ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.
Раздел 1. Дифференциальная активность генов, выбор адекватных биологических моделей.
Молекулярная идентификация гена, нарушение работы которого приводит к развитию наследственного заболевания, создает предпосылки для дальнейшего более подробного анализа генетических и биохимических основ патогенеза и разработки на этой базе наиболее эффективных методов лечения. Начальные этапы решения поставленной задачи включают в себя иссследование механизмов тканеспецифической экспрессии и регуляции активности генов в нормальных клетках, оценку клинического выражения различных типов нарушений гена, выявление первичного биохимического дефекта, а также сопоставление молекулярных основ работы генов в нормальных и мутантных клетках.Естественно, что в различных тканях организма экспрессируется не все, а лишь определенные группы генов. Исключение составляют лишь так называемые гены домашнего хозяйства (house-keeping genes), генопродукты которых обеспечивают жизнедеятельность всех типов клеток (см.Главу II). По весьма ориентировочным оценкам в тканях млекопитающих и человека работают в среднем около 2-3% всех генов, в клетках печени - основной биохимической лаборатории организма - около 5%, тогда как в клетках мозга - примерно 9-10% (Корочкин,1977). Это означает, что в различных соматических клетках эукариот транскрибируется от 5 до 20 тысяч генов (Льюин,1987). Значительная часть контролируемых ими белков необходима для обеспечения жизнедеятельности самих клеток. В процессе онтогенеза и клеточной дифференцировки в разных тканях организма происходит избирательная активация многих других специфических генов, что, в конечном итоге, обусловливает значительные межклеточные различия в наборе белков и в скорости их синтеза. Контроль генной активности осуществляется за счет дифференциальной транскрипции и процессинга РНК в клеточных ядрах, различной стабильности мРНК в цитоплазме, избирательной трансляции мРНК. Дифференциальная экспрессия генов, конечным результатом которой является синтез функционально активного белка, предполагает не только адекватную регуляцию генной активности, но и полноценность всех последующих этапов,включая сам белковый продукт, его устойчивость, способность к посттрансляционным модификациям, правильную локализации и корректное взаимодействие с другими компонентами клетки. Решающее значение для успешного анализа всего этого сложного комплекса имеет выбор адекватных биологических моделей, поиск и целенаправленное конструирование которых представляет вполне самостоятельную научную задачу.Наиболее доступными модельными системами для анализа экспрессии генов in vitro являются культуры клеток. Для клонирования, генноинженерного манипулирования, направленного введения сайт специфических мутаций, получения большого количества клонированных последовательностей ДНК, специфических молекул мРНК, а также белкового продукта гена обычно используют генетически хорошо изученные прокариотические системы (Хеймс, Хиггинс, 1987). Для исследования процессов трансляции, посттрансляционных модификаций белка, его внутриклеточной локализации и функционирования чаще используют культуры клеток эукариот и, в частности, специфические культуры клеток человека. Особая роль в изучении начальных этапов развития патологического процесса, обусловленного присутствием генных мутаций, а также в разработке терапевтических методов, включая генноинженерную коррекцию метаболического дефекта, принадлежит культурам мутантных клеток. Это могут быть первичные или перевиваемые культуры клеток, полученные из специфических тканей больного человека, либо выделенные из тканей линейных животных, служащих генетической моделью наследственного заболевания.Идентификация гомологичных генов у экспериментальных животных во многих случаях значительно облегчает и ускоряют исследование функциональной активности нормальных и мутантных генов человека. Большая роль в изучении молекулярных механизмов развития патологических процессов in vivo принадлежит генетическим линиям животных. Это могут быть линии, полученные в результате отбора спонтанно возникших или индуцированных мутаций, а также искусственно сконструированные модели на базе трансгенных животных, в геном которых введен чужеродный ген или фрагмент ДНК. Рассмотрим основные экспериментальные подходы, используемые для анализа экспрессии генов.
Раздел 2. Анализ регуляторных элементов гена, изоляция и исследование мРНК, искусственные транскрипционные системы.
Регуляция экспрессии генов в цепочке ДНК - РНК – белок может осуществляться на различных молекулярных уровнях. В соответствии с этим исследования дифференциальной активности генов в разных типах клеток и тканей включают оценку работы контролирующих элементов генов, анализ молекул РНК на всех этапах от появления первичного транскрипта до зрелой мРНК и изучение соответствующего белкового продукта, включая его процессинг (созревание), внутриклеточную локализацию, тканеспецифическое распределение .Исследования регуляторных цис-действующих элементов генома, таких как промоторы, инхансеры, участки ДНК, подавляющие транскрипцию, являются составной частью анализа молекулярной структуры любого гена. Идентификацию таких элементов проводят с использованием разнообразных современных методов молекулярной генетики. В частности, последовательности ДНК в5'- фланкирующей области гена, ответственные за тканеспецифическую индукцию генной активности, могут быть локализованы путем исследования транскрипции в различных линиях клеток при введении в них генов с искусственными делециями этих участков ДНК. Для оценки активности идентифицированных регуляторных последовательностей их сливают с чужеродными хорошо изученными неиндуцибельными клонированными генами, так называемыми "репортерами". Такие генетические конструкции в составе векторных последовательностей вводят в культивируемые клетки эукариот и наблюдают за изменением уровня экспрессии. В качестве "репортера" часто использую ген хлорамфеникол-ацетил-трансферазы (CAT-ген), который в естественных условиях экспрессируется только в клетках прокариот.Сам фермент (CAT) обладает высокой активностью, что позволяет не только легко обнаруживать ее минимальные количества в клетке, но и с высокой точностью проводить количественную оценку. Для повышения чувствительности анализ экспрессии химерных генов часто проводят в культуре фибробластов почек африканской зеленой мартышки (COS-клетки). Эти клетки модифицированы таким образом, что в них после трансфекции происходит амплификация копий сконструированных определенным образом эписом (внехромосомных генетических конструкций ( см. Главу X), что ведет к значительному усилению сигналов экспрессии введенных генов (трансгенов). Перенос генов (трансгеноз) может быть осуществлен и на уровне целого организма, в частности, зиготы. Полученные в результате подобных манипуляций трансгенные животные могут быть также использованы в качестве модельной системы для анализа механизмов тканеспецифической активации генов in vivo.Матричная РНК является наиболее удобным обьектом для изучения регуляции транскрипции генов и посттранскрипционных модификаций РНК. Тотальная клеточная РНК сотоит на 90 - 95% из рибосомальных и транспортных РНК, тогда как доля транслируемых или poly(A)+ РНК не превышает 5% (Льюин, 1987). При этом, концентрация РНК-транскриптов индивидуальных генов среди всех молекул мРНК, в среднем, колеблется в пределах от 0.01% до 0.001% (Гайцхоки, 1978). Поэтому для обнаружения индивидуальных типов мРНК должны использоваться высоко-чувствительные методы. Обычным методом идентификации мРНК на тканевом и клеточном уровнях является гибридизация in situ РНК- или ДНК-зондов с молекулами мРНК на гистологических срезах (Хаффнер, Уиллисон,1990). В качестве ДНК-зондов используют клонированные последовательности кДНК и синтетические олигонуклеотиды. После инкубации меченых зондов на цитологических препаратах с последующей тщательной отмывкой несвязавшихся молекул положение комплементарных РНК-последовательностей в клетках определяют радиоавтографическими, либо в случае биотинового мечения - иммуногистохимическими методами. Оптимальные условия гибридизации дают возможность не только выявлять присутствие специфических мРНК, но и определить их внутриклеточную локализацию (Манк, 1990; Хаффнер,Уиллисон, 1990; Boehringer, Mannual, 1994).Анализ индивидуальных РНК включает изоляцию из тканей пула неповрежденных биологически активных мРНК и идентификацию среди них специфических молекул путем использования различных вариантов ДНК-РНК гибридизации. Для генов с высоким уровнем транскрипции могут быть пригодны дот или слот блоты. Когда источником РНК служат клетки, которые не могут быть получены в большом количестве, используют цитоп-лазматический дот-блот. При этом целые клетки лизируют, и фиксируют непосредственно на тех мембранах, на которых проводят гибридизацию. Значительно большой чувствительностью обладает, так называемый Northern blot (нозерн-блот) - гиб-ридизация с ДНК- зондами на фильтрах предварительно сконцентрированных и фракционированных путем электрофореза молекул РНК (Sambrook et al., 1987). Электрофорез проводят в агарозе с добавлением формальдегида, денатурирующего РНК. В этих условиях скорость продвижения молекул РНК через гель находится в логарифмической зависимости от длины последовательности, что позволяет точно определить размер РНК транскрипта. Основная масса РНК на геле представлена в виде двух доминирующих бэндов, соответствующих двум типам рибосо-мальной РНК - 28S и 18S. Все молекулы мРНК сконцентрированы в плохо различимой, слабо окрашенной области геля, в которой отдельные типы мРНК могут быть выявлены только путем гибридизации с соответствующими ДНК-зондами. Нозерн-блот имеет то преимущество, что при электрофорезе могут быть разделены молекулы РНК, дающие перекрестную гибридизацию с ДНК-зондом.Кроме того, характер электрофоретического разделения позволяет визуально оценить качество изолированной РНК. При очень низких концентрациях специфических мРНК или в тех случаях,когда ДНК-зонды дают перекрестную гибридизацию с другими компонентами (не мРНК), проводят обогащение изолированной тотальной РНК транслируемыми мРНК путем отбора на колонках фракций, содержащих поли-A "хвосты". Для этого выделенную РНК пропускают через короткую колонку с пришитыми поли-T олигонуклеотидными последовательностями и высокой концентра-цией солей в буферном растворе, так чтобы молекулы мРНК, содержащие поли -A "хвосты", задерживались на колонке. При снижении концентрации солей в буфере происходит расплавление A-T дуплексов и высвобождение молекул мРНК. Таким способом доля этих молекул в определенных солевых фракциях может быть увеличена на два порядка. Конечно, поли-A селекция применима в тех случаях, когда имеется достаточно большое количество тотальной РНК. Другим методом для исследования структуры РНК транскриптов является S1-анализ. В этом случае ДНК-РНК гибридизацию ведут в растворе, куда и добавляют S1 нуклеазу для переваривания однонитевых несвязавшихся молекул как ДНК, так и РНК, после чего проводят электрофоретическую очистку дуплексов, которые затем элюируют из геля для последующего анализа (Sambrook et al.,1989). Этот метод очень удобен для анализа стартовых сайтов и 3'-концов генов, для определения направления транскрипции и картирования интронов.Уровень мРНК в клетке определяется несколькими кинетическими параметрами - скоростью первичного синтеза, эффек-тивностью процессинга РНК-транскриптов и периодом полураспада зрелых молекул мРНК. Последний параметр определяют по динамике исчезновения мРНК после добавления к клеткам актиномицина D, специфическим образом супрессирующего транскрипцию.
Исследование механизмов транскрипции и процессинга первичных РНК-транскриптов проводят in vitro с использованием искусственным образом сконструированных транскрипционных систем (Manley et al., 1986; Dignam et al., 1983;Gutierrez-Hartmann et al., 1987; Хэймс,Хиггинс, 1987). Для этого могут быть выбраны два различных подхода. В первом случае изолируют ядра и в качестве транскрипционной матрицы используют неповрежденный хроматин. Синтез РНК проводят с добавлением всех необходимых реагентов и, в частности, три-фосфатов, в один из которых (обычно в урацил) вводят радиоактивную метку. При этом вновь синтезированные молекулы РНК оказываются мечеными. Выбор специфических молекул РНК проводят путем ДНК-РНК гибридизации, однако, в отличие от ранее описанных методов анализа мРНК, используют немеченые к ДНК-зонды, предварительно нанесенные на фильтры. Большим достоинством этой транскрипционной системы является ее максимальная приближенность к естественным процессам. При втором подходе транскрипция ведется с клонированных фрагментов ДНК, а ядерные экстракты служат источником ферментов и регуляторных белков.
Раздел 3. Анализ трансляции, ДНК-экспрессионные системы.
Традиционные методы анализа регуляции трансляции и посттрансляционных модификаций белков основаны на использовании модельных систем, представляющих собой цитоплазматические свободные от мРНК безядерные экстракты клеток, содер-жащие рибосомальный аппарат, транспортные РНК, набор аминокислот и ферментов, необходимых для трансляции и процессинга белков (Хэймс, Хиггинс, 1987; Клеменс, 1987 ). После добавления к такой системе специфической мРНК происходит синтез соответствующей полипептидной цепи in vitro. При введении меченых аминокислот в систему вновь синтезированные белки после электрофоретической очистки могут быть идентифицированы путем радиоавтографии либо иммунологическими методами,при наличии соответствующих антител (Клеменс, 1987). Однако,для значительного числа моногенных наследственных заболеваний первичный биохимический дефект неизвестен, а следовательно, не идентифицированы и мРНК транскрипты. Биохимическое изучение многих белков затруднено из-за их минорного содержания и отсутствия эффективных методов выделения и очистки. Последнее обстоятельство в значительной мере относится к нерасворимым белкам, ассоциированным с мембранными структурами клеток.ДНК-экспрессионные системы, то есть клеточные культуры, синтезирующие чужеродные белки, являются очень мощным средством анализа структуры, функции и синтеза белков (Sambrook et al., 1989). Такие системы конструируют на основе экспрессионных векторов, содержащих в своем составе сильные промоторы и регуляторные последовательности, обеспечивающие высокий, но в то же время регулируемый уровень экспрессии. Кодирующие последовательности чужеродных генов инсертируют (вставляют) с помощью соответствующих генно-инженерных приемов в область действия этих промоторов. Конечно, такие системы должны содержать и трансляционные сигналы,в частности, сайты связывания рибосом, обеспечивающие работу рибосомального аппарата клеток хозяина. В некоторых случаях экспрессионные векторы вводят в мутантные по протеазным генам клеточные культуры, с тем чтобы предотвратить деградацию чужеродных белков в клетках.
Существует три типа экспрессионных систем - бактериальные, сконструированные обычно на основе E.coli, дрожжевые и экспрессионные культуры клеток млекопитающих. Каждая из этих систем имеет свои преимущества и недостатки. Бактериальные системы наиболее удобны для клонирования, обладают высоким уровнем экспрессии (до 1-2 грамм белка на литр культуры) и их используют, обычно, для производства большого количества чистого белка, необходимого для получения антител или для фармацевтических целей. Удобны также эти системы для введения изменений в различные районы полипептидной цепи путем сайт-направленного мутагенеза в нуклеотидной последовательности чужеродной ДНК. Получение и исследование таких "мутантных" белков очень важно для оценки функциональной значимости различных участков белка.Уровень экспрессии чужеродных белков в дрожжевых клетках вдвое, а в клетках млекопитающих в десятки раз ниже, чем в бактериальных. Однако, в бактериальных клетках отсутствуют ферментативные системы, обеспечивающие процессинг эукариотических белков. Поэтому эукариотические системы удобнее использовать для изучения посттрансляционных модификаций белка - гликозилирования, то есть присоединения к полипептидной цепи углеводных остатков; скручивания белка с образованием третичной структуры, часто, за счет возникновения дисульфидных связей; и N-концевых модификаций, стабилизирующих структуру белка. В ДНК-экспрессионных системах может быть синтезировано достаточно много белка, чтобы получить его в кристаллической форме и исследовать пространственную структуру и функциональное назначение отдельных доменов(Хэймс, Хиггинс, 1987).Использование экспрессионных библиотек для изоляции кодирующих последовательностей гена рассматривалось ранее . После секвенирования кДНК можно, исходя из генетического кода, прогрозировать аминокислотный состав белка и произвести компьюторный поиск в банке данных гомологичных последовательностей в составе белков с уже известной структурой и функциями. Выявление родственных белков, близких по своему полипептидному составу, значительно ускоряет и облег чает дальнейший молекулярный анализ функционирования исследуемого белка в клетке. Аминокислотная последовательность белка позволяет прогнозировать его третичную структуру, идентифицировать домены, оценивать функциональную значимость целого белка и отдельных его компонентов. Не менее важным практическим следствием этих данных является также возможность получения антител к строго специфичным участкам белка. Для этого могут быть использованы два подхода - биохимический и молекулярно-генетический. В первом случае для иммунизации используют искусственно синтезированные полипептиды,которые пришивают к белковой молекуле-носителю (гаптену).Размеры таких полипептидов, обычно, не превышают 30 аминокислот - они не могут быть очень большими из-за высокой стоимости и трудоемкости синтеза длинных молекул. При втором подходе экзонные участки гена инсертируют в экспрессионный вектор в область, кодирующиую селектируемый белок. В результате экспрессии такой конструкции получают слитый белок, в котором наряду с аминокислотной последовательностью селектируемого маркера содержится определенный фрагмент исследуемого белка. Эту химерную молекулу и используют для иммунизации животных и получения моновалентных или моноклональных антител. При наличии антител могут быть применены различные иммунологические подхооды для анализа тканеспецифического и внутриклеточного распределения белка, исследования его модификаций, а также для получения нативного белка в препаративных количествах.
Cледующим шагом на пути анализа молекулярных механизмов регуляции экспрессии гена является идентификация тех нарушений в структуре, локализации и активности молекул мРНК и белка, которые возникают вследствие генетических мутаций. Мы уже упоминали об огромном значении культур мутантных клеток для подобных исследований. Однако, многие патологические процессы, протекающие в организме больного, не могут быть исследованы in vitro. С другой стороны, возможности получения необходимого количества клеток и тканей пациента и испы-тания in vivo различных схем лечения значительно ограничены.Поэтому для многих наследственных болезней эффективность изучения основ патогенеза существенным образом зависит от наличия адекватных биологических моделей. Способы конструирования таких моделей подробно изложены в Главе YIII.