Реакции лимфоцитов на механические и осмотические
воздействия при водной депривации
М.З.Федорова, В.Н. Левин
Критериями,
характеризующими состояние белых клеток крови являются показатели их
функциональной активности и сопротивляемости различным факторам. Причем,
последнее свойство часто бывает более информативным показателем, т.к. угнетение
функций может происходить при далеко зашедшей деструкции клеток, имеющей
необратимый характер [ 1] . Особенно важное значение это положение имеет при
анализе механизмов адаптации организма к экстремальным факторам среды.
Целью
проведенного исследования было изучение реакций лейкоцитов на механические и
осмотические воздействия в условиях дегидратации организма.
МЕТОДИКА
Опыты
проведены на 48 беспородных белых крысах-самцах массой 370-420 г. Животных
экспериментальных групп лишали воды при свободном доступе к сухому корму [ 4] .
Оценку осмотической стойкости, осморегуляторных и деформационных реакций вели
на 3, 6 и 10 сутки безводного содержания. Контролем служили интактные животные.
Для
исследований использовали суспензию лейкоцитов в изотоническом забуференном
растворе (раствор Дюльбекко), состоящую на 95-98% из лимфоцитов. Осмотическую
стойкость, регуляторные возможности и мембранный резерв изучали, используя
комплексный метод, подробно описанный ранее [ 6] . Суть метода сводится к
следующему. Лейкоциты помещали в растворы хлорида натрия разной концентрации
(0,9%; 0,45%; 0,2%). Время экспозиции в гипотонических растворах составляло 60
с и 1 ч. Данные по изменению морфометрических параметров клеток после инкубации
в 0,45% растворе использовали для оценки регуляторных возможностей. Мембранный
резерв определяли по изменениям площади поверхности лейкоцитов после
60-секундной инкубации в 0,2% растворе хлорида натрия. Расчеты объема и площади
поверхности по стандартным формулам для шаровидных тел вели на основе измерения
диаметра 50-60 клеток, фиксированных глутаровым альдегидом, помещенных на
предметное стекло и окрашенных азур-эозином. Осмотичскую стойкость выражали
числом (%) клеток сохранившихся после часовой экспозиции в 0,2% растворе
хлорида натрия.
Для
оценки деформационных свойств за основу была взята методика Tran-Son-Tay R. с
соавт. [ 7] . Капилляры, диаметром 4 мкм заполняли изоосмотическим буфером и
соединяли с манометром. Перемещение клеток к капилляру и в капилляре
обеспечивалось постоянным во всех опытах отрицательным давлением (100 мм рт.
ст.). Все манипуляции проводили в микрокапилляре на предметном столике
микроскопа. Для наблюдений и замеров использовали объектив 40 ВИ и
окуляр-микрометр МОВ-1-15* . После регистрации для каждой клетки первичных
параметров (диаметр лейкоцитов в исходном состоянии, длина и ширина
деформированной клетки, время восстановления до исходной формы) рассчитывали
площадь поверхности и объем покоящихся и деформированных лейкоцитов. Для
каждого животного было обсчитано 40-60 клеток.
Все
полученные данные обработаны статистически. Достоверность различий опрделялась
по критерию t Стьюдента.
Результаты исследования
Проведенное
исследование показало, что к 3-м суткам дегидратации происходило существенное
уменьшение размеров лейкоцитов крови. В дальнейшем (6-10 сутки) за счет
включения регуляторных механизмов клеточный объем восстанавливался до уровня
интактных животных (табл. 1).
Умеренная
гипоосмотическая нагрузка (60 с в 0,45% растворе хлорида натрия) приводила к
достоверному увеличению объема лимфоцитов у контрольных животных, а также на 6
и 10-е сутки безводного содержания (18¸ 32%, р 0,05). Высокий
осмотический градиент (60 с в 0,2% растворе хлорида натрия) вызывал достоверное
увеличение размеров клеток у всех животных (табл. 1). Однако, в контрольной
группе изменения объема лимфоцитов были значительно больше, чем в
экспериментальных (54% против 19¸ 32%, р
Таблица
1
Размеры
лимфоцитов, инкубированных в растворах хлорида натрия разной осмолярности
Концентрация раствора, время
инкубации
Группа
0,9%
0,45%, 60 с
0,45%, 1 ч
0,2%, 60 с
Контроль
5,2± 0,05
(74)
5,7± 0,07°
(97)
5,3± 0,07
(78)
6,0± 0,1°
(113)
3 сутки
дегидратации
5,0± 0,06*
(65)
5,2± 0,1*
(74)
4,9± 0,05*
(62)
5,3± 0,07* °
(78)
6 сутки
дегидратации
5,3± 0,07
(78)
5,6± 0,07°
(92)
5,3± 0,06
(78)
5,8± 0,06°
(102)
10 сутки
дегидратации
5,2± 0,06
(74)
5,5± 0,06* °
(87)
5,2± 0,08
(74)
5,7± 0,07* °
(97)
Примечание.
В таблице представлены значения диаметра клеток (мкм). В скобках - объем
лейкоцитов (мкм3). Звездочкой обозначена достоверность различий по сравнению с
параметрами клеток контрольных животных (р
Кинетика
объема клеток при увеличении времени инкубации в 0,45% растворе хлорида натрия
до 1 ч была примерно одинаковой у животных всех групп (табл. 1). Диаметр
лимфоцитов уменьшался на 8,4% (р
Динамика
осмотической стойкости лимфоцитов на разных стадиях обезвоживания организма
отличалась от фазных изменений объема. С увеличением сроков водной депривации
осмотическая стойкость лейкоцитов возрастала, достигая достоверных различий по
сравнению с контролем к 10 суткам (контроль - 70± 7%; 3 сутки дегидратации- 69±
5,5%; 6 сутки - 76± 5,9%; 10 сутки - 95± 2,2%).
Изучение
деформационных реакций лейкоцитов проводилось на живых клетках, помещеных в
изотоничную среду. Несмотря на то, что глутаровый альдегид считается
фиксатором, сохраняющим прижизненное состояние клетки [ 3] , морфометрические
показатели, замеренные для оценки осморегуляторных реакций оказались ниже, чем
полученные в данных опытах. Значение диаметра лимфоцитов до деформации были
7,0-7,5 мкм. Различия результатов измерений возможно вызваны влиянием
иммерсионной среды (солевой раствор) и материалом микрокамеры при изучении
деформабельности, либо глутарового альдегида при оценке объемных изменений в
гипотонических растворах. Несмотря на имеющиеся различия абсолютных значений
первичных параметров, динамика их изменений позволяет оценить сопротивляемость
лейкоцитов механическим воздействиям и сопоставить с данными по осморегуляции.
Таблица
2
Деформационные
изменения и время восстановления исходной формы лейкоцитов на разных стадиях
обезвоживания организма
Группа
Р1
мкм2
Р2
мкм2
V1
мкм3
V2
мкм3
Т
с
Контроль
172± 5,6
232± 10,9°
224± 11,7
222± 11,5
70± 3,9
3 сутки
дегидратации
165± 5,3
220± 10,3°
211± 10,8
210± 10,7
71± 4,5
6 сутки
дегидратации
162± 4,2
217± 8,3°
202± 8,4
200± 8,3
92± 4,1*
10 сутки
дегидратации
165± 4,3
217± 8,6°
207± 9,2
204± 8,9
94± 3,7*
Примечание.
Р1 - исходная площадь поверхности клеток; Р2 - площадь поверхности
деформированных клеток; V1 -исходный объем клеток; V2 - объем деформированных
клеток; Т - время восстановления исходной формы лейкоцитов. Звездочкой
обозначена достоверность различий по сравнению с контрольной группой (р
Деформация
клеток при прохождении через микрокапилляр за счет приложения внешних сил
осуществлялась при постоянном объеме и увеличении площади поверхности (табл.
2). Используемый при этом "мембранный резерв" был фактически
одинаковым у животных всех групп и составлял 32-35%. Отмеченного выше
уменьшения объема циркулирующих клеток на 3 сутки дегидратации этой методикой
не выявлено. Важным показателем, позволяющим судить о функциональном состоянии
клеток является время восстановления исходной формы после деформации. Динамика
этой характеристики отражена в табл. 2. Сравнительная оценка использования
"мембранного резерва" при деформации лейкоцитов и при набухании в
средах с низкой осмолярностью показала, что в контрольной группе он
используется примерно в том же "количестве" (35% и 33%). У животных
экспериментальных групп превращение клеток из сферических в цилиндрические идет
за счет такого же "резерва" мембраны, что и у интактных животных, а объемные
изменения в гипотонических растворах выражены значительно слабее.
Обсуждение результатов
Анализ
полученных данных позволил установить, что при воздействии на лейкоциты
интактных животных осмотических и механических факторов включаются
ауторегуляторные механизмы. Они обусловливают эффективное использование
пластичных свойств цитоплазматической мембраны, других клеточных структур и
быстрое восстановление геометрической формы. Последнее имеет важное
функциональное значение, т.к. клеточный объем выполняет роль вторичного
посредника в регуляции относительной эффективности анаболизма и катаболизма [
5] . Водная депривация уже на первом этапе (3 сутки) ведет к ослаблению
реактивности изученной клеточной системы, о чем свидетельствуют меньшие
изменения объема в гипотонических средах. Длительное безводное содержание
животных сопровождается дезинтеграцией механизмов клеточной ауторегуляции. При
одинаковых с интактными животными исходных параметрах клетки и динамике
объемных изменений, выраженность последних значительно ниже. Параллельно
возрастает осмотическая стойкость и время восстановления до исходной формы
после деформации. Объяснением этих фактов могут служить данные об индукции в
клетке синтеза белков, увеличивающих устойчивость к различным факторам. При этом
повышается вязкость цитоплазмы вплоть до ее желатинизации. В основе
гелеобразования лежит полимеризация актина и образование трехмерной сети [ 1,2]
. Желатинизация цитоплазмы является паранекротическим сдвигом, но на обратимых
стадиях повреждения физиологические функции остаются на высоком уровне [ 1] .
Список литературы
[
1] Александров В.Я. Реактивность клеток и белки. Наука. Л. 1985.
[
2] Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной
системы. Наука. Л. 1987.
[
3] Дуглас С.Д., Куи П.Г. Исследование фагоцитоза в клинической практике.
Медицина. М. 1983.
[
4] Куприянов В.В., Магомедов М.А., Тихомиров А.Н. Состояние микроциркуляторного
русла брыжейки при экспериментальной дегидратации. Арх. анат. 77 (8): 5-13.
1979.
[
5] Орлов С.Н., Новиков К.Н. Регуляция объема клеток: механизмы, сопряженные
клеточные реакции и патофизиологическое значение. Физиол. журн. им.
И.М.Сеченова. 82 (8-9): 1-15. 1996.
[
6] Федорова М.З., Левин В.Н. Метод комплексного исследования геометрии, площади
поверхности, резервных возможностей мембраны и осморегуляции лейкоцитов крови.
Клинич. лабор. диагн. (11): 44-46. 1997.
[ 7] Tran-Son-Tay R., Needham D.,
Yeung A., Hochmuth R.M. Time-dependent recovery of passive neutrophils after
large deformation. Biophys. J. Biophisical Society. 60: 856-866. 1991.
Для
подготовки данной работы были использованы материалы с сайта http://www.yspu.yar.ru/