Биосинтетическое получение дейтериймеченного L-фенилаланина

Биосинтетическое получение деитериймеченного L-фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium rnethylicum На примере L-фенилаланинсекретирующего мутанта Brevibacterium methylicum продолжены исс¬ледования по использованию метилотрофных бактерий для биосинтетического получения амино¬кислот, меченных стабильными изотопами. Представлены данные по адаптации L-фенилаланин¬секретирующего метилотрофа

В, methylicum к максимальной концентрации дейтерия в среде: 98% D2O и 2% CD3OD по объему. Разработанный метод позволяет получать изотопно-меченный L-фенилаланин разной степени изотопного обогащения, вплоть до полной замены атомов водорода на дейтерий, что подтверждено данными масс-спектрометрического анализа. Контроль биосинте¬тического включения дейтерия в секретируемые аминокислоты был осуществлен с использованием

производных типа метиловых эфиров N-дансил-аминокислот и последующей масс-спектрометрией электронного удара. Метилотрофные бактерии — группа микроорга¬низмов, способных расти на метаноле и других восстановленных производных углерода, являются весьма притягательными биотехнологическими объ¬ектами, возможности практического применения ко¬торых реализованы явно недостаточно [1, 2]. Одним из наиболее важных направлений работ с метилотрофными микроорганизмами являются исс¬ледования,

направленные на поиск или конструиро¬вание новых продуцентов аминокислот и других биологически активных соединений. В плане нача¬тых исследований по получению аминокислот, ме¬ченных стабильными изотопами [3 — 6], практиче¬ский интерес представляет использование метилот-рофов, особенно продуцентов аминокислот для пол¬учения целевых соединений за счет биоконверсии низкомолекулярных меченых субстратов. Традици¬онным подходом при этом остается селекция проду¬центов биологически активных соединений (БАС)

[7,8]. Безусловно, наиболее целесообразным является использование облигатных метилотрофов, которые способны ассимилировать меченые Ci-субстраты в качестве единственного источника углерода [9]. Как было показано на примере L-лейцинсскретирущего облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum, полная замена в среде метанола на его 13С-аналог практически не сказывается на величине лаг-фазы и уровне накопления биомассы, а степень биосинте¬тического изотопного обогащения

характеризуется главным образом изотопной чистотой 13Ci-субстра¬та [3]. Известно, что исчерпывающее биосинтетическое обогащение дейтерием бактериальных микроорга¬низмов при высоких концентрациях изотопа в среде может вызвать ингибирование биосинтеза клеточ¬ных протеинов и тем самым замедлить бактериаль¬ный рост [10]. В отличие от микроводорослей [11], бактерии весьма чувствительны к высокому содер¬жанию дейтерия в среде и, как правило, не способны выдерживать концентрации оксида

дейтерия более чем 75 % [4, 12]. В связи с этим разработка способов возможной адаптации метилотрофных микроорга¬низмов к максимальному содержанию дейтерия в среде представляется очень актуальной. Целью данной работы было исследование динами¬ки роста микробной биомассы и секреции деитерий¬меченного L-фенилаланина лейцинзависимым му- тантом В. methylicum за счет биоконверсии дейтеро-метанола на средах с тяжелой водой разного уровня дейтерирования. УСЛОВИЯ

ЭКСПЕРИМЕНТА Бактериальные штаммы. Исследования проводи¬ли с факультативным лейцинзависимым (макси¬мальная потребность в L-лейцине — 100 мкг/мл) метилотрофом В. methylicum, продуцентом L-фе¬нилаланина, полученным из коллекции культур ВК ПМ НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ В 5652). Исходный штамм поддерживали на агаризованной (2 %-ный агар) среде

М9 [13] с метанолом (2 %). Штаммы хранили в водном 70 %-ном растворе глицерина при -10°. Адаптированный к максимальному содержанию дейтерия в среде лейциновый ауксотроф В. met¬hylicum был получен в серии пассажей с последова¬тельным отбором хорошо растущих клонов на ага-ризованных средах (с 2 % СDзОD по объему), содержащих ступенчатое увеличение концентрации дейтерия (начиная с нсдсйтерированных сред, вплоть до полной замены воды и метанола на их дсйтери-рованные аналоги).

Адаптированный к дейтерию штамм В. methylicum поддерживали на агаризованных средах М9 (см. выше) с максимальным содержанием дсйтеро-ком-понентов. Для приготовления питательных сред с различным содержанием СОзОО и D2O использовали соли марки «х. ч.», D2О (99,9 % D) и CD3OD (99,6 % О), получе¬нные из Всесоюзного центра «Изотоп» (Санкт-

Пе¬тербург, РФ), а также L-лейцин (Reanal, Венг¬рия). Для получения производных аминокислот использовали Н-диметиламинонафталин-5-сульфо-хлорид (дансилхлорид) (Sigma, США) и диазометан. Для получения диазометана применяли N-нитрозо-метилмочевину, закупленную у Merck (Германия).

Посевной материал выращивали до ранней фазы экспоненциального роста бактериальной культуры на средах разного уровня дейтерирования, затем вносили в ферментационные среды с соответствую¬щим изотопным насыщением D2O и СОзОD (табли¬ца) в количестве 5 об. % и культивировали, как описано ниже. Выращивание посевного материала и фермента¬цию проводили на синтетической среде М9 [13] с десятикратным избытком NH4C1 (так как в предва-

Влияние изотопного состава питательной среды на величину лаг-фазы, выход биомассы и время генерации В. methylicum Номер опыта Компоненты среды, об. % Лаг-фаза, ч Выход биомассы, % от контрольного Время генерации, ч Н20 D20 CHjOH CD3OD 1 98 0 2 0 24 100 2,2 2 98 0 0 2 30 92 2,4 3 73,5 24,5 2 0 32 90 2,4 4 73,5 24,5 0 2 35 86 2,6 5 49 49 2 0 40 70 3,0 6 49 49 0 2 44 60 3,2 7 24,5 73,5 2 0 46 56 3,5 8 24,5 73,5 0 2 49 47 3,8 9 0 98 2 0 60 33 4,4 10 0 98 0 2 64 30 4,8 Данные приведены для В. methylicum, не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия. рительных

экспериментах по оптимизации состава питательных сред показано, что такое увеличение концентрации хлористого аммония в среде стимули¬рует биосинтез L-фенилаланина несмотря на неко¬торое увеличение продолжительности лаг-фазы) и L-лсйцином. После стериллизации рН доводили до величины 7,0—7,2 при помощи NaOH. В качестве источника углерода использовали метанол (2 % от объема среды) или его дейтериймеченный аналог. Культивирование бактерий проводили при 37° в условиях интенсивной аэрации растущей культуры

в колбах емкостью 750 мл с наполнением 100 — 150 мл среды. Морфологию клеток В. methylicum иссле¬довали с помощью поляризационно-интерфсрснци-онного микроскопа «Biolar» (Польша). Рост культу¬ры контролировали на спектрофотометре «Beckman DU 6» (США) при X 620 нм. Все эксперименты по биосинтетическому включе¬нию дейтерия проводили параллельно с контроль¬ным (см. таблицу) на стандартной недейтерирован-ной среде.

Для каждого эксперимента по биосинтетическому введению дсйтериевой метки в В. methylicum клетки на ранней фазе экспоненциального роста осаждали центрифугированием (10000 мин"1, 5 мин). После отделения биомассы супернатант лиофилизовали. Сухой остаток супернатанта, содержащий фенила-ланин, переводили в метиловые эфиры N-дансил-производных аминокислот, как описано в работе [3].

ТСХ осуществляли на пластинках «Silufol» (Че-хо-Словакия) в системах: (А) — изопропанол-амми¬ак (7:3) и (Б) — хлороформ-метанол-ацетон (7:1:1). Количественное определение секретируемого фе-нилаланина производили методом ТСХ на пластин¬ках «Silufol» в системе (А). Образцы КЖ объемом 10 мкл наносили на пластинки. Элюирование прояв¬ленных нингидрином пятен фенилаланина проводи¬ли 0,5 %-ным раствором хлористого кадмия в 50 %-ном этаноле.

Концентрацию аминокислоты опреде¬ляли спектрофотомстрически с использованием кри¬вой корреляции при X 540 нм. Очистку метиловых эфиров N-дансил-производ¬ных аминокислот из КЖ, содержащей дейтерий, осуществляли с помощью колоночной (150 х 40 мм) хроматографии на силикагеле L 40/100 (Chemapol, Чехо-Словакия) с градиентной элюцией системой хлороформ-метанол (от 0 до 10 % метанола). Детекцию при ТСХ проводили 0,2 %-ным раство¬ром нингидрина в ацетоне.

N-Дансильные производ¬ные аминокислот идентифицировали в системе (Б) по характерной флуоресценции в УФ-свете. Аминокислоты идентифицировали сопоставлени¬ем их спектральных и хроматографичсских характе¬ристик с литературными данными [14], сравнением со стандартными аналогами, а также подтверждали данными масс-спсктрометричсского (МС) анализа их производных. Масс-спектры электронного удара производных аминокислот измерены на приборе МВ-80 A (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Как известно, большинство микроорганизмов, рас¬пространенных в природе, к которым относятся ме-тилотрофы, не могут служить хорошими продуцен¬тами ароматических аминокислот, вследствие нали¬чия эффективных механизмов регуляции биосинтеза этих соединений в микробной клетке, хотя эта спо¬собность появляется у ряда их мутантных форм [15 — 17]. Активными микробными продуцентами L-фснилаланина являются, как правило, мутанты, у которых снят негативный контроль со стороны таких ключевых

ферментов биосинтеза этой аминокисл¬оты, как префенатдегидратаза (ПД) и дезоксиара-биногептулозофосфатсинтстаза (ДАГФ-синтетаза) [18, 19]. Определенный интерес в связи с этим представляет исследование способности продуциро¬вать L-фенилаланин лейцинзависимым метилотроф-ным мутантом В. methylicum, достаточно удобным, хотя и малоизученным объектом для биотехнологи¬ческого применения. Поэтому начальный этап биохи¬мических исследований

В, methylicum был связан с получением ауксотрофных мутантов, для которых в большинстве случаях характерны ограниченный спектр мутантных фенотипов и кроме того довольно высо¬кий уровень реверсий [20 — 23]. Исходный лейцин-зависимый штамм В. methylicum, продуцент L-фени¬лаланина, был отобран в лаборатории генетики ме-тилотрофов НИИ генетики и селекции промышлен¬ных микроорганизмов на предыдущем этапе работы после обработки

В. methylicum нитрозогуанидином по устойчивости к аналогу фенилаланина мета-фторфенилаланину (50мкг/мл.). Выделенные таким образом аналогорезистентные мутанты конвертиро¬вали метанол и накапливали при этом фенилаланин в ферментационной среде. Сравнительные анализы аминокислоты методом тонкослойной хроматографии и масс-спектрометрии показали, что фенилаланин, секретиру-емый В. mcthylicum, полностью идентичен коммер¬ческому L-фенилаланину.

Мы изучали влияние степени замещенности дей¬терием низкомолекулярных субстратов воды и мета¬нола в составе питательных сред на рост полученного ауксотрофа, величину лаг-фазы и времени клеточ¬ной генерации (см. таблицу), а также секрецию дейтериймеченного фенилаланина. Продолжитель¬ность лаг-фазы, время генерации и максимальная секреция фенилаланина В. melhylicum в условиях изотопных экспериментов (см. таблицу, опыт 2, 4, 6, 8, 10) представлены на

гистограмме (рис. 1). Секреция , г/л Рис. 1. Характеристики бактериального роста В. methylicutn {выход биомассы, время генерации и максимальная секреция фенилала¬нина) на средах с изотопным составом, соответствующим номерам экспериментов 2, 4, 6, 8, 10 в таблице Как видно из представленных данных, в отсутст¬вие дейтериймеченных субстратов при росте исходной бактерии на протонированной среде продолжитель¬ность лаг-фазы не превышала 24 ч (см. таблицу, опыт 1).

С увеличением содержания тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64 ч на средах с 98 % D2O и 2 % CD3OD по объему (см. таблицу, опыт 10). Если замена метанола на его дейтерированный аналог не вызывала существенного ингибирования роста бактерий и не сказывалась на выходе микробной биомассы, то на средах с высоким содер¬жанием оксида дейтерия микробный рост был замет¬но подавлен. Вследствие этого в экспериментах, где оксид дейтерия преобладал в среде

(см. таблицу, опыт 9, 10), выход биомассы был значительно ниже, чем в контрольных экспериментах и в тех случаях, когда использовали простую воду и дейтеро-метанол (см. таблицу, опыт 2). Как видно, длительность времени генерации бактериальной культуры с уве¬личением изотопного насыщения среды дейтерием увеличивается. Из данных таблицы видно, что про¬должительность лаг-фазы и время клеточной гене¬рации бактерии при переходе со стандартной на дейтерированные среды находятся в определенной корреляции.

Так например, в условиях эксперимента 10 продол¬жительность лаг-фазы увеличивается в 2,6 раза, а время генерации возрастает в 2,2 раза. С целью увеличения эффективности изотопного мечения клеточных БАС и аминокислот и интенси¬фикации роста метилотрофа на полностью дейтерированных средах мы адаптировали полученный му¬тант В. methylicum к максимальному содержанию дейтерия в среде культивирования. Для этого были проведены пять серий адаптационных пассажей на агаризованных средах (с 2 %

СD3ОО по объему) при ступенчатом увеличении концентрации оксида дей¬терия в них (см. таблицу). Последовательно отбира¬ли наиболее продуктивные по уровню накопления дейтерированной биомассы клоны В. methylicum и пересевали их на среды с большей степенью дейтерирования, вплоть до полной замены воды и мета¬нола на их дейтерированные аналоги (выживаемость на полностью дейтерированных средах не более 40 %). Полученный в результате ступенчатого отбора шта¬мм

В. methylicum, адаптированный к дейтерию, пе¬реносили затем с максимально насыщенных дейте¬рием агаризованных сред на жидкие среды М9, приго¬товленные исключительно из 98 % D2O (99,9 % D) и содержащие 2 % СОзОD, и культивировали, как описано в эксперименте. Динамика роста бактерии В. mеthylicum, адаптированного к высокому содержанию дейтерия в среде, и способ¬ность секретировать L-фенилаланин в условиях мак¬симально насыщенных дейтерием сред представлены на рис.

2. дО время, ч Секреция Рис. 2. Динамика роста В. methylicum (la, 10'а, 10d) и секреция фенилаланина (16, 10'б, 10б) на средах с изотопным составом, соответствующим номерам эксперимента в таблице: I а,б — исходный метилотроф на стандартной среде М9; 10'а,б — адап¬тированный к высокому содержанию дейтерия В. melhylicum на полностью дейтерированной среде; 10 а,б — неадаптированный метилотроф на полностью

дейтерированной среде Выход биомассы, время генерации и максималь¬ная секреции фенилаланина исходным мутантом (10) и мутантом, адаптированным к высокому содер¬жанию дейтерия в среде (10'), на средах, максималь¬но насыщенных дейтерием, приведены в гистограм¬ме на рис. 3 относительно контрольного (У). Срав¬нивали ростовые данные адаптированного к дейте¬рию метилотрофа и секрецию фенилаланина (опыт 10') с исходным В. methylicum на стандартной среде

М9 (опыт I) и на полностью (98 % D2О) дейтери¬рованных средах с 2 % CD3OD (опыт 10). Как видно из графиков на рис. 2, степень заме¬щенности дейтерием воды и метанола не оказывает м • и биомассы, % 0тк0нтрол»н<?го L-Ptic, г/л Время Рис. 3. Выход биомассы, время генерации и максимальная сек¬реция фенилаланина на средах с изотопным составом, соответст¬вующим номеру эксперимента в таблице:

10 — исходный метилотроф; 10' — адаптированный к высокому содержанию дейтерия В. me¬thylicum; 1 — исходный метилотроф на стандартной недейтери-рованной среде значительного влияния на секрецию фенилаланина, в то время как выход микробной биомассы на дей-терированной среде значительно уменьшается. Не¬значительное снижение уровня секреции фенилала¬нина (до 0,5 г/л) наблюдалось лишь в изотопных экспериментах (см. рис. 2, 10 б), когда использовали исходный метилотроф на средах с максимальным

насыщением дейтерием. Уровень накопления микро¬бной биомассы адаптированным метилотрофом на полностью дейтерированной среде выше, чем для исходного В. methylicum (см. рис. 2, 10 а) , несмотря на двухкратное увеличение продолжительности лаг-фазы (рис. 2, опыт 10' а), в то время как секреция фенилаланина у адаптированного метилотрофа су¬щественным образом не отличалась от таковой на недейтерированной среде.

В отличие от адаптиро¬ванного к дейтерию В. methylicum, рост исходного мутанта на полностью дейтерированной среде с 98%-ной тяжёлой водой сильно ингибируется дейтерием (см. рис. 2, 10 и). Как видно из рис. 3, время клеточной генерации для адаптированного метилотрофа (2,5 ч) близко к исходному на стандартной среде. Несложный селек¬ционный подход позволил получить штамм В. met¬hylicum, способный конвертировать дейтеро-метанол на максимально насыщенных дейтерием средах

в клеточные БАС и секретирусмый L-фенилаланин. При этом выход фенилаланина у адаптированного мутанта не сократился (см. рис. 2). Таким образом, было показано, что некоторые виды метилотрофных бактерий, например, факультативный метилотроф В. methylicum, в принципе могут быть адаптированы к высокому содержанию дейтерия в среде без потери ростовых и биосинтетических способностей бактери¬альной культуры. Механизм биосинтеза L-фенилаланина В. methy¬licum и роль лейцина в этом процессе не объяснены окончательно.

Что же касается самого фенилаланина, то он, как известно, синтезируется в клетках микроорганизмов и, в частности, в коринебактериях из своего предше¬ственника — префеновой кислоты, которая через стадию образования фенилпирувата превращается в фенилаланин под действием клеточных трансаминаз [24 — 26] . Продолжая обсуждать механизм секреции фени¬лаланина этим метилотрофом следует отмстить, что общей особенностью сскретируемой целевой амино¬кислоты было значительное увеличение ее проду¬кции на ранней фазе экспоненциального

роста В. mehtylicum, когда выход микробной биомассы был незначителен (см. рис. 2). Затем во многих экспери¬ментах наблюдалось, как правило, ингибирование биосинтеза фенилаланина на поздней фазе экспо¬ненциального роста и снижение его концентрации в среде. Как показали микроскопические наблюдения за растущей популяцией микроорганизмов, подо¬бный характер динамики секреции фенилаланина не коррелирует с качественными изменениями росто¬вых характеристик культуры

на различных стадиях роста, что служит подтверждением морфологической однородности микробной популяции. По-видимому, накопленный в процессе роста фенилаланин ингиби-ровал ферменты собственного пути биосинтеза. Кро¬ме того, как показано еще на других микробных продуцентах L-фенилаланина! при культивирова¬нии микроорганизмов без рН-статирования не иск¬лючено обратное превращение экзогенного фенила¬ланина в интермедиаторные соединения его биосин¬теза [25, 26].

Кроме основной сскретируемой ами¬нокислоты в среде, как правило, присутствуют сле¬довые количества других аминокислот (аланин, ва-лин, а также тирозин и триптофан) и других мета¬болитов, четко детектируемых масс-спектрометри-чсским анализом [3]. Степень биосинтетического обогащения секрети-руемого L-фенилаланина была определена масс-спе¬ктрометрическим анализом метиловых эфиров N-дансильных производных аминокислот методом эле¬ктронного удара.

Согласно сравнительным данным масс-спектрометрического анализа производных на-тивного и дейтерироваиного фенилаланина со сред разного уровня дейтерирования (см. таблицу), сте¬пень биосинтетического включения дейтерия в мо¬лекулу фенилаланина коррелирует с концентрацией дейтерия в среде. Так например, в масс-спектре дейтерированного производного фенилаланина (мо¬лекулярная масса недейтерированного соединения 412), полученного из В. methylicum в условиях мак¬симального насыщения среды дейтерием (см.

табли¬цу, опыт 10), четко детектируется высокоинтенсив¬ный пик молекулярного иона с m/z 420 (М+ + 8) и менее интенсивный пик с примесью m/z 419 (М.++ 7). Предварительные данные свидетельствуют о высо¬кой степени включения дейтерия в молекулу фени¬лаланина в условиях полной замены воды и метано¬ла на D2О и СDзOD, что составляет (с учетом точности метода) 7-8 атомов из 8 детектируемых по скелету молекулы.

При этом лсгкообмсниваемые атомы D(H) амино- и карбоксильной групп не рас¬сматриваются. Основными преимуществами В. methylicum, адап¬тированного к максимальному содержанию дейтерия в среде и способного конвертировать дейтеро-мета¬нол для получения униформно дсйтерированных аминокислот и белка (в отличие от некоторых тра¬диционных способов с использованием других мик¬робных продуцентов [27, 28] и микроводорослей [29]) являются хорошие ростовые и биосинтетиче¬ские способности этого метилотрофа

на максимально дейтерированных средах. При помощи адаптированного штамма В. met¬hylicum можно достаточно быстро наработать в ла- бораторных условиях граммовые количества уни¬формно меченного дейтерием L-фенилаланина. Та¬ким образом, использование в прикладных целях полученного в настоящей работе мутанта В. met¬hylicum, адаптированного к полностью дейтериро-ванным средам, содержащим тяжёлую воду и дейтеро-метанол и, в частности, для биосинтетическо¬го получения фенилаланина разной степени

обогащенности дейтерием {вплоть до полной замены всех атомов водорода на дейтерий) является весьма эффективным, В заключение следует отметить, что более высо¬кая эффективность изотопного мечения клеточных БАС может быть обеспечена путем полной замены протонированных компонентов среды на их дейтери-рованные аналоги, а также используя лейцин, уни¬формно меченный дейтерием, который в принципе можно получать из гидролизатов тотального белка биомассы этого метилотрофа.

Анализ биосинтетиче¬ского включения дейтерия в аминокислоты тоталь¬ного белка биомассы будет опубликован отдельно. Авторы выражают благодарность ст. н. с. ВНИЦ молекулярной диагностики О. С. РешетовоЙ за уча¬стие в получении масс-спектров изучаемых образцов производных аминокислот. ЛИТЕРАТУРА 1. Романовская В. А 2. Мохамед эль Сайд II Микробиология. — 1986. — Т. 48. — № 2. — С. 97 — 107. 2.

Никонова Е. С Доронина Н. В Троценко Ю. А. II Прикл. биохим. и микробиол. — 1986. — Т. 22. — С. 557 — 561. 3. Karnaukhova Е. N Resheiova О, S Semenov S. I. et al. // Amiiio Asids. — 1993. — V. 4. — P. i — 14. 4. Skladnev D. A Baev M. V Shilova S. Ун. // Proceedings of 6th Europ. Conf. on Biomass for

Energy, — Industry and Enviroment. — Athens. — 1991. — P. 47 — 51. 5. Skladnev D. A Reshetova O. S. II J. Pharm. Belg. — 1992. — V. 47. — № 3. — P. 216. 6. Pshenichnicova А. В Reshetova O. S. it Abstr. of 4th International Meeting on Bio-Chroma to graphy and Molecular Biology. —

La Grand Motte. France, 1992. — № 63. 7. Tsygankov Y. D Kasakova S. M. (I Arch. Microbiol. — 1987. V. 149. — P. 112 — 119. 8. Stone S Goodwin P. M. II J. General Microbiol. — 1989. — V. 135. p. 227 235. 9. Patent USA № 0220951, 1988. 10. Borek E Rittenberg D. II Proc.

Natl. Acad. ScL — 1960. — V. 46. — P. 777. 11. Keiko Vnno Hiroki Busujima Shegeki Shimba. // Chem. Pharm. Bull. — 1988. — V. 36. — № 6. — P. 1828 — 1833. 12. Papadimitriou C Wenzei M. II Z. Naturforsch. — 1989. — V. 44. — S. 1053 — 1057. 13. Миллер Дж. II Эксперименты в молекулярной генетике. —

М-: Мир, 1976. — С. 393. 14. Боллигер X. Р Бреннер М Шпшль Э. И Хроматография в тонких слоях. — М.: Мир, 1965. — С. 395 — 408. 15. Shiio Jsamu. II Biotechnol. Amino Acid Prod. — Токио, 1986. — P. 188 — 206. 16. Максимова И. П Олехнович И. II. Регуляция биосинтеза ароматических аминокислот у метилотрофных бактерий:

Биохимия и физиология метилотрофов. — Пущино, 1987. —С. 77 — 85. 17. KadziM. etal.// ActaBiotechnol. — 1990. — V. 10. _№ 1.— Р 93 — 98. 18. Netrusov A. I Dikanskaja E. M Kulicova W. P. Biochemical specifity of asydophilik methylotrops: Abst. of 13 Intern. Cong. of Microbiol. USA. Boston.

August. 1982. — Boston: Academic press, 1982. —V. 1. — P. 61. 19. WunscheL Fischer II KieselB. II Z. Allg. Microb. — 1983. —P. 23. — № 3. — S. 189 — 196. 20. Noon D. M, Lindstrom M. E. II J. Bacteriol. — 1986. —V. 166. — P. 581 —590. 21. Levering P. Д Tiesma L Woldedorp

J, P. et al. // Arch. Microbiol. — 1987. — V. 146. — P. 346 — 352. 22. КлецоваЛ. В Говорухина Н. И. и др. // Микробиология. — 1987. — Т. 56. — Вып. 6. — С. 901 — 906. 23. Whitta S Sinclair M. I Holloway В. W. II J. Gen. Microbtol. — 1985. — V. 131. — P. 1547 — 1549. 24. Fazel A. M. et al. //

J. Bacteriol. — 1979. — V. 138. — P. 805 — 815. 25. Stenmark S. L Pierson D. L Glover G. I. et al. // Nature (London). — 1974. — V. 247. — P. 290 — 292. 26. Ворошилова Э. Б Гусяпшнер М. М Жданова II. И. и др. // Биотехнология. — 1989. — Т. 5. — № 2. — С. 137 — 141. 27. Рувинов С. В Сапоровская

М, В Беликов В. М. II Изв. Акад. наук. — 1989. — № 10. — С. 2341 — 2343. 28. Сох J Kyle D Radmer R. et al. // Trends. Biotechnol. — 1988. — V. 6. — P. 279 — 282. 29. Crespi II. L. Synth, and Appl. Isot. Labeled Compounds. Proc. 2nd Int. Symp 3-6. Sept. 1985. — Amsterdam,

Oxford, N Y Tokyo: Elscvier, 1986. — P. Ill — 112. O. V. MOSIN, E. N. KARNAUKHOVA, A. B. PSHENICHNIKOVA, D. A. SKLADNEV, O. L. AKIMOVA Moscow Institute of Fine Chemical Technology, 117571 Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms, Moscow, 113545

Biosynthetical Preparation of D-Labeled L-Phenylanine Produced by Methylotrophic Mu¬tant Brevibacterium methylictim Using L-phenylalanine producing mutants B. methylicum the study on application of methylotrophic bacteria to the biosynthetic production of amino acids labeled with stable isotopes was developed. The data are presented on the adaptation of phenylalanine producing methylotroph

B. methylicum to maximal deuterium concentration in medium: 98 per cent D2O and 2 per cent CD3OD (v/v). The method developed enables to obtain deuterium labeled L-phenylalanine with various content of isotope up to complete substitution of hydrogene by deuterium which is approved by means of mass spcctrometry. The biosynthetical introduction of deuterium into produced amino acids was valued with the use of electron impact mass spectrometry of the methyl ethers of

N-dansyl amino acids derivatives.