Ассоциация между человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA) и туберкулезом

Ассоциация между человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA) и туберкулезом Резюме Легочный туберкулез развивается как сложная комбинация между экологическими факторами и генетической восприимчивостью. В данном исследовании ассоциация между человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA) и туберкулезом была изучена в нескольких популяциях, но результаты оказались противоречивыми. Предполагаемая оценка II класса HLA проводилась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью

набора специфических праймеров и олигонуклеотидов в мексиканской популяции. Исследование проводилось Клинической службой Туберкулеза и Отделом иммунологии, Национальном институте респираторных болезней, Мексика. В качестве обследуемых были четыре группы пациентов: 95 здоровых; 50 неиммуносупрессированных пациентов с туберкулезом легких;

15 ВИЧ-инфицированных пациентов с туберкулезом; 37 ВИЧ-инфицированных пациентов в асимптотической стадии. В результате исследования были получены данные: частоты аллелей DQA1*101, DQB1*501, DRB1*1501 были значительно увеличены у неиммунодепрессированных пациентов с туберкулезом легких по сравнению со здоровыми пациентами. В отличие от этого, частоты аллелей

DQB1*402, DRB1*4 и DRB1*8 были значительно уменьшены у пациентов с туберкулезом. Также, значительное увеличение частоты аллеля DRB1*1101 было обнаружено у ВИЧ-положительных пациентов. Генетическое влияние, связанное с системой HLA играет важную роль в развитии туберкулеза легких. Хотя эта восприимчивость, возможно, не играет у роли у пациентов, с серьезными нарушениями иммунной

системы (такими, как ВИЧ-инфекция). Введение Туберкулез остается одной из важнейших мировых проблем. По приблизительным оценкам примерно треть населения заражена Mycobacterium tuberculosis. Около 8 миллионов случаев активного туберкулеза и 2,9 миллионов смертей регистрируется каждый год. Болезнь приблизилась к эпидемическим пропорциям с ухудшением окружающей среды, социоэкономических условий, таких как перенаселение, неправильное питание и расположение сточных вод.

Также, в последнее время эпидемическая картина ассоциирована с ВИЧ. Однако, исследования, выполненные на людях и лабораторных животных, доказывают, что в дополнение к окружающей среде генетическая предрасположенность может играть роль в прогрессировании заболевания. Недавно открыто, что изменения генетической информации для ассоциированного с врожденным иммунитетом протеина I макрофага связаны с восприимчивостью к туберкулезу у жителей

Западной Африки. Главный комплекс гистосовместимости человека играет важную роль в формировании иммунного ответа. Возможная ассоциация между антигенами HLA и туберкулезом исследована на многих популяциях, но результаты оказались противоречивыми. Несоответствия могут быть связаны с методологическими проблемами, потому что исследования были сделаны главным образом серологическими методами, которые могут давать перекрестные реакции и иметь низкую специфичность.

Кроме того, серологические методы дают ошибочные значения HLA класса II более чем в 25% случаев по сравнению с более точным методом ДНК-типирования. Также восприимчивость к туберкулезу находится под многофакторным генетическим контролем, включающим и контроль за системой HLA. HLA регион находится на коротком плече шестой хромосомы и делится на три региона: HLA класса I, кодирующий HLA-A, -B, -

C антигены; HLA класса II, кодирующий HLA-DR, DQ и DP антигены; HLA класса III, кодирующий второй и четвертый компоненты комплемента С2 и С4, фактор B, туморонекротический фактор ? и белок теплового шока 70 и 21-гидроксилазу. Гены классов I и II кодируют поверхностные клеточные гликопротеины, функция которых презентовать антигенные пептиды для CD8+ CD4+ клеток, играющих фундаментальную роль в гомеостазе.

Система HLA - самая полиморфная биологическая система, и популяционные различия представлены частотами специфических аллелей и подтипов, а также их комбинацией. HLA-система рестриктирует Т-клетки и тесно связана с генами иммунного ответа и супрессии. Ответ антиген-специфических Т-клеток связан с презентацией процессированного пептида в ассоциации с поверхностными гликопротеинами МНС класса I и II. В частности, белки, кодированные генами

МНС класса II, функционируют как рестриктирующий элемент, который опосредует узнавание антигена регуляторными Т-клетками, и тесно связаны с иммунным распознаванием и ответом. Цель данного исследования - сравнить частоту генов HLA класса II у взрослых с туберкулезом легких и здоровых людей метом полимеразной цепной реакции. Также были исследованы ВИЧ-положительные пациенты с туберкулезом или без него.

Материалы и методы. Исследование популяции В исследование были включены пятьдесят случайно отобранных неиммунодепрессированных пациентов с туберкулезом легких. Пациенты, не связанные родственными связями, являлись коренными жителями Мехико, были госпитализированы в Национальный институт респираторных болезней во время исследования. Во всех случаях диагноз туберкулеза был поставлен на основе световой микроскопии, с помощью которой

обнаруживалось присутствие кислотоустойчивых бацилл в мокроте, а также культуральным высевом M. tuberculosis. Чтобы признать пациентов неиммунодепрессированными, они были оценены по следующим критериям: отсутствие ВИЧ-инфекции; нормальное количество лимфоцитов и Т-клеток в периферической крови; подтвержденный легочной туберкулез. Пациенты с диабетом, силикозом, циррозом печени или другими системными заболеваниями, а также пациенты,

злоупотребляющие алкоголем, не были включены в исследование. Пациенты со СПИДом исследовались независимо. В качестве контроля исследовались 95 не связанных родством здоровых пациентов, отобранные по этническим и социоэкономическим особенностям; 37 ВИЧ-инфицированных пациентов без туберкулеза и других инфекций (2-я стадия ВИЧ-инфекции по классификации Центра по контролю и предотвращению инфекций

CDC). Дополнительно исследовались 15 ВИЧ-инфицированных пациентов с туберкулезом (4-я стадия ВИЧ-инфекции по CDC) и 20 здоровых не ВИЧ-инфицированных гомосексуальных пациентов. Диагноз ВИЧ ставился по методу ИФА и подтверждался с помощью метода иммуноблотинга. Пациенты и контроль родились в Мексике и имеют три поколения предков, коренных жителей Мексики. Исследование было одобрено Научным и Этическим комитетом, было получено согласие всех обследуемых.

Проект исследования Геномная ДНК из цельной крови, содержащей этилендиаминтетраацетат была извлечена с помощью стандартных методик. ДНК амплификация и специфическая идентификация аллелей HLA-DQ осуществлялись с помощью метода ПЦР с набором специфических праймеров (Bio-Sinthesis; Dallas, TX). Идентификация HLA-DRB1 проводилась с помощью специфических последовательностей олигонуклеотидов методом обратной гибридизации dot blot (Amplicor kit;

Hoffman La Roche; Базель, Швейцария). DR1, DR2, DR4, DRB1-DR52, DRB3 и DRB5 амплификация проводилась методом ПЦР с использованием Taq-полимеразы (Promega; Madison, WI). Праймеры, используемые для амплификации: DRBAMP-B для региона 3' из экзона 2, и DRBAMP-1, DRBAMP-2,

DRBAMP-3 DRBAMP-4, DRBAMP-5 и DRBAMP-52 для региона 5' из экзона 2. Они были синтезированы на автоматическом синтезаторе (DNA-SM; Beckman; Пало-Альто, Калифорния). Статистический анализ После того, как были определены частоты фенотипов для каждых аллелей в исследуемой и контрольной популяциях, различия были установлены и подтверждены с помощью критерия ?2.

Риск развития туберкулеза был проверен с помощью компьютерной программы (STATA и Windows 95; Microsoft; Редмонд, WA). Результаты Исследование включало 50 неиммунодепрессированных пациентов (средний возраст 39,1±13,0 лет). В контроль были включены 95 здоровых человек (35,4±10,1 лет); 37 ВИЧ-инфицированных пациентов, не зараженных туберкулезом и не имеющих новообразований; 15 иммунодепрессированных пациентов (ВИЧ-инфицированных) с туберкулезом (31,1±5,7 лет);

20 здоровых не ВИЧ-инфицированных гомосексуалистов (26,3±8,5 лет). Поздняя группа контроля не имела существенных отличий в фенотипе HLA с группой несвязанных здоровых людей. С помощью метода ПЦР и гибридизации были показаны различия между частотами аллелей неиммунодепрессированных пациентов с активным туберкулезом и пациентами из других групп.

Различия частот в каждой группе показаны в таблице 1. Среди 50 неиммунодепрессированных пациентов с туберкулезом было 30 пациентов с аллелем DQA1*0101, 22 с аллелем DQB1*0501 и 24 с аллелем DRB1*1501 (по сравнению с контрольной группой из 95 человек: 20, 12 и 9 человек соответственно). ВИЧ-инфицированные пациенты показали высокие частоты аллеля DRB1*1101. С другой стороны три аллеля ассоциированы с протекцией против туберкулеза:

DQB1*0402, DRB1*4 и DRB1*8 (таблица 1). Обсуждение результатов Молекулярное типирование оказалось полезным для определения ассоциации между системой HLA и туберкулезом. Этот метод оказался более удобным, чем серологический. В данном исследовании метод ПЦР в сочетании со специфическими олигонуклеотидными пробами показали ассоциацию между генами DQA1*0101, DQB1*0501, DRB1*1501 и восприимчивостью к туберкулезу.

Эти маркеры восприимчивости определялись независимо друг от друга, поэтому речь не идет о гаплотипе. Интересно, что ВИЧ-инфицированные пациенты с туберкулезом не имели данных генов. Предполагается, что приобретение серьезного иммунодепрессивного статуса предрасполагает к развитию туберкулеза, независимо от генетической составляющей. Однако размер этой группы был слишком мал, чтобы делать какие-либо заключения, и необходимы дальнейшие

исследования больших групп ВИЧ-инфицированных пациентов с туберкулезом. Вдобавок частоты некоторых аллелей HLA DR и DQ локусов у здорового контроля были значительно увеличены по сравнению с частотами HLA у пациентов с туберкулезом, что можно связать с тем, что эти аллели могут вносить вклад в устойчивость к данному инфекционному заболеванию. Недавние исследования пациентов с туберкулезом из

Индии показали ассоциацию с геном HLA DRB1*2, но большая часть данных аллелей DRB1*1501 и DRB1*1502 была одновременно и у пациентов и у контроля. Распределение генов HLA DQ в данном исследовании изучено не было. Позднее была найдена ассоциация между HLA DQB1*503 и клиническим туберкулезом у пациентов из Камбоджи. В этом исследовании было также отмечено небольшое увеличение частоты встречаемости аллеля

HLA-DRB1*2. HLA-DQ молекулы уникальны среди II класса молекул МНС, потому что обе и цепочки очень полиморфны; более того, многие вариабельные аминокислотные остатки расположены в спиральной части антиген-связывающего кармана. С помощью ПЦР анализа было выявлено два гена DQ аллеля, связанных с туберкулезом. Также риском к развитию легочных и экстрапульмонарных заболеваний являются воздействия окружающей среды

и первоначальный результат воздействия микобактерий на организм. Хотя факторы, которые влияют на развитие болезни и ее клиническое проявление, еще недостаточно изучены. В частности, при воздействии микобактерий на организм не всегда происходит заражение; а среди зараженных прогрессирование в активное заболевание, причины болезни и ее длительность сильно варьируют. Наиболее вероятно, действует сложный комплекс генетических и экологических факторов.

Хорошо известно, что плохие окружающие условия и некоторые идентифицированные факторы риска: диабет, силикоз, ВИЧ, злоупотребление алкоголем и другие все они играют роль в предрасположенности к туберкулезу. В данном исследовании семейный статус и правильное питание, известные кофакторы в развитии туберкулеза, были одинаковыми в контрольной группе и группе пациентов с туберкулезом; пациенты с некоторыми из вышеупомянутых нарушений были исключены из группы больных с туберкулезом, а

ВИЧ-инфицированные пациенты с туберкулезом анализировались отдельно. Генетические факторы хозяина могут оказывать влияние и на восприимчивость к инфекционному агенту, и на патогенез заболевания, хотя получить свидетельство генетической предрасположенности к туберкулезу довольно сложно. Недавно были получены данные, что вариации в протеине I человеческих макрофагов, который ассоциирован с врожденным иммунитетом, связаны с измененной чувствительностью

к мокрото-положительным туберкулезом у населения Западной Африки. Результаты исследований, как и данные Goldfeld и др показывают, что некоторые аллели системы HLA II класса, особенно локуса DQ1, могут принимать участие в возрастании чувствительности и в восприимчивости к туберкулезу. HLA-рестриктированная презентация процессированных антигенов альвеолярными макрофагами может быть изменена у пациентов, экспрессирующих данные специфические аллели

HLA. Также было обнаружено возрастание частоты DRB1*1101 аллеля у ВИЧ-инфицированных пациентов. При использовании стандартного метода микроцитотоксичности на мононуклеарных клетках несколько лет назад была получена высокая частота встречаемости гена HLA-DR5 у ВИЧ-инфицированных пациентов. Однако неясно, предрасполагал ли ген HLA-DR5 к развитию ВИЧ-инфекции или к некоторым последующим осложнениям, таким как постоянная генерализованная

лимфоаденопатия или саркома Капоши. После того, как было доказано, что частота DRB1*1101 была значительно увеличена на II стадии ВИЧ-инфекции по CDC, результаты исследования доказывали: генетическая восприимчивость, связанная с этим маркером, предрасполагает пациентов к ВИЧ-инфекции, а не к вышеописанным осложнениям. В доказательство данной точки зрения было исследовано 20 мужчин-гомосексуалистов без

ВИЧ-инфекции по HLA II класса. Частота аллеля HLA DRB1*1101 в этой группе не отличается от контрольной группы. Однако эти данные нужно использовать осторожно, так как несмотря на многие исследования относительно типа HLA и иммунного ответа на ВИЧ-I, вопрос о том, влияет ли HLA на восприимчивость к данной вирусной инфекции остается нерешенным. Проведенные исследования доказывают, что три аллеля

HLA вовлечены в восприимчивость к туберкулезу в мексиканской популяции. Механизмы, лежащие в основе неустойчивости или восприимчивости к инфекционным заболеваниям, связанные с HLA II класса, а также различия между DR и DQ локусами до сих пор до конца не изучены. Хотя результаты исследования подтверждают, что генетическое влияние системы HLA может играть роль в развитии туберкулеза, но эта предполагаемая чувствительность не играет роли

у пациентов с серьезными нарушениями иммунитета, как во время ВИЧ-инфекции. Также было предположено, что ген DR5 может быть ассоциирован с развитием ВИЧ-инфекции. Таблица 1. Частоты генов HLA в четырех группах пациентов Allele Specificity Healthy Subject PTB Patients, % HIV-Positive Patients, % AIDS Patients with PTB, %

DR1 10.52 20.00 5.40 6.66 DR3 12.63 20.00 16.21 13.33 DR4 46.31 12.00 13.51 33.33 DR7 22.10 18.00 16.21 33.33 DR8 33.68 4.00 18.91 6.66 DR9 1.05 8.00 5.40 6.66 DR10 1.05 4.00 0.00 6.66 DR11 (DRB1*1101) 11.57 24.00 45.94! 33.33 (DRB1*1102) 3.15 4.00 2.70 6.66 (DRB1*1103) 1.05 2.00 0.00 0.00 (DRB1*1104) 3.15 0.00 2.70 0.00 DR12 (DRB1*1201) 2.10 16.00 8.10 0.00 (DRB1*1202) 0.00 2.00 5.40 0.00

(DRB1*1203) 0.00 0.00 2.70 0.00 DR13 {DRB1*1301) 4.21 2.00 2.70 0.00 (DRB1*1302) 4.21 4.00 0.00 0.00 (DRB1*1305) 2.10 0.00 0.00 0.00 DR14 22.10 2.00 0.00 0.00 DR15 (DRB1*1501) 9.47 48.00! 24.32 33.33 (DRB 1*1502) 3.15 0.00 0.00 6.66 (DRB1*1503) 1.05 0.00 2.70 0.00 DR16 (DRB1*1601) 2.10 6.00 27.02 6.66 (DRB1*1602) 3.15 4.00 0.00 6.66 DQA (DQA1*0101) 22.10 62.00! 40.54 35.71 (DQA1*0102) 17.89 10.00 13.51 28.71 (DQAl*020l) 22.10 12.00 18.91 14.28

(DQA1*0301) 48.42 30.00 13.51 35.71 (DQA1*0401) 32.63 12.00 18.91 7.14 (DQA1*0501) 46.31 34.00 35.13 28.57 (DQA1*0502) 4,21 0.00 0.00 0.00 DQB (DQBl*0201) 33.68 26.00 16.21 35.71 (DQB1*0301) 35.78 24.00 13.51 28.57 (DQB1*0302) 43.15 32.00 32.48 35.71 (DQB1*0304) 1.05 0.00 0.00 0.00 (DQB1*0402) 33.68 6.00 8.10 0.00 (DQB1*0501) 12.68 44.00! 21.62 31.71 (DQB1*0502) 5.26 6.00 5.40 7.14 (DQB1*0503) 9.47 4.00 5.40 14.28 (DQB1*0504) 1.05 0.00 0.00 0.00 (DQB1*0602) 15.78 14.00 8.10 0.00 (DQB1*0603) 5.26 0.00 10.21 7.14 (DQB1*0604) 2.10 8.00 8.10 7.14

(DQB1*0609) 1.05 0.00 0.00 0.00