергетических взаимодействияхнезависимо обнаружили такую же вторичную структуру. Позже Урри и сотр. [13] предложили другую модель конформацииграмицидина — p6(L,D) спираль, имеющую 6,3 остатка на виток и центральнуюполость размером 4 Ǻ, которая больше подходит для связывания и транспортакатионов, чем полость в 1,4 Ǻ, имеющаяся в p4(L,D) спирали. Димер полипептидных цепей,ассоциированных конец к концу (N-конецк N-концу, С-конец к С-концу или N-конец к С-концу) с конформацией p6(L,D) спираль имеет размер 25-30 Ǻ и, таким образом,может пронизывать липидный бислой и образовывать трансмембранный канал (Рис1А). Каждая спираль стабилизируется 12-ювнутримолекулярныму водородными связями, а димер (при любых способахассоциации) – при помощи6-ти межмолекулярных водородных связей.
Альтернативнойструктурой, предложенной Витчом и сотр в 1974 году [10], является двойная p — спираль, в которой два мономера закрученны друг надруга. Ассоциация между мономерами в такой спирали может быть как параллельной(), так и антипараллельной (¯). Расположение водородных связей вдвойных спиралях грамицидна такое же как и в b-слое, который, как было предположенно, и образуетсясначала между двумя молекулами грамицидина, а затем сворачивается в спираль.Витч и сотр. Так же предложили, что такие спирали с 6-7 остатками на витокбудут иметь размеры, подходящие для пронизывания липидного бислоя и транспортаионов. Дальнейшие исследования такого типа моделей показали возможностьсуществования антипараллельных двойных спиралей с 5,6 и 7,2 остатка на виток(рис1Б).
Рисунок 1.
Схематическое изображениеспиральных димеров (структура Урри) (А) и двухспиральных димеров(структура Витча) (В) грамицидина.
Название p-спираль, предложенное вначале дляописания конформаций грамицидина было не совсем корректным, так как этоназвание обычно используется для 4,416-спиралей, имеющих типичнуюориентацию водородных связей ( все амидные группы пептидного остова в даннойструктуре обращены в оддну сторону, что в результате дает сильный суммарныйдиполь), в то время как спирали предложенные для грамицидина не имеют такуюгеометрию (аминогруппы пептидного остова имеют различное направление, необразуя, таким образом, диполь). Ко всему прочему значения углов f и y, расчитанные для данных структур, отличаются оттаковых в p-спираляхописанных Рамачандраном и Рамакришнаном [14]. Таким образом предложили называть такие структуры b-спиралями, что лучшим образомопределяет образование водородных связей.
Не смотря на явныеразличия двух предложенных структур, спиральные димеры (b-спирали) и двухспиральные димеры (bbспирали) имеют много общего и могутобразовывать структуры почти идентичных размеров, и, более того, способобразования водородных связей одинаков в обоих случаях. Первичнаяпоследовательность грамицидина не делает жестких ограничений для направлениязакручивания спиралей, и они могут быть как право-, так и левозакрученными.Этот потенциальный полиморфизм связан с тем, что чередование L- и D-аминокислот не накладывает жесткихограничений на направление закрутки спирали. Так же, в обоих типахпредложенных структур, боковые цепи аминокислон располагаются с наружнейстороны спирали и ни одной боковой цепи нет во внутренней полости. В результате внутренняя полость(пора ) данных спиралей намного больше таковой для a-спиралей. Это связанно с природойβ-слоя: в последовательностях имеющих только L-аминокислоты, при образовании b-слоя боковые цепи обращеныпоочередно в разные стороны от плоскости слоя, а в случае чередования L- и D-аминокислот все боковые радикалы будут обращены в однусторону от плоскости β-слоя и, таким образом при сворачивании такойструктуры в спираль они все окажутся снаружи, а внутри образуется пора,выстланная карбонильными группами пептидных связей, способная пропускать воду иионы.
2.3.Конформация грамицидина А врастворе
Грамицидин принимает несколько типовконформаций в органических растворителях. Витч и сотр. [10, 15, 16] обнаружили, что диоксане грамицидинсуществует в виде 4-х различных форм, переходящих друг в друга и находящихся вмедленном равновесии (время перехода одной формы в другую измеряется часами).Все четыре формы были разделены методом тонкослойной хроматографии, при чемкаждая отдельная форма, выделенная с тонкослойной пластинки и нанесеннаязаново, опять проявлялась в виде четырех пятен. Различные формы не показалиразличий в первичной структуре. Данные осмометрии и флуресценции [16], показали, что каждая из четурехформ является димером. Методом ИК-спектроскопии [10] было показанно, что все формы являются двойными спиралями,при чем формы 1,2 и 4 ( пронумерованны согласно их хроматографическойподвижноси) являются параллельными двойными спиралями, а форма 3 –антипараллельной двойной спиралью [10]. Каждый из видов имеет характерныйКД-спектр, дающий информацию о направлении закручивания спирали. Так какспектры видов 1 и 2 имеют одинаковую форму, Витч и сотр. предложили, что ониимеют одинаковое направление закручивания [10]. Формы 1,2 и 3 имеют отрицательную эллиптичность вобласти205-240 нм, направлениезакручивания спиралей является противоположной по сравнению с видом 4, формаспектра которого представляет собой зеркальное отображение видов 1,2 и 3.
Спектр грамицидина, полученный сразупосле растворения кристаллов представляет собой спектр формы 3 [10]. Спектр равновесной смеси формпредставляет собой наложение спектров отдельных форм, но за счет того, чтоспектры 1,2 и 4 практически взаимовычитают друг друга, он имеет форму вида 3,даже если она находиться в незначительном количестве по отношению к другим.
КД спектроскопия не дает детальнойинформации о конформации каждой структуры, из-за того, что f и y углы в b-спиралях отличаются от таковых в a-спиралях, b-слоях и b-поворотах, что делает сравнениеданных спектров со спектрами других белков не эффективным.
Эти структуры были подтвержденныметодом двумерного ЯМР [18],и показали что грамицидин в этаноле так же существует в виде 4-хвзаимопревращаемых конформаций. Виды 1 и 2 являются левозакрученнымипараллельными двойными спиралями с 5,6 аминокислотного остатка на виток. Ониотличаются взаимным расположением цепей и имеют одинаковый шаг спирали ивысоту. Вид 2 имеет менее упорядоченные концы спирали обусловленные сдвигом натри аминокислотных остатка [17].
Вид 4 представляет из себяправозакрученной параллельной двойной спиралью, с таким же взаимнымрасположением цепей и высотой спирали что и вид 1 (это обуславливает форму егоспектра КД, являющуюся зеркальным отображением видов 1 и 2).
Вид 3 (форма, образующаяся сразупосле растворения кристаллов грамицидина) является левозакрученнойантипараллельной двойной спиральюс 5,6 остатка на виток и сдвигом на триаминокислотных остатка. Эта форма является наиболее термодинамически выгодной вкристаллическом состоянии (рис.2) [19].
Рисунок 2. СРК Изображение левозакрученногоантипараллельного двухспирального димера грамицидина с 5,6 остатка на виток (PDB Code: 1ALX). А – вид сверху; Б – вид сбоку. Две молекулыграмицидина в димере показанны разными цветами. Водороды скрыты.
Все описанные спирали стабилизирются28-ю межмолекулярными водородными связями, не имеют внутримолекулярныхводородных связей и совпадают с модельными, предложенными Витчом и сотр [10].
Грамицидин образует такую же смеськонформаций в различных спиртах, этилацетате [6], и, хотя, время взаимоперехода в этих растворителяхменьше
[20], множественностьструктур все же удается зарегестрировать методом ЯМР [18].
Исследования грамицидина в растворе DMSO показали, что он находится в видемономера, и обнаруживается в виде одного пятна на тонкослойной пластинке [16]. Методом ЯМР было показано, что в DMSO грамицидин находится в быстромравновесии между неупорядоченной конформацией и различными спиралями, имеющимидругую форму, чем описанные выше [21].
В трифторэтаноле грамицидинпредставляет собой мономер [22],а форма спектра КД больше похожа на спектр грамицидина в мембране [23] , и, таким образом, представляет изсебя еще один вид трехмерной структуры грамицидина.
Таким образом, грамицидин существуетв различных конформациях, в зависимости от растворителя, и даже в виде наборанескольких конформаций в одном растворителе. Такой полиморфизм можно объяснитьпохожими энергиями стабилизации различных структур, обусловленных различнойсетью водородных связей.
2.4.Структура грамицидина влипидных мембранах и мембрано-подобных средах
Спектр КД встроенного в липидныйбислой грамицидина не похож ни на один спектр, полученный в различныхорганических растворителях [24].Более того данный спектр нельзя представить как сумму какой либо комбинацииспектров растворов грамицидина, и, следовательно, как комбинацию каких-токонформаций обнаруженных в растворах. Форма КД спектра мембрансвязанногограмицидина остается неизменной в широком диапазоне температур. С другойстороны, основываясь на данных только спектров КД нельзя сказать, существует лиграмицидин в какой-то одной форме, или же имеется набор конформеров.
Изученные методом ЯМР 13Си 19F меченыеграмицидины, встроенные в липосомы [25-27], показали существование одной доминирующей структуры вмембранах.
Спектр КД мембрансвязанногограмицидина в области дальнего ультрафиолета имеет форму похожую на экситонноерасщепление, свидетельствующую о стэкинг взаимодействиях триптофанов в данномокружении [28]. Экситонноерасщепление так же наблюдается в области ближнего ультрафиолета [18]. что свидетельствует овнутримолекулярных взаимодействиях (Такого экситонного расщепления ненаблюдается в растворах, что является еще одним подтверждением разностиконформаций в мембране и в растворе). Другие методы [29, 30] так же подтверждают наличе стэкингвззаимодействий в мембрансвязанной форме. Данные результаты свидетельствуют о различии в конформациикак полипептидного остова, так и в ориентации боковых цепей между мембрансвязанной конформацией иформами, существующими в растворах.
Синхронные исследования флуресценциии проводимости в черных липидных мембранах [31] и в липосомах [32] показывают, что проводящая форма грамицидина являетсядимером. В исследованиях с одиночными каналами (при соотношении грамицидин/липид около 1:10000), регистрацияоткрывания и закрывания канала соотносится с равновесием мономер-димер (Рис.3)
Грамицидин так же образует комплексыс такиими детергентами как лизолецитин [33], и додецилсульфат натрия [34]. Исследования таких комплексомметодом электронной микроскопии (метод замораживания-скалывания)свидетельствуют о наличии мультиламелярной фазы детергента, в то время как сдругими белками и пептидами эти детергенты формируют типичную мицелярную фазу,более того данные 15Р и 2Н ЯМР, а так же дифракции ренгеновскихлучей при малом угле демонстрируют, что амфифильные группы молекул детергентаимеют бислой-подобную организацию. Этот пример – хорошая демонстрация влиянияграмицидина на организацию окружающих его молекул липида [35]
Так как детергент в комплексе сграмицидином оразует мембраноподобные структуры, можно предположить, чтотрехмерная структура грамицидина в данной системе такая же, как и в бислойныхмембранах, хотя другие небольшие пептиды часто имеют различную структуру вмицеллах и в липидных бислоях.
Мембрансвязанная форма грамицидинапредставляет собой спиральный димер, что было подтвержденно различнымихимическими и физическими методами. Данные ЯМР-спектроскопии с использованием 13Си 19F меченныхграмицидинов встроенных в липосомы показали наличие структуры в которой N-конец молекулы расположен посерединебислоя, а С-конец ориентирован наружу [25, 26, 27 ]. ЯМР в твердом теле(ориентированные мультиламелярные бислои ) обнаружил такую же структуру [36]. Изучение проводимости аналогов грамицидинав черных липидных мембранах покзали что модифицированные по С-концу аналогиспособны образовывать активные каналы только при добавлении их с двух сторонмембраны и не образуют их при добавлении с одной стороны мембраны. Так какзаряженные молекулы не могут переходить с одной стороны мембраны на другую –это явилось еще одним подтверждением того, что мембрансвязанная форма являетсяспиральным димером N-конец к N-концу
В спиральном димере N-конец к N-концу каждый мономер стабилизирован 12-ю внутимолекулярнымиводородными связями, а димер – 6-ю межмолекулярными водородными связями, вобразованиии которых принимают участие N-концевые формильные группы. Предложенно, что открывание изакрывание канала связанно с ассоциацией и диссоциацией ( то есть с образованиеми разрывом межмолекулярных водородных связей) такого ддимера [37] (РИС).
Рисунок 3.
Схематическое изображениеинактивации грамицидинового канала путем диссоциации димера голова к голове(структура Урри – Арсеньева).
Изучения аналогов грамицидинапоказали, что N-коцевая формильная группа оказываетсильное влияние на стабильность димера [38]. При ее замещении на более объемную ацетильную [39], сукцинильную [40] или при отсутствии вообще времяжизни канала уменьшается.Исследования методомКД-спектроскопии показали сильные конформационные различия между нативнымграмицидином и его аналогами, что, возможно является причиной дестабилизации канала [41].
Дальнейшие исследования с помощью13С- и 15N-меченных аналогов в ориентированныхмультиламелярных бислоях показали возможность существования праозакрученнойконформации канала [24].
Наиболее детальнаяструктурная конформация грамицидина была определенна методом двумерного ЯМР вкомплексе грамицидина с додецилсульфатом натрия (Арсеньев и сотр. 1985 г.). Даннаяструктура представляет собой спиральный димер, в котором каждая составляющаяспираль имеет 6,3 остатка на виток (b6,3-спиральныйдимер)(Рис.4.) А Б
Рисунок 4.
СРК Изображение правозакрученногоспирального димера грамицидина с 6,3 остатка на виток (PDB Code: 1GRM). A – вид сверху; Б – вид сбоку. Две молекулы грамицидина вдимере показанны разными цветами. Водороды скрыты.
. Дальнейшие исследованияпоказали что одна пара остатков Trp (9Trp и 15Trp ) могут находиться в стэкинг взаимодействиях [41]. Более того, теоретические расчетыпоказали, что наиболее энергетически выгодной структурой в мембране являетсяименно b6,3-спиральный димер, в котором остаткитриптофана образуют кластеры на границе раздела фазы липид-вода, и их азоты индoльных групп способнывзаимодействовать с полярными головками липидов и с молекулами воды. Вдвухспиральной конформации остатки триптофана расположенны равномерно повнеешней поверхности спирали и только два из них (в отличие от четырех в b6,3спиральном димере) могутвзаимодействовать с молекулами липидов или водой. Таким образом, двухспиральнаяконформация энергетически дестабилизиированна в мембране по отношению кспиральному димеру [41] (рис.5).
А Б В
Рисунок 5 Положениебоковых радикалов остатков триптофана в различных конформерах грамицидина. Видсбоку.
Боковые радикалы триптофанов выделенны синим цветом. А– β6,3-спиральный димер (Структура Урри-Арсеньева, наблюдаемаяв мембранах); Б – ββ5,6-двухспиральный димер (СтруктураВитча, наблюдаемая в органических растворителях); С – β7,2-двухспиральныйдимер (структура комплекса грамицидина с ионом цезия в органическихрастворителях и кристаллах)
Спектроскопическиеисследования грамицидина в различных мембранах показали, что соотношениеспиральных и двухспиральных димеров является функцией степени ненасыщенностилипидов, образующих мембрану. При увеличении доли ненасыщенных липидовувеличивается доля двухспиральной конформации. Эти результаты говорят о том,что боковые цепи триптофанов могут взаимодействовать с С=С связями [42]. Модельные исследования в кобинациис экспериметами по изучению липид –пептидных взаимодействий так же подтверждают важность этих аминокислот длястабилизации канальной структуры и оказывают влияние на организацию окружающихграмицидин липидов [ 17]
В результате (в 90%случаев) грамицидин образуе активный трансмембранный канал одной единственнойструктуры, являющейся b6,3-спиральнымдимером. Эта структура аналогична модели предложенной ранее Урри [12].
2.5.Влияние связывания ионов наконформацию грамицидина
Грамицидин способен транспортироватьодновалентные катионы через фосфолипидные мембраны [43].Его разная селективность по отношению к различнымпредставителям группы щелочных металов определяется как размером конкретногоиона, так и значением его энергии гидратации. Относительные константы афинностис натрием, калием, рубидием, цезием и талием были исследованны с помощью методарегистрации одиночных каналов [44],изучения аналогов грамицидина [45], равновесногодиализа [46],ЯМР [47], проводимости воды [48] и показали, что константа связыванияталия на порядок меньше чем цезия и на два порядка меньше чем натрия.Дальнейшие исследования показали, что с каналом одновременно могут связыватьсядва иона, причем константа связывания первого катиона больше чем второго [49], что видимо, связано сэлектростатическим отталкиванием.
Двухвалентные катионы блокируют проведениеодновалентных [39]и нетранспортируются грамицидиновым каналом. Последние исследования [49]показали, что частично дегидратированный двухвалентный катион связыватся сграмицидином с большей энтальпией чем одновалентный. Таоке сильное взаимодействие являетсяследствием низкой подвижности двухвалентных катионов в грамицидиновом канале.
Связывание анионов с грамицидиновымканалом не было продемонстрированно, хотя существуют некоторые доказательстваих проводимости и влияния на транспорт катионов [44].
Взаимодеиствие грамицидина содновалентными катионами оказывает слабое влияние (или вовсе не влияет) наформу его спектра КД [50],и, таким образом, на конформацию грамицидина.
Комплексы грамицидина с лизолецитиномтак же связывают катионы, они были использованны для определения константсвязывания [51] и локализации сайтов связывания. Вданной системе наблюдается изменение формы спектра КД при связывании катионов (в отличие от комплекса сдодецилсульфатом натрия, где такой эффект отсутствует), что свидетельствует обизменении конформации при таком взаимодействии [52].
В органических растворителяхнаблюдается сильное изменение структуры грамицидина при связывании с катионом,что демонстрируется изменением как формы, так и амплитуды спектра КД.
При исследовании связывания цезия сграмицидином в растворе наблюдается постепенное изменение формы спектра КД, чтосвидетельствет о плавном переходе из формы свободного грамицидина вион-связанною. Эти данные были использованны для определения константсвязывания цезия, которые составили К1=170 М-1 – дляпервого (более крепкого )сайта, и К2=20 М-1 – для второго(более слабого ) сайта связывания. Константа связывания для лития, определеннаятем же методом имеет величину на порядок меньшую, чем таковая для цезия [28]. Константа связывания для натриябыла определенны методом 23Na ЯМР[53] и составила 4 М-1.Константы связывания других ионов не были определенны, в связи с их низкойаффинностью, что делает такие изимерения довольно сложными.
В растворе хлороформ-метанол в присутствиитиоцианата цезия грамицидин (по данным двумерной ЯМР-спектроскопии)представляет собой правозакрученную антипараллельную двойную спираль с 7,2остатка на виток (b7,2-спиральныйдимер) и сдвигом в 1,5 остатка, что свидетельствует о том, что 1Val не участвует в образовании водородныхсвязей [54](рис.6). Кристаллическиеструктуры грамицидина дают дополнительную информацию о его трехмерной структуреи, более того, возможность формирования кристаллов в отсутствии и в присутствииионов позволяют изучить их влияние. Обе ионсвязанная и ионсвободнаякристаллические структуры грамицидина являются левозакрученнымиантипараллельными двойными спиралями и отличаются от форм в растворе значениямиуглов f и y, направлением образования водородных связей и регулярностьюукладки полипептидного остова. Ионсвободная кристаллическая форма длиннее (31Ǻ) и уже (внутренняя полость довольно узкая и в некоторых местах неспособна связывать ион) чем кристаллическая форма с тиоцианатом цезия (26Ǻ в длину, 4,9 Ǻ – внутренний диаметр поры, в которой помещается ионцезия) [17].
А Б
.Рисунок 6.
СРК Изображение правозакрученного антипараллельногодвухспирального димера грамицидина с 7,2 остатка на виток (ββ7,2-двухспиральный димер) (PDBCode: 1AV2) в компелексе с цезием. А – вид сверху и ион цезия; Б – вид сбоку.Две молекулы грамицидина в димере показанны разными цветами (красный и синий).
Конформация полипептидного остова вион-связанной форме грамицидина более упорядоченна, хотя и имеются некоторыевариации углов f и y в районах прилегающих к сайтамсвязывания катионов, а водородные связи направленны почти параллельно осиспрали [55]. Это говорит о том что даннаяспираль с большей вероятностью имее 6,4 остатка на виток, чем 7,2 .
Сравнение ион-свободных иион-связанных форм грамицидина показало, что при связывании происходитпереупаковка и адаптация трехмерной структуры под конкретный катион. Такаяперестройка возможна при реорганизации водородных связей. Так же наблюдаетсялокальное расширение спирали в местах связывания иона и реориентациякарбонильных групп пептидного остова, участвующих в связывании ионов [17].
2.6.Локализация сайтов связываниякатионов в различных конформациях грамицидина
Катион связывающие сайты вдвухцепочечных структурах могут быть определенны непосредственно из ихкристаллических структур в комплексе с хлоридом цезия [56]. Внутри поры находятся два иона цезия симметричнорасположенных на растоянии ~7,2 Ǻ от конца спирали. Сайты связываниясформированны карбонильными группами полипептидного остова, которые, связываяион ориентируются к оси спирали под углом ~40º. Угловое перераспределениекарбонильных групп увеличивает дистанции между группами, образующими водородныесвязи, и таким образом изменяются значения углов f и ψ. Карбонильные группы на противоположныхсторонах поры, пренадлежащие остаткам 11Trp и 14Leu, являются ближайшими к связанному катиону. В такихкристаллах помимо двух ионов цезия в комплексе с грамицидином так же находятсяеще и три иона хлора, два из которых расположенны на противоположных концахспирали, а третий — в её центральной части. Ионы хлора отделены от цезиямолекулами растворителя на растояние ~10 Ǻ. Наличие связанных ионов хлорадовольно необычно, так как грамицидин не транспортирует анионы, а теоретическиерасчеты [57] показывают, что энергетический барьерсвязывания аниона значительно больше чем катиона (что делает вход в канал дляаниона менее выгодным). Присутствие аниона внутри поры может быть вызвановысокой концентрацией соли в кристаллах и ионы хлора взаимодействуют с сайтамисвязывания подобно тому как это делают молекулы растворителя. В кристаллах стиоцианатом цезия позиция иона цезия отличается от таковой в кристаллах схлоридом цезия [55]. Исследованияпоказали, что в этих кристаллах сайты связывания находятся ближе к концамспирали.
Наблюдение различных сайтовсвязывания катионов в кристаллах могут моделировать отдельные стадии транспортакатиона через грамицидиновый канал.
Потенциальные взаимодействия катионовс грамицидиновым каналом были изученны с помощью расчетов теоретических энергийи молекулярно-динамических симуляций [58], и показали важность С-концевой этаноламиновой группы дляэнергетического профиля канала, а точенее, для локализации энергетическогоминимума и динамики колебаний карбонильных групп полипептидного остова итрансмембранного транспорта катионов [59].
Замещение С-концевойэтаноламиновой группы не влияет на свойства проводимости, она возможно играетроль в стабилизации некоторых конформаций грамицидиновой молекулы. При входе вканал катион постепенно обменивает свою гидратную оболочку на карбонильныегруппы полипептидного остова грамицидина, этаноламин (а точнее егогидроксильная группа) играет роль своеобразного посредника при таком переходе изабирает часть молекул воды гидратированного иона на себя, облегчая такимобразом его вход в канал. [60].
Энергетические профили спирального идвухспирального димеров отличаются не очень сильно, за исключением величиныэнергетического барьера при входе в канал, и за счет этого двухспиральныеканалы могут иметь меньшую проводимость чем односпиральные [17].2.7.Взаимоотношения между конформационнымисостояниями грамицидина и проводящими формами
Грамицидин формирует характерныеканалы при исследованиях в черных липидных мембранах. Проводимость одиночныхканалов и их время жизни зависит не только от природы липида, формирующегобислой, но и от присутствующих в среде ионов. Проводимость и среднее времяжизни грамицидновых каналов находятся в довольно узком диапазоне. В мембранахсформированных из глицерол-моноолеата [43] или из дифитаноилфосфатидилхолина [61] в присутствии 0,1 М NaCl средняя проводимость равна ~5пикосименс (pS), а время жизни — ~0,5 секунд. Приболее высоких концентрациях соли проводимость увеличивается, а в более толстыхмембранах, полученных при использовании различных растворителей, время жизниканала уменьшается при неизменной проводимости [43]. Симметрия расчитанного энергетического профиля говорит отом, что основная проводящая форма канала представляет собой структуру сцентральной симметрией. Соотнося эти данные с остальными результатами можносказать что основной проводящей структурой является спиральный димер N-конец к N-концу, хотя и нельзя полностью отрицать возможностьсуществования активного канала антипараллельной двухцепочечной спиральнойструктуры, что было подтвержденно экспериментально [17]. В некоторыхэкспериментах при различных пропорциях липидов, используемых для формированиябислоя были обнаруженны очень долгоживущие каналы ( время жизни >100 сек.),которые были представленны в соотношении 5-10% по отношению к основной форме. Гибридные аналоги грамицидина, неспособные формировать димер N-конецк N-концу, но способные образовыватьдвойные спирали так же обнаруживали такие же долго живущие каналы [32]. Более того кросс-сшитые аналоги(С-конец к N-концу), так же не способныеобразовывать димер N-конец к N-концу образовывали долгоживущиеканалы в соотношении 80% к основной форме [62].
Помимо основной и долгоживущей формканалов были обнаруженны еще и “мини” каналы сменьшей средней проводимостьюи временем жизни, формирующиеся в различных пропорциях по отношению к основнойформе в зависимости от условий образования бислоя [63,64]. Данные каналы предположительноимеют такую же структуру что и основная форма (спиральный димер N-конец к N-концу),но отличаются от нее другой ориентацией карбонильных групп полипептидногоостова в сайтах связывания катионов [65].
Изучения синтетических аналоговграмицидина помогают определить молекулярную основу свойств природногограмицидинового канала. Одним из важных наблюдений является корреляция свойствспецифической структуры с функцией. Хорошим примером такой корреляции является возможность образования гибридных каналов [66], представляющих собой димеры в которыходин мономер представлен каким-либо аналогом, а второй – другим аналогом или женативным грамицидином.
Одна доминирующая проводящая формасуществует в бислоиных мембранах, которая является спиральным димером N-конец к N-концу (головак голове). Кроме того существуют другие проводящие формы, найденные в различныхпропорциях в зависимости от условий эксперимента. Некоторые из них возможноимеют конформацию двойной спирали.2.8.Встраивание в мембрану и стабильность
В исследованиях по проводимостиграмицидин может быть добавлен к сформированной мембране в качествеконцентрированного спиртового раствора. При встраивании в липосомы грамицидинможет быть добавленн таким же образом ( то есть добавление концентрированногоспиртового раствора к приготовленным липосомам) [33] или же совместным растворением с липидом передформированием липосом [26]. Переходграмицидина в активную проводящую форму обычно сопроваждается нагреванием илиозвучиванием [67].
Легкость всраивания грамицидиназависит от типа используемого липида и от соотношения липид/грамицидин [23]. В общем липиды с более выскойтемпературой фазового перехода должны нагреваться более сильно для лучшеговстраиваия грамицидина. Более того, в образцах, где приходится более 20 молекуллипида на молекулу грамицидина нагревания до 30°С достаточно для встраиванияграмицидина, а образци имеющие менее 10 молекул липида на молекулу грамицидинанеобходимо нагревать до 65°С в течение 48 часов для такого же встраивания [17].
Некоторые исследования показывают,что при низких соотношениях грамицидин/липид легкость встраивания зависит оттого в каком растворителе до этого находился грамицидин (так называемая историярастворения) [68]. Если липид-грамицидиновый комплексперед образованием липосом был растворен в трифторэтаноле активный каналобразуется немедленно вместе с формированием бислоя, если же использовалсяраствор в смеси хлороформ-метанол, то для встраивания необходимо сильноенагревание. Такая зависимомть исчезает при более высоких соотношенияхграмицидин-липид, и не наблюдается никакого эффекта по свойствам проводимости.Это говорит о том, что взаимодействия с липидом играют важную роль встабилизации активной проводящей структуры а фазовое состояние важно для процессавстраивания. Также природа комплексов грамициди-липид была изученна с помощьюметода ЯМР [69], которые показали, что при низкомсоотношении грамицидин – липид липид образует гексагональную фазу, а небислой. Это так же может быть причиной трудности встраивания грамицидина вданных условиях. С помощью спектров КД был охарактеризован процесс встраиванияграмицидина в липид: до начала встраивания в предварительно приготовленныелипосомы, грамицидин присутствует в виде двойной спирали в присутствии ионов [67]. При нагревании грамицидин переходитв одиночную спираль и встраивается в бислой. В промежуточные времена этогопроцесса спектр представляет собой линейную комбинацию спектров этих двухструктур. Такие же процессы наблюдаются и в отсутствии иона. Одна из точекзрения на этот процесс заключается в том, что расплетание двойной спиралипроисходит до тех пор, пока N-конец c другим N-концом и такая структура будетпочти эквивалентна спиральному димеру [17]. Такой процесс требует разрыва всех 28 водородных связей иявляется очень энергоемким, а затем снова их образования. Разница энергий междудвух- и односпиральной конформациями не очень велика, так как они имеют почтиодинаковое количество водородных связей. В общем, можно сказать, что детали данного процесса до концане ясны.
Возможно двухспиральная конформацияимеет некоторую стабильность в бислое, но когда грамицидин становитсяориентирован таким образом, что способен сформировать одиночную спираль, этаконформация становится предпочтительной, и, таким образом можно предположить,что спиральная конформация явлвется результатом специфического взаимодействия иориентации грамицидина и липида. Теоретические [70] и экспериметальные [71] данные исследований с использованием липидов, вкоторых кислород карбонильной группы замещен на водород ( имитируя такимобразом простую эфирную связь) показали, что одиночная спираль грамицидинадестабилизированна в этих условиях. Таким образом взаимодействия междукарбонильными группами липидов и определенными регионами молекулы грамицидинанеобходимы для формирования канальой структуры (одиночной спирали).
2.9.Инженерия грамицидинового канала
Грамицидин в 90% случаев образует трансмембранный каналодной структуры, такая функциональная и химическая простота делает его уникальноймоделью для изучения мембраноактивных пептидов и использования для пониманияпринципов пространственной организации и функционирования мембранных белков вобщем и ионных каналов в частности.
Различныееденичные аминокислотные замены могут быть произведенны в грамиицидине безсильного эффекта на структуру и функцию канала [72], что позволяет проводитьэксперименты по выяснению влияния конкретных аминокислотных остатков насвойства грамицидинового канала. Так же можноизучать влияние непротеиногенных(не кодируемых генетически) аминокислот [73].Более того некоторые изменения впервичной последовательности грамицидина дают каналы с качественно новымифункциями или конформациями[41].
Было показанно, что, изменяя первичную последовательностьграмицидина, можно сдвигать конформационноеравновесие в мембране, получая активные каналы, образованные приемущественнодвухспиральными димерами. Так же, модификация первичной последовательностисильно влияет на электрофизиологические характеристики грамицидинового канала идает возможность варьировать время жизни и проводимость канала[41].
Дальнейшие исследования различныханалогов грамицидина с измененной аминокислотной последовательностью открыливозможность получать потенциалзависимые грамицидиновые каналы. Существет двавозможных пути получения каналов с такими свойствами. Первое: образованиеассиметричных каналов (гетеродимеров), что влияет на энергетический профильтрансмембранного движения иона, делая его ассимметричным. Такая ассимметрияувеличивается при изменении первичной последовательности от центра канала к еговходу (то есть от N- к C-концу молекулы грамицидина.
Вторым способом полученияпотенциалзависимого поведения грамицидинового канала является введение в егопоследовательность сенсора напряжения, только в данном случае эти сенсоры имеютнамного меньшие размеры (одна аминокислота) чем в “больших” ионныхканалах, а принцип их действия остается неизменным.
Вышеописанные исследования говорят содной стороны о важности практически всех аминокислот, входящих впоследовательность грамицидина (а не только остатков триптофана), и, с другойстороны открывают новые возможности для моделирования структуры и функцииканала [41].2.11.Общее применение в качестве модельной системыДанные последних исследованийметодами дифракции ренгеновских лучей, ЯМР-, КД- и ИК – спектроскопии, а так жекомпьютерное моделирование и исследование химически модифицированных аналоговпозволяют детально понять природу структуры грамицидинового канала и егоконформационных переходов. Результатом использования такого широкого набораметодов является возможность по-новому взглянуть на конформационныевзамиоотношения в молекуле грамицидина и сравнить их с существующими моделями.Оглядываясь назад, мы видим чтовсе предложенные изначально конформационные модели являются корректными,отображают общие принципы упаковки полипептидного остова и не противоречатэкспериментальным данным, что очень важно для применения в исследовании другихмолекул.
В качестве модели грамицидин былиспользован для изучения липид – белковых взаимодействий [77], ионной проводимости [78], влияния трехмерной структуры нафункцию [17]. Но применять эту модель нужно оченьосторожно, из-за маленьих размеров, молекула грамицидина очень подвижна ипринмает множество конформаций в зависимости от внешних условий, в то время как“большие” ионные каналы, состоящие из длинных полипептидных цепей, аиногда и нескольких субъедениц, имеют довольно стабильную пространственнуюструктуру в условиях, близких к физиологическим (или же имеют небольшиевариации прис охранении общего способа укладки полипептидной цепи). Такимобразом, определяя еденичную трехмерную структуру “большого” канала мы с большой вероятностью можем сказать что эта конформация и представляет изсебя активный канал.
Сначала было предположенно, чтоструктурно функциональные отношения в грамицидине более просты для понимания, всвязи с тем, что ионсвязывающие сайты образованны только карбонильными группамиполипептидного остова, а не боковыми радикалами аминокислот, и былопредположенно, что на связывание ионя влияет только конформация полипептидногоостова. При более детальном исследованиии аналогов с измененной первичнойпоследовательностью выяснилось, что даже находясь на внешней стороне канала идалеко от сайтов связывания боковые радикалы аминокислот оказывают сильноевлияние на свойства проводимости и конформационной стабильности, что так жедолжно быть учтено в модельных исследованиях.2.12.Практическое применение грамицидина
Помимобольшого фундаментального значения молекулы грамицидина для пониманияструктурно-функциональных взаимоотношений в мембраноактивных белках, он так женашел и практическое приминение, опять же основанно на каналобразующем свойствеэтой молекулы. Приведем лишь два самых ярких примера такого использования.Превое: был разработан метод пэтч калмп регистрации с использованиемграмицидин перфорированных мембран, что дает возможность изучать анионпроводящие каналы (такие как GABA-и глициновыерецепторы) в условиях, не затрагивющих их функции [81]. Второе использование, основанноена современных достижениях органического синтезаотносится к разряду молекулярных нанотехноогий и является создание на основеграмицидинового канала мембрансопряженного биосенсора [82]. Принципдействя такой наномашины основан на преобладающей структуре грамицидина вмембране (b6,3-спиральный димер). Основным элементом такогобиосенсора является прикрепленная к электроду мембрана, в которую встроенграмицидин. Один из мономеров грамицидина закрепленн в нижнем слое мембраны и,таким образом является неподвижным. Вторая часть грамицидинового каналамодифицирована “связывающим агентом” (антиген, антитело, лиганд) исвободно диффундирует в верхнем слое мембраны. При добавлении анализируемогораствора, и наличии в нем веществ имеющих сродство к “связывающему агенту”, происходит спецефическое взаимодействие, приводящеек инактивации грамицидинового канала. Таим образом, детекция наличия каких-либовеществ в анализируемогом растворе происходит путем измерения проводимостиграмицидинового канала. Помимо большого практического применения данная системаможет иметь большое фундаментальное значение при понимании принципов передачисигнала через мембрану (как это происходит например в рецепторах сопряженных с G-белками).
/>
Рисунок7. Схемамембрансвязанного биосенсора на основе грамицидинового канала. А –грамицидиновый канал открыт, спецефическое связывание отсутствует. В –произошло спецефическое связывание произошло, грамицидиновый канал закрылся.Мономеры грамицидинового канала показаны красным цветом; зеленым цветомпоказана спейсерная группа; коричневым цветом показан “связывающий агент”; синим цветом показан аналит, спецефическивзаимодействующий со “связывающим агентом”.Список литературы
1. Hotchkiss R.D., Dubos R.J.1940, Journal of Biological Chemistry: v.132 p.791
2. Sarges R., Witkop B.,1964Journal of American Chemical Society, vol.86, p.1862
3. Sarges R., Witkop B., 1965Journal of American Chemical Society, vol 87, p.2011
4. Sarges R., Witkop B., 1965Journal of American Chemical Society, vol 87, p.2027
5. Sarges R., Witkop B, 1965Biochemistry, vol. 4, p.2491
6. Weinshtein S., Wallace B.,et.al., 1980 Journal of Molecular Biology, vol 143, p1
7. Gross E., Witkop B., 1965Biochemistry, vol. 4, p:2495
8. Koeppe R.E. II, PaczkovskiJ.A., Whaley W.L., 1985 Biochemistry, vol. 24, p.:2822
9. Gause G.F., BrazhnikovaM.G., 1944 Lancet, vol. 247, p.:715
10. Veatch W.R., Fossel E.T., Boult E.R.,1974 Biochemistry, vol. 13, p.5249
11. Urry D.W., 1971 Proc Natl AcadSci U S A, vol.68, p672
12. Ramachandran G.N., Chandrasekaran R, 1972Ind. J. Biochem.Biophys., vol.9, p.1
13. Urry D.W., 1971 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A,vol 68, p.1907
14. RamakrishnanG.N., Ramachandran G.N., 1965 Biophys. J., v.5, p909
15. Fossel E.T, Veatch W.R,Ovchinnikov Y.A., Buolt E.R., 1974 Biochemistry, vol.13, p5264
16. Veatch W.R, Boult E.R.,1974 Biochemistry, vol.13, p5257
17. Wallace B.A., 1990 Annu.Rev.Biophys. Biophys Chem., vol.19, p.127
18. Bystrov V.F., ArsenievA.S., 1988. Tetrahedron, vol.44, p.925
19. Langs D.A., 1988 Science,vol.241, p.188
20. Сычев С.В., Невская Н.А.,Иорданов С., Мирошников А.И., Иванов В.Т. 1980, Биоорганическая химия, том 9,стр.121
21. Hawkes G.E., Lian L.-Y.,Randall E.W. 1987, Eur. J. Biochem., vol.166, p. 437
22. Isbell B.E., Rice-Evans C,et.al. 1972 FEBS Lett., vol 25, p. 192
23. Killian J.A., Prasad K.U.,et.al. 1988 Biochemistry, vol.27, p.4848
24. Wallace B.A., Veatch W.R., Boult E.R. 1981 Biochemistry, vol. 20., p. 5754
25. Weinstein S., Durkin J.T.,et.al. 1985 Biochemistry, vol.24, p. 4374
26. Weinstein S., WallaceB.A., Boult E.R, et.al 1979 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A,vol. 76, p.4230
27. Weinstein S., Wallace B.A,et.al 1980 J. Mol.Biol., vol.143, p.1
28. Wallace B.A. 1986 Biophys.J., vol. 49, p.295
29. Kleinfeld A.M., 1987 Curr.Top. Membr. Tansp., vol.29, p.1
30. Scarlata S.F., 1988Biophys.J., vol.54, p.1149
31. Veatch W.R, Mathies R.,et.al. 1975 J.Mol.Biol., vol.99, p.75
32. Veatch W.R, Styer L. 1977J.Mol.Biol, vol.113, p.89
33. Masotti L., Spisni A.,et.al. 1980 Cell Biopys., vol.2, p.241
34. Bamberg E., Lauger P.,1977 J.Membr. Biol., vol.35, p.351
35. Killian J.A., de KruijffB., et.al. 1983 Biochim. Biophys. Acta., vol.78, p. 141
36. Cornell B., Separovic F.,et.al. 1988 Biophys.J., vol. 53, p. 67
37. Arseniev A. S OvchinnikovYu, A.., Barsukov, I.L.Bystrov, V. F,.Lomize, A. L. 1985 FEBSLett., vol.186, p.168
38. Durkin J.T., AndersenO.S., et.al. 1986 Biophys.J., vol.49, p.118
39. Szabo G., Urry D. W. 1979 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A,vol.68., p.672
40. BradleyR.J., Urry D.W., et.al. 1978 Science, vol.200, p.435
41. Koeppe R.E. & AndersenO.S. 1996 Annu. Rev. Biophys.Biomol. Struct., vol. 25, p.231-258
42. Sychev, S.V.Barsukov, L. I.Ivanov, V. T. 1993 Eur Biophys J, vol.22, p. 279-88.The double pipi 5.6 helix of gramicidin A predominates in unsaturated lipid membranes
43. Hladky S.B., Haydon D.A., 1972Biochim. Biophys. Acta., vol.274, p.294
44. Eisenman G., Sandblom J.P., Neher E.1978 Biophys.J., vol.22, p.307
45. Mazet J.-L., Andersen O.S.,KoeppeR.E. 1984 Biophys.J., vol.45, p. 263
46. Veatch W. R., Durkin J.T. 1980J.Mol.Biol., vol.14, p.411
47. Hinton J.F., Whaley W.L., et.al. 1986Biophys.J., vol.50, p. 539
48. Dani. J.A., Levitt D.G. 1981Biophys.J., vol.35, p.501
49. Hinton J.F., Fernandez J.Q., et.al.1989 Biophys.J., vol.55, p.327
50. Wallace B.A. 1983 Biopolymers,vol.22, p. 397
51. Hinton J.F., Koeppe R.E. II, et.al.1986 Biophys.J., vol.49, p.571
52. Urry D.W., Trapane T.L., et.al. 1983Science, vol.221, p.1064
53. Cornelis A., Laszlo P., 1989Biochemistry, vol.18, p.2004
54. Arseniev A.S., Barsukov I.L., BystrovV.F. 1985 FEBS Lett., vol.180, p.33
55. Koeppe R.E.II, Berg J.M., et.al. 1979Nature, vol.279, p.723
56. Wallace B.A., Ravikumar K. 1988Science, vol.241, p.182
57. Sung S. –S., Jordan P. C. 198Biophys.J., vol.54, p. 519
58. Lee W.K., Jordan P. C.1984Biophys.J., vol.46, p.805
59. Urry D.W., Alonso-Romanovsky S.,et.al. 1984 J.Membr.Biol., vol. 71, p.205
60. Trudelle Y., Daumas P., et.al. 1987FEBS Lett., vol.216, p.11
61. Barret Russel E.W., Weiss L.B.,et.al. 1986 Biophys.J., vol.49, p.673
62. Ovchinnikov Y.A., Ivanov V.T. 1983In Conformation in Biology, ed. R. Srinivasan, R.H. Sarma, p.155, New York:Academic
63. Busath D.D., Andersen O.S., KoeppeR.E.II., 1987 Biophys.J., vol.51, p.79
64. Busath D.D., Szabo G. 1981 Naturevol.294, p.371
65. Busath D.D., Szabo G. 1988Biophys.J., vol.53, p.689
66. Andersen O.S., Koeppe R.E., et.al.1987 In Transport through membranes, ed. K.Ygi, B.Pullman, p.295. Tokyo: Academic
67. Wallace B.A. 1985 Biophys.J., vol.45,p.114
68. LoGrasso P.V., Moll F.III, CrossT.A., 1988 Biophys.J., vol.54, p.259
69. Killian J.A., de Kruijff B., 1985Biochemistry vol.24, p.7881
70. Meulendijks G. Sonderkamp T., et.al.,1989 Biochim. Biopphys. Acta vol.979, p.321
71. Waalace B.A., Veatch W.R., Boult E.R.1981 Biochemistry vol.20, p.5754
72. Durkin J.T., Koeppe RE II, AndersenO.S. 1990 J.Mol.Biol. vol.211, p.221
73. Fonseca V., Daumas P., et.al. 1992Biochemistry vol.31, p.5340
74. Mukherjee P.K. & Paulus H. 1974 Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.74, no.2
75. .Sarcar. N et al., 1974 Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.74, no.4, pp.1478-1482,
76. Langs D.A. 1989 Biopolymersvol.28(1), p.259
77. Killian J.A., Taylor MJ, Koeppe DEII. 1992 Biochemistry vol.31, p.11283
78. Finkelstein A, Andersen OS. 1981.J.Membr. Biol. vol.59, p.155
79. Hodges RS, Merrifield RB, 1975 Anal.Biochem. vol.65, p.241
80. Paul BW, Ten Kortenaar, et.al. 1986Int. J.Pep. Pro. Res., vol.27, p.398
1.Овчинников Ю.А., Иванов В.Т, Шкроб А.М.; ''Мембрано-активные комплексоны",Москва, «Наука», 1974, стр.40-47, 174.
2. N.Sarcar et al., Proc. Natl. Acad.Sci USA, vol.74, no.4, pp.1478-1482, 1974
3. P.K. Mukherjee & H. PaulusProc. Natl. Acad. Sci USA, vol.74, no.2, 1974
4. Hladky & Haydon, Nature,vol.255, pp. 451-453, 1970
5. W.R Veatch & E.R. Boult,Biochemistry vol.13 no. 26, 1974, pp.5257-5261
6. D.W. Urry, Proc. Natl. Acad. SciUSA, vol.68 pp.672-676
7. Ramachandran & Chandrasekaran,Ind. J. Biochem. Biophys., vol.9, pp1-11, 1972
8. E. Fossel, W. R. Veatch, Y. A.Ovchinnikov, E. Boult, Biochemistry vol.13 no. 26,
1974, pp 5264-5275
9. Шепель Е.Н. и др., Биоорг. химия, 2, 581-593 (1976)
10. Cычев С.В., Фонина Л. А., ИвановВ.Т., Биоорг. химия, 8, 1080-1088 (1984)
11. Ivanov V.T., «Fromstructure towards the molecular mechanism of action», in
Peptides 1982
12. D.W. Urry, in «Spectroscopyof Biological Molecules», 487-510
13. Wallace B.A. & Boult E.R.(1979), Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.75, 1775-1779
14. Wallace B.A., W.R. Veatch &E.R.Boult (1981), Biochemistry,20: 5754-5760.
15. Сычев С.В., Невская, ИордановС.Т. и др. (1980), Биоорг. химия, 9: 121-151
16. Arseniev A.S., Bystrov V.F.,V.T.Ivanov & Yu.A. Ovchinnikov (1984), FEBS
(Fed. Eur. Biochem. Soc.) Lett.165:51-56.
17. Arseniev A.S., Barsukov I.L.,Bystrov V.F., A.L.Lomize & Yu.A. Ovchinnikov
(1985), FEBS (Fed. Eur. Biochem.Soc.) Lett.186: 168-174.
18. Urry D.W., J.T. Walker, &T.L. Trapane (1980), J. Membr. Biol. 69: 225-231.
19. Arseniev A.S., Barsukov I.L.& Bystrov V.F (1985) FEBS (Fed. Eur. Biochem
. Soc.) Lett. 180: 33-39.
20. S.V.Sychev, S.V. Sukhanov, L.I.Barsukov & V.T. Ivanov (1996), J. Pep. Sci.
2:141-156.
21. N. Mobashery, C. Nielsen, O.S.Andersen (1997), FEBS (Fed. Eur. Biochem.
Soc.) Lett. 412: 15-20.
22. Cornell B.A.,& M.A. Keniry(1983), Biochim. Biophys. Acta. 732: 705-710.
23. P. Daumas, D. Benamar &other., (1991) Int. J. Peptide Protein Res. 38: 218-228.
24. Wallace B.A, (1986), Biophys. J.49: 295-306.
25. V. Krchnak, J. Vagner, P. Safar& M. Lebl (1988), Collection Czechoslovak
Chem. Commun. 53: 142-148.
26. K. U. Prasad, S.Alonso-Romanovski & other, (1986) Biochemstry, 25: 456-463
27. K. Bauer, R. Roskoski, H.Kleinkauf & F. Lipmann (1972) Biochemistry, 11: 3266-3270.
28. C.G Fields, G.B. Fields &other, (1989) Int. J. Peptide Protein Res., 33: 298-303.