Проблемы экстракорпорального оплодотворения

ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ Показания к ЭКО
ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОГРАММЫ ЭКО И ПЭ Культуральные среды CO2-инкубатор Идентификация и оценка качества ооцитов Обработка спермы перед оплодотворением ооцитов in vitro Оплодотворение ооцитов in vitro
Оплодотворение – теоретические аспекты Оценка качества эмбрионов Стратегия переноса эмбрионов Техника переноса эмбрионов СТИМУЛЯЦИЯ СУПЕРОВУЛЯЦИИ В ПРОГРАММЕ ЭКО И ПЭ ОСНОВНЫЕ ПРОБЛЕМЫ, ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ЭКО И ПЭ ЗАКЛЮЧЕНИЕ ЛИТЕРАТУРА ВВЕДЕНИЕ Среди методов лечения бесплодия можно условно выделить те, что на­правлены на восстановление естественной фертильности супружеской пары и те, что используют технику искусственного оплодотворения. К первым относятся попытки лечения хронического воспалительного процесса в малом тазу, хирургического и нехирургического восстановления проходимости маточных труб, коррекция эндокринных расстройств и нару­шенного сперматогенеза. Ко вторым – внутриматочная инсеминация спер­мой мужа или донора, экстракорпоральное оплодотворение с последующим переносом эмбрионов в матку матери в различных его вариантах. До недавнего времени лечение трубного бесплодия исчерпывалось бесконечным повторением трудоемких для врача и утомительных для больных физиотерапевтических процедур и курсов гидротубаций в сочетании с проти­вовоспалительной терапией. Эффективность данного вида лечения в отноше­нии восстановления проходимости труб чрезвычайно низка, а последствия в виде перерастяжения ампулярных отделов труб и потери их функциональной способности достаточно серьезны, поскольку предопределяют бесперспектив­ность последующего хирургического лечения. Последнее также не оправдало ожиданий, возлагаемых на него специа­листами. Так было показано, что при непроходимости ампулярных отделов маточных труб, вызванной "внешними" факторами (спайками, например), час­тота наступления беременности после реконструктивно-пластических опера­ций довольно велика и составляет 20 - 70% (в зависимости от квалификации хирурга и степени выраженности спаечного процесса). При непроходимости же маточных труб в истмических отделах, связанной с внутренним адгезивным слипчивым процессом, частота наступления бере­менности даже после микрохирургических операций составляет всего 0 - 5%. В то же время эти операции, выполняемые путем чревосечения, достаточно травматичны и сопряжены с определенным риском для больной. Поэтому, в последние годы наблюдается тенденция к замене больших полостных опера­ций на малые, "лапароскопические", т.е. выполняемые во время оперативной лапароскопии. Наиболее распространенными операциями, выполняемыми во время лапароскопии, на сегодняшний день являются: рассечение спаек с целью вос­становления проходимости маточных труб, удаление небольших кист яични­ков и миоматозных узлов, прижигание очагов эндометриоза, коагуляция поликистозных яичников и даже удаление маточной трубы при внематочной бере­менности. Основным преимуществом оперативной лапароскопии перед большими полостными операциями является значительно меньший риск как в отношении здоровья больной, так и в отношении рецидива спаечного процесса, а также быстрота возвращения больной к активной жизни. Однако возможности оперативной лапароскопии ограничены. Выполнение больших реконструктивных операций возможно только во время чревосечения. Эффективность лечения бесплодия после таких операций весьма невелика. Женщинам с сопутствующими эндокринными нарушениями, которым предстоит лечение бесплодия путем пластической операции на маточных тру­бах, необходима предварительная гормональная коррекция, поскольку эффект подобной операции и последующего восстановительного лечения нестойкий, связан с риском повторного воспаления и рецидива непроходимости труб. В этой ситуации терять время на нормализацию гормональных нарушений по­сле операции нецелесообразно. Несколько слов следует сказать о противовоспалительном лечении. Как правило, трубно-перитонеальное бесплодие является следствием хронического воспалительного процесса в малом тазу, возникшего в резуль­тате банальной или специфической (гонорея, хламидиоз) инфекции, нередко как осложнение аборта. Однако противовоспалительное лечение не есть лечение бесплодия, но оно необходимо во всех случаях, когда женщине предстоят внутриматочные вмешательства, лечебные или диагностические: снимок матки и труб, лапароскопия с введением в матку красящего вещества, внутриматочная инсеминация, ЭКО и т.д. Во всех случаях предварительное противовоспалитель­ное лечение позволяет избежать обострения воспалительного процесса и уб­рать факторы, снижающие вероятность наступления беременности и выкиды­ша в том случае, когда она наступила. Недостаточная эффективность методов, направленных на восстановле­ние естественной фертильности человека в случаях трубного и трубно-перитонеального бесплодия, стимулировала развитие методов искусственного оплодотворения. Последние годы отмечены стремительным ростом как числа самих ме­тодов искусственного оплодотворения, так и объема их применения. Остановимся вкратце на возможностях и эффективности каждого из этих методов, а также на показаниях к их использованию. Внутриматочная инсеминация (ИСМ) производится в тех случаях, ко­гда женщина полностью здорова и трубы проходимы, а у мужа имеется сниже­ние оплодотворяющей способности спермы, однако показатели ее таковы, что после некоторых манипуляций она становится достаточной, чтобы оплодотво­рить яйцеклетку после введения непосредственно в матку. Кроме того, попытка ИСМ производится и при нормальных показателях спермы, если установлена несовместимость супружеской пары, связанная с отрицательным действием на сперматозоиды шеечной слизи. При этом де­лается расчет на то, что при ИСМ обходится "убийственный" для спермы фактор - шеечная слизь, так как сперматозоиды вводят прямо в полость матки. В тех случаях, когда сперма мужа совсем плоха или барьер несовмести­мости одолеть не удается, с согласия обоих супругов прибегают к оплодо­творению спермой донора - ИСД. Техника ИСМ и ИСД одинакова. В благоприятный для беременности день цикла, устанавливаемый по данным УЗИ, РТ, характеру шеечной слизи, в матку женщины вводят предва­рительно обработанную сперму. Иногда попытку производят 2 - 3 раза в те­чение цикла. Эффективность этой процедуры достаточно велика: при ИСМ она достигает 20 - 40%, при ИСД: 50 - 80% (максимальное число циклов, в которых целесообразно предпринимать попытки, - 4). Другой разновидностью искусственного оплодотворения является ГИФТ - перенос яйцеклеток вместе со сперматозоидами в маточные трубы. Суть его в следующем: у женщины берут одну или несколько яйцекле­ток, у мужа сперму, смешивают их и вводят в маточную трубу. Условием успеха этой процедуры является своевременность ее проведения, проходи­мость и полноценность маточных труб. То есть показания те же, что и при мужском бесплодии или несовместимости супругов. Иногда прибегают к дру­гому варианту искусственного оплодотворения - переносу эмбриона (зиго­ты) в маточную трубу, так называемую ЗИФТ. Считается, что при ЗИФТе вероятность наступления беременности существенно выше. ГИФТ и ЗИФТ могут быть выполнены как во время лапароскопии, так и под ультразвуковым контролем. В первом случае гаметы или зиготы вводят в трубу со стороны брюшной полости, во втором - через шейку матки. Как правило, ГИФТ и ЗИФТ совмещают с диагностической лапароскопией у женщин с неясной формой бесплодия и проводят однократно.
Врачи, практикующие эти виды лечения бесплодия, отмечают их высо­кую эффективность - до 30%. Однако в нашей стране ГИФТ и ЗИФТ практиче­ски не применяются. Абсолютное женское бесплодие - отсутствие или стойкая непроходи­мость маточных труб являются показанием к экстракорпоральному оплодо­творению с последующим переносом эмбрионов в матку матери (ЭКО).
ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ. ЭКО - истинная сенсация XX века в социальном, биологическом, религиозном и моральном плане. Успешно начатая программа до настоящего времени актив­но обсуждается с различных позиции. Большинство уче­ных рассматривают ее как блестящую возможность изу­чения процесса оплодотворения у человека с помощью современных методов исследования для создания фунда­ментальной теории этого удивительного и неожиданно широко распространившегося клинического экспе­римента. Исторически новое направление в лечении беспло­дия – экстракорпоральное оплодотворение яйцеклет­ки (ЭКО) возникло в 1978 г. в Англии. Вначале метод ЭКО и ПЭ применялся преимущественно в случаях бесплодия, обусловленного непроходимостью или от­сутствием у женщин маточных труб. В таких случаях метод предусматривает получение яйцеклеток из яич­ника женщины, оплодотворение их in vitro и перенос эмбриона в полость матки после нескольких его дроб­лений in vitro. Метод был разработан Р. Эдвардсом и П. Стептоу (Англия) и назван In vitro fertilization and embryo transfer (IVF&ET). В русскоязычном варианте название метода звучит следующим образом: экстра­корпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов в полость матки (ЭКО и ПЭ). В России этот метод впер­вые был внедрен в 1985 г. в НИИ акушерства и гине­кологии МЗ СССР под руководством Б. В. Леонова и В. И. Кулакова. Рождение первого ребенка произошло в 1986 г. в Центре охраны здоровья матери и ребенка МЗ СССР. Программа ЭКО, конечно, имеет длительную предысторию. Немецкий ученый К. Semn (1982) считает началом этой программы открытие Г. Фолом в 1877 г. феномена пенетрации мужской гаметы и яйцеклетку с последующим оплодотворением. Однако вряд ли подоб­ное открытие было бы возможно, если бы три столетия раньше Левенгук не открыл существования живых кле­ток. Вместе с тем открытие Г. Фола стимулировало первую попытку экстракорпорального оплодотворения яй­цеклеток крольчих и морских свинок S. L. Schenk (1878). Попытки экстракорпорального оплодотворения яйцеклет­ки человека начались с 1944 г. J. Rock, M. Melkin культивировали ооцит человека и произвели ЭКО, приведшее к разви­тию двухклеточного эмбриона. В наше время этот метод получил настолько широкое распространение, что давно уже переста­ли подсчитывать число детей, родившихся после ЭКО. Бур­ный прогресс метода обусловлен успехами фармакологии и эхоскопии, биохимии. Синтезированы агонисты рилизинг гормонов в 50-100 раз более активные, чем эндогенные люлиберины, получены высокоочищенные гонадотропные препараты, в том числе и обладающие изолированным ФСГ действием. Это позволило стимулировать в яичнике супер­овуляцию – развитие сразу нескольких фолликулов, содер­жащих яйцеклетку. Внедрены в практику эхоскопические приборы с высокой разрешающей способностью и оснащен­ные влагалищными датчиками и инструменты для забора яйцеклетки через свод влагалища под ультразвуковым кон­тролем. Все это облегчило проведение метода и привело к его распространению. Во многих странах Европы и Америки ЭКО относят к рутинным методам лечения бесплодия. Бурное обсуждение моральных, этических и юридических ас­пектов ЭКО отошло в прошлое. Допустимо и практикуется оплодотворение спермой донора, имплантация «чужого» эм­бриона, расширены возрастные границы ЭКО. Опубликова­ны случаи рождения детей после ЭКО у женщин в возрасте старше 50 лет. ЭКО и ПЭ достаточно сложны и требуют дорогостоящих оборудования, реактивов, препаратов и, главное, - специ­альных знаний. Все это привело к тому, что ЭКО и ТЭ являются обособленной областью гинекологической практи­ки и выполняются только специалистами. Для практического гинеколога необходимы знания: • о показаниях к ЭКО, • о методах стимуляции суперовуляции, • о лечении возможных ее осложнений.
Рис.1. Схема лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения: 1 - яичник со множеством фолликулов - результат воздействия препаратов; 2 - пункция яичников, получение яйцеклеток (в строго определенный момент); 3 - соединение яйце­клеток со специально подготовленными сперматозоидами; 4 - культивирование в спе­циальных условиях в течение 24 - 62 ч; 5 - образовавшийся 4-клеточный эмбрион; 6 - перенос эмбрионов в полость матки. Как видно из рис.1 метод состоит из следующих этапов: 1. Уточнение характера и причин бесплодия; 2. Назначение препаратов, стимулирующих рост нескольких фоллику­лов - индукция суперовуляции; 3. Оценка ответа яичников на применение указанных препаратов при помощи серии ультразвуковых и гормональных исследований - гор­мональный и ультразвуковой мониторинг. 4. Определение момента, когда следует произвести пункцию фоллику­лов (как можно ближе ко времени естественной овуляции), что дела­ется при помощи ультразвуковых исследований и определения кон­центрации гормонов в сыворотке крови или моче; 5. Пункция фолликулов, аспирация (отсасывание) их содержимого, из­влечение из него яйцеклеток, помещение их в специальную пита­тельную среду и условия; 6. Получение и подготовка сперматозоидов; 7. Соединение яйцеклеток и сперматозоидов (инсеминация яйцеклеток) в "пробирке" и помещение их в инкубатор на 24 - 42 часа; 8. Перенос эмбрионов в матку матери; 9. Назначение препаратов, поддерживающих имплантацию и развитие эмбрионов; 10. Диагностика беременности; 11. Ведение беременности и родов. Таким образом, ЭКО представляет собой сложный многоступенчатый процесс. Он требует назначения различных препаратов и многократной оценки состояния женщины в течение цикла, в котором производится попытка ЭКО. Успех ЭКО зависит от многих обстоятельств: реакции яичников женщи­ны на примененные препараты - чем больше получено яйцеклеток, тем выше шанс беременности; своевременности получения зрелых, способных к опло­дотворению яйцеклеток: техники выполнения пункции и переноса эмбрио­нов; качества спермы; условий культивирования гамет и эмбрионов и многих других факторов, включая психологический настрой бесплодной супружеской пары.
ПОКАЗАНИЯ К ЭКО Важный научно-практичесикий аспект программы ЭКО и ПЭ представляет изучение патогенеза бесплодия. Абсолютными показаниями являются трубное бес­плодие вследствие непроходимости или отсутствия маточ­ных труб. Относительные показания:
§ предшествовавшие оперативные вмешательства (пласти­ческие операции) на маточных трубах у женщины в возрасте старше 30 лет, если после операции прошло более года; § некоторые формы эндометриоза; § бесплодие неясного генеза; § иммунологическое бесплодие при постоянно высоком уровне антиспермальных антител.
Существуют генетические критерии отбора для ЭКО. Ме­тод не рекомендуется при гипоспадии, врожденных пороках сердца, шизофрении, аффективном психозе, при наличии в семье детей с аутосомно-рецессивными заболеваниями, риск повторного наследования которых достигает 25 %. Противо­показаниями являются доминантно наследуемые болезни. Большое внимание уделяется дальнейшему изучению патогенеза, профилактике и лечению синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ), представляющего собой серьезное осложнение, возникающее при проведении стимуляции суперовуляции. Важное значение в реализации программы ЭКО и ПЭ имеют исследования роли эндокринных нарушений, их профилактика и коррекция. В предварительном обследовании потенциальных пациентов программы ЭКО и ПЭ необходимо уделять большое внимание исследованию содержимого цервикального канала у женщины в целях диагностики инфекций, относящих­ся к так называемой группе TORCH-комплекса (трихомонады, краснуха, хламидии и др.). Должна осуществ­ляться не только их диагностика, но и лечение. Лишь пациенты, прошедшие соответствующую коррекцию, могут быть включены в программу ЭКО и ПЭ. Необходима также тщательная кольпоскопия для исключения новообразований шейки матки. За 2 – 3 мес. до ЭКО и ТЭ следует произвести тщательное обследование спермы, бактериологическое исследование и посев. Бесплодие у мужчин связано, как правило, с пере­несенными ими неспецифическими инфекционными заболеваниями (краснуха, корь), а также с неправиль­ным лечением ряда заболеваний, передаваемых поло­вым путем, а также венерических (например, гоно­рея). Причиной бесплодия может быть крипторхизм. Ряд вредных действий внешней среды, как бытового, так и промышленного происхождения, может являть­ся причиной нарушения сперматогенеза. ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОГРАММЫ ЭКО И ПЭ Эмбриологический этап программы ЭКО и ПЭ является одним из важнейших, поскольку оценка качества ооцитов, их оплодотворение и куль­тивирование in vitro до стадии преимплантационных эмбрионов во многом определяют ее успех. Ключевым моментом этого этапа программы являет­ся подбор адекватных культуральных сред и условий культивирования, приближающихся к естественной среде для преимплантационного развития. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СРЕДЫ Культуральная среда для ЭКО должна быть мак­симально приближена по всем параметрам к естест­венным жидкостям, в которых ооциты и эмбрионы человека находятся in vivo, т. е. маточных труб и мат­ки. После овуляции яйцеклетка попадает в маточную трубу (ампулярный отдел), где и происходит оплодо­творение. Затем зигота и впоследствии эмбрион пере­двигается по трубе в течение 4 - 5 дней, попадая в по­лость матки на стадии морулы. Практика показала, что многие среды, различаю­щиеся по составу, могут успешно имитировать есте­ственную среду для ооцитов и эмбрионов человека. Однако существует несколько основных харак­теристик, которым должны отвечать культуральные среды. Уровень рН Уровень рН среды обычно должен равняться 7,4, что соответствует рН крови. Экспериментально было по­казано, что такая кислотность оптимальна для опло­дотворения и преимплантационного развития эмбрио­нов человека. В качестве буферной системы обыч­но используется бикарбонатный буфер в присутствии 5% CO2 в атмосфере. Этот буфер был выбран главным образом потому, что он соответствует физиологиче­ской буферной системе крови, а парциальное давление CO2 в легких составляет 40 мм рт. ст., что соответствует 5%. Для индикации уровня рН во многих средах ис­пользуется цветной индикатор – феноловый крас­ный, меняющий окраску с фиолетовой (через красную и оранжевую) на желтую при закислении среды – из­менении рН с 8,0 до 6,5. При рН 7,4 среда с таким индикатором приобретает характерный красно-оран­жевый цвет. Осмолярность Важной характеристикой среды является ее осмолярность, определяемая концентрацией и константами диссоциации ее компонентов. Обычно осмолярность равняется 285 мОсм/кг воды и соответствует таковой крови. Ооциты и эмбрионы млекопитающих обычно культивируются в открытых системах с максимально достижимой влажностью (80 - 90% в зависимости от модели CO2-инкубатора), что предотвращает сильные колебания осмолярности в процессе культивирования. Качество воды Основой любой культуральной среды является вода, качество которой во многом определяет успех культи­вирования. Для питательных сред используется вода, полученная после двойной дистилляции, ультрафиль­трации либо деионизации. При этом необходимо со­блюдение полной стерильности в процессе ее приготов­ления и хранения. Эндотоксины, выделяемые бактери­ями, оставшимися в среде после ее ультрафильтрации, могут оказать токсическое воздействие на эмбрионы.To же может произойти и при попадании бакте­рий в среду в процессе хранения. Ионный состав Ионный состав культуральных сред может сильно варьировать. Первые среды для культивирования ооцитов и эмбрионов млекопитающих представляли со­бой модификацию раствора Кребса. Они содержали ионы, необходимые для поддержания жизни клеток – Na+, К+, Са2+, Mg2+, и , растворенные в бикарбонатном буфере (НCO3). Также добавлялись антибио­тики для предотвращения бактериального заражения и источник белка в форме альбумина или сыворотки. Наиболее часто в качестве источника белка использует­ся бычий или человеческий сывороточный альбумин, а также инактивированная человеческая сыворотка. Примерами таких сред могут служить Ml6, Т6, HTF (человеческая трубная жидкость), EBSS (сбалансированный солевой раствор Эрла) и др. Более сложные по составу среды, такие, как Ham's F10 и F12, aМЕМ, М199, хотя и были разработаны для тканевых культур, но могут использоваться и для культивирования эмб­рионов различных видов млекопитающих. Энергетическими субстратами для ооцитов и эмб­рионов млекопитающих в культуральной среде обыч­но служат пируват, лактат и глюкоза, причем усвое­ние глюкозы эмбрионы человека начинают лишь до прошествии нескольких клеточных делений, а до это­го предпочтительным источником энергии служит пи­руват. Добавление аминокислот во многие культуральные среды объясняется их присутствием в жидкости яйце­водов многих видов млекопитающих. Было показано, что добавление глутамина в культуральную среду ока­зывает положительное влияние на развитие эмбрио­нов многих видов млекопитающих. Однако при введе­нии в среду аминокислот надо иметь в виду, что не все они остаются стабильны в условиях культивирова­ния – при температуре 37С многие из них разруша­ются, образуя аммоний, который при накоплении в среде обладает токсическим эффектом.
Специально для культивирования эмбрионов Menezo с соавт. была разработана среда В2, гораздо более сложная по составу: помимо солей, она содержит ами­нокислоты, витамины, нуклеотиды, микроэлементы и - в ряде случаев – даже жирные кислоты. Все эти среды применяются в практике ЭКО в раз­личных лабораториях. При том, что роль многих ком­понентов сложных сред до сих пор не была убедительно показана, их применение дает хорошие результаты.
CO2-ИНКУБАТОР Культивирование ооцитов и эмбрионов человека проводится в присутствии 5% CO3 в воздухе при тем­пературе 37±0,1 °С и влажности 80 – 90%. Эти условия соблюдаются при использовании CO3-инкубаторов, поддерживающих необходимую температуру, влаж­ность и уровень CO2 в камере. Последний параметр поддерживается посредством подачи углекислого газа из баллона, где он находится в сжиженном состоянии, и воздуха из окружающей среды. Углекислый газ для культивирования должен соответствовать медицин­ским стандартам по чистоте. В некоторых клиниках применяется готовая газовая смесь, содержащая угле­кислый газ, азот и кислород в нужной пропорции. Влажность в камере CO3-инкубаторов поддержива­ется постоянным испарением воды со дна камеры ли­бо из специального лотка. Также в некоторых совре­менных инкубаторах имеется система инжекции воды в циркулирующий воздух, позволяющая автоматиче­ски поддерживать влажность в камере до 90%. В связи с высоким уровнем влажности в инкубато­рах высок риск роста бактерий и плесени, поэтому не­обходима регулярная очистка всех поверхностей ка­меры. Как правило, для этой цели используют 70% этиловый спирт, однако делать это надо с большой ос­торожностью, поскольку известно негативное влияние этилового спирта на ооциты и ранние эмбрионы. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ООЦИТОВ Во время трансвагинальной пункции (ТВП) преовуляторных фолликулов вместе с фоллику­лярной жидкостью в пробирки попадают комплексы ооцит-cumulus. Cumulus oophorus (яйценосный буго­рок) представляет собой часть фолликулярного эпите­лия, непосредственно контактирующую с ооцитом в процессе фолликулогенеза. Помимо прочего фоллику­лярная жидкость содержит фибриноген, что приводит к образованию кровяных сгустков уже через несколь­ко минут после аспирации. Если ооцит находится в таком сгустке, его будет достаточно сложно обнару­жить и впоследствии отмыть. Для преодоления этой проблемы используются два основных подхода: 1. Фолликулярную жидкость просматривают под ми­кроскопом сразу после аспирации и найденные ооци­ты незамедлительно помещают в среду для отмывки. 2. Фолликулярную жидкость собирают в пробирки, содержащие среду с гепарином, предотвращаю­щую образование кровяных сгустков. Как правило, в большинстве лабораторий руковод­ствуются вторым подходом. При этом используется гепарин в концентрации 50 МЕ/мл. Этот раствор в объеме 1 мл добавляется в пробирки объемом 8 - 10 мл, что дает конечную концентрацию гепарина в фолликулярной жидкости 5 - 8 МЕ/мл. Известно, что гепарин не оказывает влияния на оплодотворение и последующее развитие эмбриона. Комплексы ооцит-cumulus перед помещением в культуральную среду обязательно отмывают в специальной среде. После того как аспирированная фолликулярная жидкость попадает в эмбриологическую лабораторию, она незамедлительно просматривается на присутствие комплексов ооцит-cumulus. Для этого содержимое пробирок переливается в чашки Петри диаметром 9 см и исследуется под стереомикроскопом или инвер­тированным микроскопом при небольшом увеличе­нии. Как правило, комплексы ооцит-cumulus видны и невооруженным глазом как блестящие слизистые комки или тяжи диаметром 0,5 – 1 см. Найденные ооциты помещаются в среду для отмыв­ки, содержащую HEPES-буфер, позволяющий мани­пулировать с ооцитами на воздухе без риска измене­ния рН в щелочную сторону (такие среды производят­ся большинством фирм, специализирующихся на про­изводстве сред для ЭКО), затем отмываются в культуральной среде и помещаются в лунку 4-луночной чашки либо в специальную чашку для ЭКО, где в дальнейшем будет проводиться оплодотворение ооци­тов и культивирование эмбрионов. Также допускается культивирование в небольших (5 – 10 мкл) каплях среды, покрытых слоем мине­рального масла, предварительно эквилиброванного с культуральной средой в присутствии 5% С02. Преиму­ществами культивирования под маслом являются: препятствование попаданию в культуральную среду мик­роорганизмов и частичек пыли, возможность культи­вирования в небольших каплях среды, что важно при оплодотворении спермой с небольшой концентрацией активных сперматозоидов, а также замедление испаре­ния воды и выхода CO2 из среды вне инкубатора. Одна­ко, если капли со средой под маслом слишком долго находились вне инкубатора, возвращение к исходному равновесию влажности и концентрации CO2 займет гораздо больше времени, чем в отсутствие масла. Манипуляции с ооцитами проводят с помощью от­тянутых стерильных пастеровских пипеток, имеющих небольшую резиновую грушу на конце, либо стеклян­ных (пластиковых) капилляров, присоединенных к микроаспиратору. Существуют и другие способы ма­нипуляций с ооцитами и эмбрионами – выбор зави­сит от опыта и желания эмбриолога. Сразу после помещения ооцитов в культуральную среду необходимо оценить количество, качество и сте­пень зрелости полученных комплексов ооцит-cumulus. Классификация комплексов ооцит-cumulus, применяемая в клинике Bourn Hall, Кембридж Ооцит Характеристика 1 Очень незрелый Клетки cumulus и corona radiata плотно упакованы во­круг ооцита. Иногда можно увидеть ядро ооцита - за­родышевый пузырек. Такой ооцит находится на стадии профазы первого деления мейоза (GV-germinal vesicle stage), на которой происходит блок мейоза в процессе оогенеза. Полярное тельце еще не сформи­ровалось 2 Незрелый Клетки corona radiata все еще плотно примыкают к ооциту, cumulus незначительно увеличился. Такой ооцит обычно находится на стадии метафазы первого деления мейоза (М I), блок мейоза уже снят, однако формирование полярного тельца пока не произошло 3 Преовуляторный Клетки corona radiala расходятся лучами от ооцита, cumulus разросшийся, но имеет клеточную структуру. Ооцит находится на стадии метафазы второго деления мейоза (М II), Полярное тельце уже сформировано 4 Перезрелый Присутствует небольшое количество клеток corona radiata, уже не примыкающих плотно к ооциту, который хорошо просматривается. Cumulus разросшийся, но все еще имеет клеточную структуру. Полярное тельце обычно хорошо видно 5 Лютеинизированный Вокруг ооцита клетки cumulus образуют скопления (комки), остальной cumulus представляет собой желе­образную массу с небольшим количеством клеток 6 Дегенеративный Несколько клеток гранупезы окружают ооцит, cumulus отсутствует или очень маленький. Ооцит обычно темноокрашен Оценка степени зрелости ооцитов по состоянию комплексов ооцит-cumulus, как правило, субъективна и часто не отвечает истинному состоянию ооцита. Асинхронность в созревании ядра ооцита, ооплазмы и клеток cumulus достаточно часто встречается в циклах стимуляции суперовуляции при ЭКО. Однако более точное определение степени зрелости (если клетки co­rona radiata и cumulus удаляют ферментативно или механически) может привести к травматизации ооци­та и увеличению риска полиспермии при оплодотворении.
На рис.2 представлены данные по распределению ооцитов, полученных в ходе стимуляции суперовуляции, по степени зрелости. Оценка производилась после удаления клеток cumu­lus.
Рис.2. Распределение ооцитов по степени зрелости ядра на момент ТВП: GV – стадия зародышевого пузырька (germinal vesic le) – очень незрелый ооцит; М I – стадия метафазы первого деления мейоза – незрелый ооцит; М II –стадия метафазы второго деления мейоза – зрелый ооцит; ATR –дегенератив­ный ооцит (См. рис. 3) Рис.3. Ооцитарно-фолликулярные комплексы. а – незрелый; б – зрелый; в – пере­зревающий. Микрофотографии живых объектов в фазовом контрасте. ОБРАБОТКА СПЕРМЫ ПЕРЕД ОПЛОДОТВОРЕНИЕМ ООЦИТОВ in vitro Эякулят для ЭКО получают путем мастурбации в стерильный контейнер. После полного разжижения спермы, происходящего при комнатной температуре через 30 - 60 мин, приступают к ее обработке. Предва­рительно необходимо провести анализ концентрации сперматозоидов, их подвижности и морфологических характеристик по стандартной методике ВОЗ. Перед тем как добавлять сперму в культуральную среду с ооцитами, необходимо ее обработать в целях удаления семенной плазмы и получения максимально полноценной фракции прогрессивно подвижных спер­матозоидов. На практике применяются два основных метода обработки спермы - центрифугирование-фло­тация (процедура swim-up) и градиентное центрифуги­рование. При использовании методики swim-up 1 – 2 мл спер­мы помещают в коническую 10 – 15-миллиметровую пробирку, добавляют 5 - 10 мл среды для отмывки* и центрифугируют 5 – 10 мин при ускорении 1200 g. За­тем супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в 2 – 3 мл среды и вновь центрифугируют. После удаления супернатанта 1 – 2 мл свежей среды осторожно наслаи­вают на осадок, пробирку помещают в CO2-инкубатор при 37°С на 30 – 60 мин. В течение этого времени по­движные сперматозоиды должны мигрировать в насло­енную среду, оставив на дне пробирки неподвижные сперматозоиды, дебрис и иные клетки. Если пробирки будут установлены наклонно, увеличится площадь контакта осадка со средой и, соответственно, выход по­движных сперматозоидов. Для определения кон­центрации и подвижности сперматозоидов в надосадочной жидкости берется аликвота 10 или 50 мкл. Затем необходимое количество чистого супернатанта исполь­зуется для инсеминации. Важным шагом вперед в методике обработки спермы стало внедрение метода центрифугирования в градиенте Перколла. Перколл пред­ставляет собой суспензию силиконовых гранул 15 – 30 нм в диаметре, покрытых слоем поливинилпирролидона (PVP), поскольку в чистом виде они токсичны для клеток. Особенностью Перколла является очень низкая осмолярность – 25 мОсм/л, поэтому при раз­ведении в среде до различных концентраций, соответ­ствующих различным плотностям (от 1,01 до 1,13 г/л), осмолярность растворов остается постоян­ной. Растворы Перколла (40 и 90%) готовятся из 100% раствора, представляющего собой смесь 9 час­тей Перколла и 1 части 10-кратно концентрированной среды для отмывки. Прерывистый градиент плотности достигается путем помещения 1,5 мл 40%-го Перкол­ла на 1,5 мл 90%-го в конической пробирке; сверху аккуратно наслаивается сперма (1 – 2 мл), и вся эта трехслойная колонка центрифугируется 15 мин при ускорении 700 g. После центрифугирования в осадок попадают только функционально нормальные сперма­тозоиды; неподвижные и аномальные сперматозоиды, а также лейкоциты и другие клетки спермы задержи­ваются на границе 40 и 90%-q фракций. Осадок отбирается пастеровской пипеткой и два раза отмыва­ется в специальной среде, как и в случае применения методики swim-up (см. выше). Последний метод, по мнению многих авторов, явля­ется более предпочтительным, сочетая в себе хорошую сепарацию и высокий выход фертильных сперматозо­идов. Кроме того, описано и защитное действие Перколла: он не позволяет попасть в осадок дефект­ным сперматозоидам, лейкоцитам и другим клеткам спермы, производящим большое количество свобод­ных радикалов, способных повреждать мембраны сперматозоидов. Таким образом, чем более благо­приятно соотношение жизнеспособных сперматозои­дов и дефектных, тем меньше вероятность поврежде­ний первых. ОПЛОДОТВОРЕНИЕ ООЦИТОВ in vitro Много споров и разночтений вызывает вопрос о времени введения сперматозоидов в среду, где культи­вируются ооциты. Наиболее общепринятым считает­ся, что между выделением первого полярного тельца ооцита (достижением стадии М II) и добавлением спермы должно пройти около 4 ч, тогда способность такого ооцита к оплодотворению и последующему дроблению будет максимальной. Преовуляторный фолликул на момент аспирации (обычно 36 ч после введения хорионического гонадотропина - ХГ, имитирующего пик эндогенного ЛГ в момент овуляции при естественном цикле), как пра­вило, содержит ооцит на стадии М II. В естественных условиях овуляция, а значит, и возможность оплодо­творения наступает через 38 - 40 ч после пика ЛГ. На практике преинкубация ооцитов перед инсеминацией составляет от 2 до 6 ч. Данные по влиянию времени инкубации на оплодотворяемость ооцитов, дробление эмбрионов и беременность разноречивы. По данным К. Yanagida с соавт., исследовавших такую за­висимость при инкубации ооцитов в течение 1 - 11 ч пе­ред оплодотворением (применялся метод интрацитоплазматической микроинъекции сперматозоида в яйцеклетку - ИКСИ), способность ооцитов к оплодот­ворению, последующему дроблению и имплантации статистически достоверно снижается при инкубации их более 9 ч. Достоверных различий при инкубации в течение 1 - 9 ч не было обнаружено. В другом ис­следовании было показано, что инкубация более 9 ч перед оплодотворением наиболее оптимальна для по­следующего прохождения всех вышеуказанных про­цессов при ИКСИ; исследователи предполагают, что это связано с дозреванием цитоплазмы ооцита, необхо­димым для его активации при оплодотворении. Важным моментом в обеих работах является то, что инкубация ооцитов происходила в присутствии кле­ток cumulus и corona radiata. Известно, что созрева­ние ооцита полностью зависит от окружающих клеток фолликулярного эпителия, поставляющих в ооплазму РНК и белки, необходимые для развития будущего организма до включения его собственного генома, а также белковые факторы, отвечающие за процесс оп­лодотворения. Было показано, что дозревание ооцитов in Ditro со стадии GV до стадии МII при интактном cumulus происходило с большей вероятностью, при­чем последующее их оплодотворение и дробление бы­ло лучше.
Несмотря на расхождение данных, большинство ав­торов считает, что преинкубация обязательно необхо­дима, а ее оптимальная длительность подбирается эм­пирически в каждой лаборатории. При этом окно оп­лодотворения для зрелого ооцита достаточно широко, однако преждевременное оплодотворение недозревших ооцитов может негативно повлиять на исход дробления и имплантации эмбрионов.
Помимо фактора времени, в инсеминации важным является и количественный фактор. Количество про­грессивно подвижных сперматозоидов обычно должно составлять 50 - 100 тыс. на 1 мл среды (при культиви­ровании в относительно большом объеме среды) либо на ооцит (при культивировании в микрокаплях под минеральным маслом). Подбирая концентра­цию сперматозоидов при оплодотворе­нии ооцитов in vitro, нужно иметь в виду, что при добавлении менее 50 тыс. активно подвижных сперматозоидов на 1 мл частота оплодотворения будет существенно снижена, а при использовании очень вы­соких концентраций возникают побочные эффекты: полиспермия (проникновение более одного спермато­зоида в ооцит при оплодотворении), снижение жизне­способности полученных эмбрионов (за счет повреж­дения кислородными радикалами, при попадании погибающих или мертвых сперматозоидов, либо воз­действия избыточного количества литических акросомальных ферментов). Однако это правило реализуется лишь в случае нор­мальной морфологии сперматозоидов, при наличии необходимой концентрации активно подвижных спер­матозоидов в эякуляте, отсутствии дефектов акросомальной реакции или отсутствии больших концентра­ций антиспермальных антител в сперме (MAR-тест менее 50%). При наличии этих и других отрицатель­ных факторов, а также при неудаче оплодотворения в предыдущей попытке ЭКО концентрация сперматозо­идов может быть повышена путем снижения объема среды культивирования (культивирование в микро­каплях, соломках для криоконсервации, микрокапил­лярах), однако это далеко не всегда приводит к жела­емым результатам. Для облегчения проникнове­ния сперматозоида в ооцит клетки cumulus и corona radiata могут быть удалены ферментативно и механи­чески, однако это повышает риск полиспермии.
ОПЛОДОТВОРЕНИЕ – ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ Оплодотворение представляет собой слияние двух гамет - ооцита и сперматозоида, влекущее за собой слияние их гаплоидных наборов хромосом и развитие нового организма. Зрелый ооцит к моменту оплодотворения пред­ставляет собой одну из наиболее больших клеток ор­ганизма - 110 - 120 мкм в диаметре, окруженную блестящей оболочкой (zona pellucida), несколькими слоями клеток лучистого венца (corona radiata) и большим числом клеток яйценосного бугорка (cumu­lus oophorus). К этому времени в ооците, как прави­ло, уже завершилось первое деление мейоза, в ре­зультате которого отделилось первое полярное тель­це, а второе деление мейоза находится на стадии метафазы. Хромосомы располагаются в ряд, образуя метафазную пластинку, непосредственно под поляр­ным тельцем. На этой стадии в ооците происходит блок мейоза, который снимается лишь при проник­новении сперматозоида. Зрелый сперматозоид имеет уплощенную гру­шевидную головку длиной около 6 мкм и шириной в экваториальном сегменте около 4 мкм, состоящую главным образом из ядра и акросомы, которая со­держит литические ферменты и расположена в виде шапочки над верхней половиной головки. Хвост сперматозоида имеет длину около 50 мкм и начина­ется от головки в районе шейки, где расположены центриоль и комплекс митохондрий. Митохондрии отвечают за обеспечение энергией процесса движе­ния сперматозоида, осуществляемого хвостом. В структуре сперматозоида нет ничего лишнего, все имеет только одну цель – доставить генетический материал, содержащийся в головке сперматозоида, в ооцит. Способность сперматозоида к оплодотворению in vivo или In vitro появляется лишь после капацитации, под которой in vivo понимается весь комплекс биохи­мических и ультраструктурных изменений, которые претерпевает сперматозоид, проходя путь через жен­ский половой тракт до встречи с ооцитом. Эти измене­ния затрагивают в основном мембрану головки спер­матозоида. Капацитация in vitro происходит во время обработки и инкубирования спермы до оплодотворе­ния, однако она невозможна при отсутствии в средах для отмывки и культивирования альбумина. При оплодотворении in vivo в трубе присутствует лишь небольшое количество сперматозоидов, проде­лавших весь долгий путь от влагалища до ампулярного отдела маточной трубы. Для нормального оплодо­творения in vitro их необходимо не менее 50 тыс. на ооцит. Однако при подсчете количества сперматозои­дов, непосредственно атакующих ооцит in vitro, их на­считывается до 2 - 3 тыс. До сих пор неясно, почему количество сперматозоидов должно быть так велико в искусственных условиях. Возможно, это объясняется недостаточной физиологичностью среды либо боль­шим размером массы cumulus у ооцитов, получаемых при ТВП, чем in vivo. Прежде чем попасть в ооцит, сперматозоид должен преодолеть несколько барьеров. Первым из них явля­ется cumulus, представляющий собой растянутый матрикс, состоящий преимущественно из полигиалуроновой кислоты, с редко расположенными клетками. Преодолеть этот барьер может только капацитированный сперматозоид с интактной акросомой. По мере продвижения внутрь cumulus поведение сперматозои­да изменяется: резко возрастает скорость, двумерные движения становятся трехмерными - наступает фаза гиперактивности. In vitro первый барьер спер­матозоидам помогает преодолевать фермент гиалуронидаза, выделяющаяся при разрушении акросом гибнущих сперматозоидов; однако такая ситуация не является физиологичной. После прохождения cumulus сперматозоид достига­ет zona pellucida, где происходит его связывание с ре­цептором. В отличие от мышей, рецепторы zоnа pellu­cida которых давно выделены и охарактеризованы, таковые человека до сих пор точно не определены. Имеется предположение, что это так называемый ан­тиген к оплодотворению - FA-1, гликопротеин, кото­рый при добавлении в среду полностью блокирует свя­зывание сперматозоидов с zona pellucida. Связывание сперматозоида возможно только при интактной акросоме и нормальной морфологии голов­ки, поскольку рецепторы сперматозоида к гопа pellu­cida расположены на акросоме. Затем происходит акросомная реакция - мембрана акросомы и цитоплазматическая мембрана ооцита сливаются, содержимое акросомы (главным образом, фермент акрозин, спо­собный к локальному растворению гликопротеинов, из которых состоит гопа pellucida) выбрасывается в месте связывания с гопа pellucida и сперматозоид ин­тенсивно продвигается сквозь оболочку ооцита, все еще находясь в фазе гиперактивности. Попадая в перивителлиновое пространство, спер­матозоид прикрепляется к рецепторам на мембране ооцита комплементарными рецепторами, расположен­ными на экваториальной части головки под акросо­мой. Связывание сперматозоида с рецепторами на плазматической мембране мгновенно вызывает так называемую кортикальную реакцию - массовый экзоцитоз гранул, расположенных по периферии ооцита (cortex}, что приводит к необратимым измене­ниям zona pellucida, делающим ее непроходимой для остальных сперматозоидов. Это является основным механизмом предотвращения полиспермии у млеко­питающих. Далее начинается процесс слияния мемб­ран сперматозоида и ооцита, в результате которого сперматозоид целиком как бы заглатывается ооцитом (процесс очень напоминает фагоцитоз).
Сразу после слияния гамет ядерная мембрана спер­матозоида разрушается, хроматин деконденсируется под влиянием факторов ооплазмы. Одним из этих фак­торов, возможно, является так называемый фактор деконденсации ядра сперматозоида (SNDF). Ооцит также активируется, мейоз возобновляется, выделяет­ся второе полярное тельце. Механизм активации ооци­та пока изучен недостаточно, однако известно, что фактор активации выделяется сперматозоидом. Ядерный материал ооцита окружается оболочкой - формируется женский пронуклеус. Вокруг хрома­тина сперматозоида формируется мужской пронукле­ус, в обоих пронуклеусах идет синтез ДНК. Мужской и женский пронуклеусы начинают движение по на­правлению друг к другу и встречаются в центре ооци­та. Через несколько часов после встречи мембраны пронуклеусов разрушаются, и генетический материал обеих гамет сливается (сингамия). На этом этапе про­цесс оплодотворения завершается - возникает зигота. Хроматин зиготы конденсируется, и хромосомы подго­тавливаются к первому делению дробления.
На следующий день после аспирации ооциты пере­носят в лунку со свежей культуральной средой и очи­щают от клеток лучистого венца пастеровской пипет­кой с оттянутым до диаметра 150 - 160 мкм кончиком и просматривают на предмет присутствия признаков оплодотворения. Пронуклеусы видны в ооците даже при наблюдении в стереомикроскоп х 80. Они появля­ются, как правило, через 10 - 16 ч после добавления сперматозоидов в среду с ооцитами и исчезают через 6 - 8 ч после появления. Если присутствуют оба пронуклеуса - оплодотворение считается нормальным. Если их не удается обнаружить - оплодотворение не состоялось. Если виден один пронуклеус либо больше двух - произошло аномальное оплодотворение. Примерно в 30% случаев в ооцитах после оплодо­творения in vitro не выявляются пронуклеусы, что мо­жет быть связано как с несостоявшейся пенетрацией ооцита (низкая концентрация активных сперматозои­дов, дефекты в механизмах адгезии сперматозоида, отсутствие рецепторов на zona pellucida и/или мембра­не ооцита), так и с незрелостью ооцита на момент оп­лодотворения, а также с наличием хромосомных ано­малий у ооцита (диплоидия, анеуплоидия). При наличии в ооплазме одного пронуклеуса (около 3 - 6%) в половине случаев оплодотворение все же происходит, однако пронуклеусы формируются асин­хронно. Происхождение таких зигот может быть раз­личным: гиногенетическим (из ооцита), андрогенетическим (из сперматозоида) либо возникшим в резуль­тате слияния мужского и женского пронуклеусов. Отличить на практике это невозможно, поэтому реко­мендуется: во-первых, просматривать ооциты на сле­дующий день после инсеминации несколько раз, чтобы избежать ошибки; во-вторых, не переносить в полость матки эмбрионы, полученные из однопронуклеарных зигот. Полипронуклеарные зиготы - 3 и более пронукле­усов - составляют, как правило, 5 - 10% от всех оп­лодотворенных ооцитов и возникают главным образом при проникновении в ооцит более одного сперматозо­ида (в случае добавления избыточного количества сперматозоидов при инсеминации, при дефектах кор­тикальной реакции, при незрелости или перезрелости ооцита). Также описаны случаи неотделения второго полярного тельца после завершения мейоза, генетиче­ский материал которого формирует третий пронукле­ус. Полипронуклеарные зиготы, как правило, не развиваются нормально, эмбрионы, полученные из таких зигот нельзя переносить в полость матки. В естественных условиях такие эмбрионы иногда имплантируются, однако чаще всего такая беременность заканчивается выкидышем либо мертворождением. Рис. 4. Яйцеклетки и зародыши человека на различных этапах культивиро­вания. а – ооцит с первым полярным тельцем; б – пронуклеусы: в и г – зародыши на ста­диях 4 и 8 бластомеров. Микрофотографии живых объектов в фазовом контрасте. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ Эмбрионы, полученные после оплодотворения ооцитов одной и той же пациентки, часто отличаются по скорости дробления и морфологическим парамет­рам. Общепризнанным считается, что максимальную способность к имплантации имеют эмбрионы с наи­большей скоростью дробления, бластомеры которых имеют регулярную форму, а безъядерные фрагменты отсутствуют. Такие эмбрионы относят к классу 1 (А). Градация эмбрионов по качеству является условной и различается в разных лабораториях. Однако в ос­нове ее лежит, как правило, характер фрагментации эмбриона, форма и размер бластомеров. Так, эмбрион с неравными бластомерами и/или фрагментами ци­топлазмы, занимающими менее 10% объема, соответ­ствует классу 2 (В); при наличии фрагментации 10 - 50% - классу 3 (С), более 50% - классу 4 (D). Работы по анализу влияния качества переносимых в полость матки эмбрионов на частоту их имплантации многочисленны, но трудносопоставимы в силу разных методик оценки качества. Около 20% переносимых эмбрионов А-В класса имплантируются, однако эта частота падает до 1,5% для сильно фрагментированных эмбрионов. Впечатляют результаты клиники Bourn Hall (Англия), в которых показано, что 90% пациенток, забеременевших после ЭКО и ПЭ, по­лучали при переносе эмбрионов хотя бы один эмбрион класса А. В той же работе не было выявлено зависимо­сти между качеством переносимых эмбрионов и часто­той невынашивания беременности. СТРАТЕГИЯ ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ Количество переносимых эмбрионов обычно со­ставляет не более 2 - 3, поскольку при увеличении чис­ла эмбрионов до 4 и более частота беременности, как правило, не возрастает, но увеличивается риск моногоплодной беременности, что влечет за собой серьез­ные проблемы акушерского характера. Однако в от­дельных случаях допускается перенос большего числа эмбрионов - при многократных неудачных попытках ЭКО и ПЭ и при возрасте пациентки старше 40 лет. В данном случае при последующих переносах шанс наступления беременности снижается, и авторы пытаются использовать возможность наступления бе­ременности за счет увеличения количества переноси­мых эмбрионов. Но такой подход не является науч­ным, так как в этих случаях не всегда ясна причина неудач, т. е. мы часто имеем дело с так называемым «бесплодием неясной этиологии». Что касается интервала между моментом оплодо­творения ооцитов и временем переноса эмбрионов, то здесь существует несколько основных подходов. На заре развития метода Эдварде и Стептоу переносили в полость матки эмбрионы, достигшие стадии 8 - 16 бла­стомеров на 3 - 4-е сутки культивирования, имитируя естественные условия. Однако впоследствии было выявлено, что более ранние эмбрионы также пригод­ны для переноса и имплантируются с той же вероят­ностью. Через 48 ч после аспирации фолликулов (2-е сутки культивирования) эмбрионы, как правило, находятся на стадии 2 - 4 бластомеров, но встречаются и стадии 6 - 8 бластомеров. Перенос эмбрионов на 2-е сутки наи­более общепринят: уже имеется возможность отобрать эмбрионы по качеству и скорости дробления, однако пребывание в условиях культуры, являющихся в лю­бом случае менее оптимальными, чем естественные, еще не слишком длительно.
Интересен тот факт, что способность эмбриона к им­плантации напрямую зависит от скорости его дробле­ния. Так, в исследовании Staessen с соавт. при переносе эмбриона хорошего качества на стадии 2 и 4 бластоме­ров частота имплантации составила 14 и 21% соответ­ственно. В другой работе сообщается, что если перенесенные эмбрионы достигали стадии не более 2 бластомеров, частота наступления беременности составляла 9,3%, но возрастала до 35,8%, если хотя бы один эмбрион был на более чем двуклеточной ста­дии.
На 3-и сутки культивирования нормально развива­ющиеся эмбрионы достигают стадии 6 - 8 бластомеров и выше. К этому моменту выбор эмбрионов для пере­носа облегчается - часть эмбрионов, на 2-е сутки дро­бившихся нормально, отстает в развитии либо оста­навливается. Однако при анализе качества многокле­точных эмбрионов существует опасность принять безъядерные фрагменты за бластомеры, становящиеся к этой стадии близкими по размеру. В большинстве лабораторий, проводящих ЭКО и ПЭ, перенос эмбрио­нов осуществляется на 2 - 3-и сутки культивирования, причем статистически достоверной разницы между частотой наступления беременности после переноса на 2-е или 3-и сутки не было обнаружено (соответственно 21,9 и 23,5%). Выбор времени переноса должен осуществляться на основании анализа интенсивности и равномерности дробления эмбрионов: если выбор эмбрионов на 2-е сутки затруднен, перенос можно от­ложить на 24 ч. На 4 - 5-е сутки пребывания в культуре при приме­нении стандартных сред и методик культивирования лишь небольшая часть эмбрионов достигает стадии морулы и бластоцисты, и частота наступления бере­менности не возрастает по сравнению с переносом на 2 - 3-и сутки. Однако при использовании культуральных систем, отвечающих метаболическим потребностям эмбрионов на этой стадии, можно добиться хороших результатов. Так, при культивировании эмбрионов в присутствии клеток линии Vero (клетки почки обезьяны) было по­казано, что 60% эмбрионов достигают стадии бласто­цисты, а перенос бластоцист дает высокий процент беременности. Особенно это относится к пациенткам с повторными неудачами при переносе более ранних эмбрионов. По данным разных авторов, беременность наступала в 37 - 40% случаев переноса эмбрионов на стадии бластоцисты. Серьезным возражением против ко-культивирования эмбрионов человека в присутствии клеток других животных является возможность вирусного зараже­ния, поэтому активно разрабатываются среды, опти­мизирующие условия культивирования более поздних эмбрионов (>3 суток). Примером такой среды может служить среда Гарднера (G 2). При культивировании в ней эмбрионов с 3-го по 5-й день бластоцисты фор­мировались из 52% зигот первого дня, частота им­плантации и беременности составляла соответственно 23 и 38%. Сам Гарднер сообщает о 50%-й им­плантации бластоцист, полученных при последова­тельном культивировании в средах G 1,2 (1 - 2-й день) и G 2,2 (3 - 5-й день), в то время как достоверной раз­ницы между частотой наступления беременности по­сле переноса эмбрионов на 3-й и 5-е сутки не наблю­далось (66 и 71% соответственно). Возможность культивирования до стадии бластоци­сты открывает большие возможности при отборе «луч­ших» эмбрионов, делает более физиологичным мо­мент попадания эмбрионов в полость матки, а также существенно увеличивает процент имплантации, что позволяет переносить не более 2 бластоцист, не опаса­ясь возникновения осложнений, связанных с много­плодием, или снижения вероятности наступления беременности. ТЕХНИКА ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ Техника переноса эмбрионов за двадцать лет развития метода практически не изменилась. Здесь мы рассмотрим лишь последовательность действий эмбриолога, не касаясь гинекологических аспектов переноса. Перенос эмбрионов осуществляют через цервикальный канал в полость матки пациентки с помощью специального катетера. Существует большой выбор таких катетеров, однако наиболее распространенными в мире являются: катетеры Bourn-Wallace, Frydman и Cook-Soft transfer для неосложненных переносов и ка­тетер T.D.T. для осложненных переносов (при загибе матки, извилистом ходе или спазме цервикального канала). Катетер присоединяют к 1-миллилитровому шпри­цу, набирают столбик (около 0,2 мл) свежей, нагретой до 37°С культуральной среды, затем давление со шприца снимают, шприц переводят в исходное поло­жение и продолжают набирать: сначала пузырек воз­духа, затем каплю среды без эмбрионов, опять пузы­рек воздуха, каплю среды с эмбрионами, отобранны­ми для переноса, пузырек воздуха и еще одну каплю без эмбрионов. Такая последовательность необходима для обеспечения сохранности эмбрионов во время про­цедуры переноса и маркирования их местоположения. Катетер с эмбрионами передают гинекологу для осу­ществления переноса: содержимое, за исключением начального столбика среды, всего около 20 - 50 мкл, попадает в полость матки. Оставшейся средой промы­вают катетер и смыв рассматривают под стереомикроскопом, чтобы убедиться, что все эмбрионы перенесе­ны в полость матки. СТИМУЛЯЦИЯ СУПЕРОВУЛЯЦИИ В ПРОГРАММЕ ЭКО И ПЭ Для успешного выполнения программы ЭКО необходимо добиться созревания нескольких доминантных фолли­кулов - суперовуляции. Это значительно повышает воз­можность изъятия и оплодотворения яйцеклетки. Кроме того, отмечено, что при пересадке нескольких оплодотворен­ных яйцеклеток беременность развивается чаще, причем развивается один эмбрион. Этот феномен получил название "функция помощи". Период развития от раннего преантрального до преовуляторного фолликула у человека занимает пример­но 85 дней, или 3 менструальных цикла (рис.5). После 65 дней роста финальная когорта, состоя­щая из 15 - 20 малых полостных фолликулов, вступает в гонадотропинзависимую фазу роста. В спонтан­ном менструальном цикле в яичнике под влиянием гонадотропинов (Гн), главным образом фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), развивается один фол­ликул, а остальные подвергаются атрезии. Секреция ФСГ происходит в аденогипофизе и регулируется гонадотропин-рилизинг гормоном (ГнРГ), вырабатывае­мым гипоталамусом. Доминантный фолликул облада­ет высокой стероидогенной активностью и продуциру­ет эстрадиол (Е2), необходимый для секреторной трансформации эндометрия и обеспечения условий для имплантации эмбриона. Когда секреция E2 дости­гает критического уровня, происходит резкое возрастание уровня лютеинизирующего гормона (ЛГ), сти­мулирующего овуляцию и лютеинизацию лопнувшего фолликула. ЛГ, как и ФСГ, секретируется клет­ками аденогипофиза и находится под влиянием ГнРГ. Изучение динамики концентрации E2 в перифери­ческой крови показало, что период активного стероидогенеза составляет 5 - 6 дней, после чего концентра­ция е2 резко снижается. Мониторниг E2 используется в клинической практике для определения степени функциональной зрелости доминантного фолликула. На месте разорвавшегося фолликула формируется желтое тело, которое является основной стероидпродуцирующей структурой яичника, определяющей изменения концентрации Е2 и прогестерона (П) на протяжении лютеиновой фазы менструального цик­ла.
Первая беременность, завершившаяся в 1978 г. рождением Луизы Браун, наступила в результате оп­лодотворения in vitro единственного ооцита, аспирированного в спонтанном цикле, и переноса одного эм­бриона в полость матки. В последующих исследовани­ях была показана низкая эффективность метода при переносе лишь одного эмбриона, которая составляет при работе в естественном цикле не более 8 - 15% из расчета на один перенос эмбрионов. Это привело к не­обходимости использования лекарственных препаратов, оказывающих стимулирующее действие на фолликулогенез в яичниках в целях получения несколь­ких преовуляторных ооцитов.
Для стимуляции фолликулогенеза и получения не­скольких преовуляторных ооцитов используются гормональные препараты. Рис. 5. Цикл развития доминантного фолликула Стимуляция суперовуляции в современных условиях основана на: § стимуляции выделения собственных эндогенных гонадотропинов кломифеном; § стимуляции экзогенными гонадотропинами (препараты из мочи менопаузальных женщин - препараты человеческого менопаузального гонадотропина (чМГ), содержащие ЛГ и ФСГ (пергонал, неопергонал, хумегон) или ФСГ (метродин); § стимуляции экзогенными гонадотропинами на фоне бло­кады собственных гонадотропинов препаратами агонистов РГ ЛГ (декапептиды - трипторелин, бусерелин, госерелин, нафарелин и др.). Все эти препараты - синте­тические аналоги гонадотропных рилизинг гормонов, и число их постоянно растет. Все они в 50 - 100 раз актив­нее эндогенных рилизингов. Действие их основано на блокаде собственных гонадотропинов, что позволило некоторым авторам называть этот метод «стимуляция су­перовуляции на фоне гипофизэктомии», хотя на самом деле подавляется секреция только гонадотропинов, а не всех тропных гипофизарных гор­монов. На фоне снижения уровня собственных гонадотропинов введение экзогенных гонадотропинов позволяет регулировать рост доминантных фолликулов и созрева­ние яйцеклеток. В повседневной практике используются так называемые «длинная схема» и «короткая схема» введения препаратов. При длинной схеме введение агонистов начинают в конце фолликулярной фазы предыдущего цикла, под контролем снижения ЛГ в крови. После наступления устойчивого низ­кого «плато» ЛГ приступают к введению гонадотропных препаратов. При короткой схеме агонисты вводятся с 1-го дня менструального цикла, гонадотропины - с 3-го или 5-го дня цикла. При любом методе стимуляции суперовуляции постоянно контролируются число фолликулов, темпы их роста и вели­чина фолликулов. До начала стимуляции суперовуляции следует про­водить предварительное гормональное обследование, а в период стимуляции - ультразвуковой (УЗ) и гормо­нальный мониторинг. Как правило, исследуется уровень эстрадиола крови и толщина эндометрия. Критериями со­зревания яйцеклетки, точнее говоря, определением времени, оптимального для забора ооцитов, являются: концентрация эстрадиола не менее 350 пг/мл на 1 фолликул диаметром более 15 мм, толщина эндометрия 0,8 - 1,0 см. Механизм овуляции, в естественном спонтанном менструальном цикле обеспечивающийся выбросом эндогенного ЛГ, в циклах стимуляции суперовуляции имитируется введением ЛГ-подобного препарата - хорионического гонадотропина (ХГ), получаемого из мочи беременных женщин. Через 35 - 36 ч после введения овуляторной дозы ХГ (10000 ед.) производится трансвагинальная пункция яичников (ТВП) в целях аспира­ции зрелых ооцитов. После их оплодотворения in vitro и инкубации в специальной питательной среде через 48 - 72 ч, в зависимости от интенсивности дробления, производится перенос эмбрионов на ранней стадии дробления в полость матки пациентки. После пересадки эмбрионов рекомендуется вводить поддерживающие дозы хорионического гонадотропина по 1500 ед. и дексаметазона по 0,25 мг, послед­ний подавляет иммунную реакцию отторжения плодного яйца. Препараты вводят до констатации беременности или до срока очередных менструаций (в случае неудачи). ОСНОВНЫЕ ПРОБЛЕМЫ, ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ЭКО И ПЭ Программа ЭКО и ПЭ сложна в связи с тем, что она многоэтапная, но не все этапы можно объективно проконтролировать. Остановимся на некоторых пробле­мах, возникающих при применении этого метода. У женщины вовремя одного естественного менстру­ального цикла можно получить в среднем не более одной яйцеклетки. Манипулируя с яйцеклеткой, ее легко потерять или травмировать, поскольку ее разме­ры, включая corona radiata, не превышают 500 мк. Яйцеклетка может быть потеряна, например, в пипет­ке, в капле питательной среды и т. п. Следовательно, необходим резерв клеток. В связи с этим возникла идея стимуляции так называемой суперовуляции, т. е. получения большего числа яйцеклеток (5 - 10 шт.) за счет применения ан­тагонистов эстрогенов и менопаузальных гонадотропинов ФСГ и ЛГ. Однако увеличе­ние количества яйцеклеток влечет за собой другой от­рицательный фактор - некоторые из них могут ока­заться неполноценными, с нарушением оогенеза или с хромосомной патологией, а другие могут стать на путь обратного развития в процессе фолликулогенеза. Так что не все полученные яйцеклетки могут быть оплодотворены и нормально развиваться. Высокая частота самопроизвольных абортов (26,2%) после ЭКО является относительным показателем возмож­ной патологии плодов. Эти данные подтверждаются ре­зультатами исследования хромосом яйцеклеток и эмбрио­нов ранних стадий развития. Из­вестно, что от 35 до 50% нефертилизованных ооцитов в программе ЭКО имеют хромосомные аномалии. Выявлена высокая степень зависимости хромосомных аномалий от возраста беременных женщин. Так, анэуплоидия диагностируется у 47% женщин после 35, лет и у 25% молодых женщин; после кломифена - у 55%, по­сле ЧМГ - у 23%, после чистого ФСГ - у 22%. Значи­тельно чаще хромосомная патология обнаруживается у фрагментированных эмбрионов (33%), чем у нормаль­ных (20%). Анализ ооцитов и эмбрионов, полученных в программе ЭКО, свидетельствует о том, что основным фактором, обусловливающим высокую частоту хромосомных анома­лий, является возраст беременных. Увеличение часто­ты хромосомной патологии с увеличением возраста имеет тенденцию, аналогичную таковой в популяции, однако показатели этой патологии в 2 раза выше, чем популяционные данные спонтанной фертильности. Высокая ча­стота хромосомных аномалий в нефертилизованных ооцитах свидетельствует о том, что множественная наведенная стимуляцией овуляция, или суперовуляция, сопровождается высокой частотой хромосомной пато­логии ооцитов, которые созревают в аномальных усло­виях в отсутствие физиологической селекции и борьбы за существование доминирующего фолликула, который подавляет рост других фолликулов в одном пуле, воз­можно, не имеющих тенденции к нормальному разви­тию. Начато внедрение в практику методики флуорисцентной (in situ) гибридизации (FISH), обеспечивающей преимплантационную диагностику врожденной хромосомной патологии. Отдельные бластомеры извлекаются из эмбриона и проводится их FISH-анализ. Эмбрионы, по которым получено положительное заключение, могут быть перенесены в полость матки для дальнейшего развития, а эмбрионы с обнаруженной патологией не переносятся (в целях профилактики таких заболеваний как гемофилия, синдром Патау, Дауна, Эдвардса, Клайнфельтера, моносомия Шершевского-Тернера).
Достижением самых последних лет является генная терапия, приме­нение которой возможно и на самых ранних стадиях развития эмбрионов. При этом выполняется не только диагностика, но и лечение больных зародышей. Особенностью ЭКО является очень высокая частота многоплодных беременностей. Если при естественном зачатии рождается одна двойня на 70 - 80 родов, одна тройня на 9000 родов и одна четверня на 50 000 родов, то после ЭКО многоплодие, включая двойни, тройни и четверни, встречается примерно в половине(!) всех беременностей. Хорошо известно, что много­плодие, особенно когда беременность больше, чем двумя плодами, создает высокий риск осложнений и для матери, и для ребенка, как в процессе бере­менности, так и родов. Сегодня разработаны способы удаления (редукции) "лишних" плодов (больше двух) под ультразвуковым контролем. На самом деле лишние плоды не удаляют, а путем введения специальных растворов добиваются того, что они перестают развиваться и постепенно рассасыва­ются. Эта процедура производится на 7 - 8-й неделе беременности и, как правило, не сопровождается угрозой выкидыша остальных плодов. Рассасы­вание лишних плодов может происходить и само по себе, без каких-либо вмешательств, также до 7 - 8 нед.
Имеются данные о возможности возникновения y человека таких «ошибок оплодотворения», как гино- и андрогенез. В программе ЭКО и ПЭ, к сожалению, присутствует возможность возникновения ряда грозных осложне­ний акушерско-гинекологического характера, которые существуют и в естественных условиях. Основное из них - внематочная беременность, которая может на­ступить, даже если маточные трубы у женщины непро­ходимы, а также в случае, если они удалены недоста­точно радикально (беременность наступает в культях труб). Вероятность наступления внематочной беременности в программе ЭКО и ПЭ 10,6%. Следует также знать, что нередко при лечении бесплодия методом ЭКО может иметь место такое осложнение как синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ). Синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ) - комп­лекс патологических симптомов, возникающих на фоне при­менения стимуляторов овуляции, характеризующийся зна­чительным увеличением яичников, иногда разрывом их и кровотечением; наличием выпота в брюшной и плевральной полостях, возникновением тромбоэмболий магистральных сосудов, многоплодной беременностью и пр. В последние годы, в связи с широким распространением лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотво­рения, включающего как первый этап стимуляцию супер­овуляции, СГЯ привлекает все большее внимание. Первые описания СГЯ появились еще в 40-х годах, S. Ridberg сооб­щил о значительном увеличении яичников после примене­ния гонадотропинов. В 1962 г. A. Southan, N. Ivanovsky опубликовали случаи СГЯ после приема значительных доз кломифена: в 1970 г. описаны случаи СГЯ при комбинированной терапии кломифеном и гонадотропинами [Ro­land M.]. Е. Raban и соавт. в 1967 г. предложили классификацию СГЯ, которой пользуются до сих пор все клиницисты: • легкая форма, • средней тяжести, • тяжелая. Данные о частоте СГЯ приводит Н. Li в 1993 г. в сборни­ке, посвященном условиям репродуктивной медицины: — частота легкой формы достигает 23%, — средней тяжести - 10%, — тяжелой - 2%. J. Shenker, D. Weinstein расширили и детализировали классификацию, выделив в каждой из трех форм еще две степени. Легкая форма: 1-я степень - клиническая симптоматика отсутствует, со­держание эстрадиола в плазме более 150 мкг, в моче прегнадиола выше 10 мг;2-я степень - к этим биохимическим изменениям присоеди­няется увеличение яичников до 5 см в диа­метре. Форма средней тяжести: 3-я степень - боли, чувство тяжести внизу живота и изме­нения, описанные во 2-й степени; 4-я степень - присоединяется тошнота, рвота, понос, разме­ры яичников - более 5 см в диаметре. Тяжелая форма: 5-я степень - к описанным симптомам присоединяется асцит, гидроторакс, яичники более 12 см в диаметре; 6-я степень - состояние крайне тяжелое, помимо асцита и гидроторакса развивается гиперкоагуляция, уменьшается перфузия почек, осложняющая­ся олигурией и почечной недостаточностью, яичники резко увеличены, отмечают их раз­рывы и перекрут. Суммируя представленные данные, можно сказать, что, по-видимому, используемые в программах вспомогатель­ной репродукции способы гормональной стимуляции фолликулогенеза и овуляции вносят свой вклад в уве­личение числа таких ошибок. Гибель зародышей в процессе имплантации может быть обусловлена пере­численными выше причинами, недостаточностью вто­рой фазы цикла (изначально существовавшей или воз­никшей в процессе овариальной стимуляции), а так­же, возможно, особенностями становления иммунологических отношений эмбриона с организмом матери, вследствие отсутствия трубного периода развития, в который эти отношения начинают активно устанавли­ваться («фактор ранней беременности» и т.п.). Трудно оценить влияние на гаметогенез и оплодотво­рение чисто внешних (экологических, антропогенных, социокультурных и т. п.) факторов. Однако они, безус­ловно, также вносят свой вклад в патологию раннего развития. Таким образом, в большинстве случаев пренатальные потери и приводящая к ним патология у эмбрио­нов при использовании методов вспомогательной ре­продукции возникают не необходимо и не случайно, а под влиянием определенных факторов, в том числе и приводящих к нарушению регулирующих репродук­тивный процесс механизмов. Элиминация же ано­мальных гамет, зигот и эмбрионов - процесс как не­обходимый, так и закономерный, направленный на сохранение постоянства генотипа популяции. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проблема бесплодия возникла отнюдь не сегодня, она сопровождает человечество еще с древних времен. Современная медицина достаточно глубоко изучила причины возникновения женского и мужского бес­плодия. Разработаны как лекарственные, т.е. консер­вативные, методы терапии бесплодия, так и оператив­ные. Однако неудовлетворенность достигнутыми резуль­татами привела к разработке нового метода лечения бесплодия - ЭКО и ПЭ, который быстро завоевал по­зицию лидирующего в этом направлении. В данной работе представлены основные проблемы программы ЭКО и ПЭ и возможные осложнения, возникающие на различных ее этапах. Хотя применение метода ЭКО и ПЭ не позволяет в целом решить возникшую в стране критическую де­мографическую ситуацию, тем не менее широкое внедрение его в практику здравоохранения поможет избавиться от бесплодия сотням тысяч супружеских пар, а следовательно, осуществить также их психоло­гическую реабилитацию. В заключение необходимо отметить, что благодаря успехам программы ЭКО достигнуты положительные ре­зультаты в фундаментальных исследованиях челове­ческих гамет и эмбрионов. ЛИТЕРАТУРА 1. Экстракорпоральное оплодотворение и его новые направления в лечении женского бесплодия (теоретические и практические подходы): Руководство для врачей / Под. ред. В.И.Кулакова, Б.В.Леонова – М., 2001, 782 с. 2. Никитин А.И., Китаев Э.М., Савицкий Г.А., Иванова Р.Д., Калашникова Е.П. и Устинкина Т.И. Экстракорпоральное оплодотворение у человека с последующей имплантацией эмбриона и рождением ребенка. Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. – Л., 1987, Т.93, вып.10, с.39-43.
3. Аншина М.Б., Здановский В.М. Если вам нужен ребенок… – М., 1998, 32с. 4. Пшеничникова Т.Я. Бесплодие в браке. – М., 1991, 320с. 5. Сметник В.П Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология. Руководство для врачей. – М. 1999, с.476-480. * Для отмывки спермы могут использоваться различные среды, однако они должны быть забуферены HEPES и содержать сыворо­точный-альбумин (10%), необходимый для капацитации сперма­тозоидов.