Трансгенные растения как биопродуценты белков медицинского назначения

Успехи в области генетической инженерии растений открыли новые возможности для получения рекомбинантных белков. Для этой цели широко используются клетки бактерий, дрожжей, млекопитающих и насекомых. Однако такие системы имеют ряд существенных недостатков. В клетках прокариот не происходят посттрансля-ционная модификация и правильная укладка (фолдинг) полипептидных цепей многих эукариотических белков. Клетки дрожжей, млекопитающих и насекомых лишены подобных недостатков, но их использование в качестве биопродуцентов ограничено высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков (Russel, Clarke, 1999).

По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии растения имеют ряд особенностей и преиму-ществ. Прежде всего необходимо отметить, что в клетках высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковым в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует доро-гостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность реком-бинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний и широкого терапевтического использования. В отличие от животных, растительные клетки не содержат в своём составе патогенные для человека вирусы, а также прионы и, таким образом, могут служить безопасным источником рекомбинантных белков медицинского назначения. Хотя стоимость выделения и очистки целевого белка из растений-продуцентов может быть сопоставима с таковой для других систем, наработка сырого материала обходится значительно дешевле. В ряде случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве "съедобных вакцин" выделение белка в чистом виде не требуется. В дополнение ко всему перенос фраг-ментов экзогенной ДНК в растительный геном и регенерация у растений происходят значительно проще по сравнению с животными (Daniell et al., 2001).

Известно, что аппарат транскрипции и трансляции у растений является универсальным и может быть адап-тирован не только для накопления гомологичных белков, не синтезируемых данным видом растения, но и для синтеза гетерологичных белков как бактериального, так и животного происхождения. С другой стороны, сами растения in vivo могут служить благоприятной средой для развития различных организмов - бактерий и вирусов, геном которых может быть модифицирован и адаптирован для синтеза соответствующих гетерологич-ных белков. Анализируя данные литературы, необходимо отметить, что поиск различных систем для экспрессии чужеродных генов за последние десять лет был связан с развитием трёх основных подходов.

Первым из них был предложен путь использования трансгенных растений, в ядерный геном которых перене-сены гены, контролирующие синтез соответствующих гетерологичных белков (De la Riva, 1998). Получение таких растений было основано на природной способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть своей собственной ДНК в виде Т-области мегаплазмиды в растительные клетки. Именно эта часть Ti-плазмиды была использована учёными для переноса генно-инженерных конструкций, включающих различные целевые гены. В качестве целевых можно было использовать и гены гетерологичных белков меди-цинского назначения. Необходимо отметить, что использование только агробактериального переноса в значи-тельной степени сужало круг растений-реципиентов и ограничивало его, как правило, до двудольных. Поэтому дальнейшее развитие идеи использования растительного генома для синтеза гетерологичных белков стимули-ровало поиск новых способов переноса фрагментов экзогенной ДНК в геном растений. Были разработаны мето-ды прямой доставки чужеродных генов в растительный геном, такие, как микроинъекции (Neuhaus et al. , 1987), электропорация (Fromm et al. , 1985) и методы биобаллистики (Klein et al. , 1987). В этом слу-чае для переноса использовалась очищенная плазмидная ДНК, в которой содержались генетические конструк-ции с целевыми генами.

При переносе в геном растения чужеродные гены, как правило, стабильно интегрируются и передаются по-томкам в последующих поколениях согласно законам Менделя (Horsch et al., 1984; Budar et al. , 1986; De-roles, Gardner, 1988; Heberle-Bors et al. , 1988).

Хотя идея внедрения экзогенной ДНК в растительный геном для наработки соответствующих продуктов в растении представляется весьма перспективной, этот подход не лишен и некоторых недостатков. Среди них не-обходимо отметить низкий уровень экспрессии перенесенных генов, даже при использовании очень сильных промоторов. Содержание сывороточного альбумина человека в трансгенных тканях табака составило 0,02 % от суммарного белка (Sijmons et al. , 1990). Ещё меньшие значения были получены для эритропоэтина (0,003 %) и b-интерферона (0,001 %) (Edelbaum, 1992; Kusnadi et al. , 1997). Одной из причин этого, по-видимому, является увеличение скорости деградации мРНК чужеродно-го гена, когда её уровень достигает порогового значения. Этот механизм, возможно, служит одним из способов защиты растения от РНК-содержащих вирусов (Matzke et al. , 1994; Matzke M., Matzke A., 1995; Vaucheret, 2001). Второй причиной низкого уровня продукции является протеолиз чужеродных белков в цитоплазме расти-тельной клетки. Введение в полипептидную цепь целевого белка сигнальных последовательностей, направляю-щих его накопление в эндоплазматической сети или секрецию в апопласт, где частота протеолиза значительно ниже, позволяет достичь повышения продуктивности трансгенных растений в 100 раз (Giddings et al. , 2000; Menassa et al. , 2001). Экспрессия целевых белков в запасной ткани семян, где уровень биодеградации ниже, чем в обводнённых тканях (листья, плоды), способствует повышению продуктивности на 2-3 порядка. Так, содер-жание химерного энкефалина человека в семенах трансгенного A. thaliana составило 2,9 % от суммарного белка. Этого удалось достичь введением в полипептидную цепь энкефалина сигнальной последовательности глю-телина (запасного белка риса), направляющей его транспортировку в компартменты накопления запасных белков. Химерный ген находился под контролем промотора гена глютелина, который направлял его тканеспецифичную транскрипцию в клетках запасной ткани семян (Vandekerckhove et al. , 1989).

Интеграция чужеродных генов в ядерный геном растения сопряжена и с рядом проблем биобезопасности использования генетически модифицированных организмов. При получении трансгенных растений в сель-скохозяйственных масштабах существует опасность утечки трансгена в окружающую среду (выход из-под контроля) в результате переопыления с близкородственными дикорастущими видами. Для повышения уров-ня биобезопасности рядом исследователей было предложено использовать для трансгенеза стерильные по мужской линии растения (Menassa et al. , 2001).

Другой проблемой, возникающей при интеграции гетерологичных генов в ядерный геном растений, явля-ется вероятность "замолкания" трансгенов в последующих поколениях (сайленсинг). Вероятность сайлен-синга резко возрастает при встраивании множества копий чужеродного гена на геном растения (Finnegan, McElroy, 1994; Matzke et al. , 1994; Matzke М., Matzke А., 1995). Поэтому при создании трансгенных растений-биопродуцентов рекомбинантных белков среди трансформантов отбирают растения, содержащие только одну встройку чужеродного гена.

В связи с вышеперечисленными проблемами, возникающими при интеграции трансгенов в ядерный ге-ном, весьма привлекательным представляется способ переноса экзогенной ДНК в геном хлоропластов. Хлоропласты - органеллы растительной клетки, содержащие зеленый пигмент хлорофилл, а также ряд дру-гих пигментов, принимающих участие в поглощении световой энергии и осуществлении фотохимических реак-ций. По форме и размерам хлоропласты высших растений достаточно однородны. Некоторая вариабельность наблюдается в отношении их числа в расчете на одну клетку, которое варьирует от нескольких десятков до сот-ни и более. Каждый отдельный хлоропласт окружен двойной мембраной и имеет сложную внутреннюю структу-ру. В одной растительной клетке в среднем содержится от 5 до 10 тыс. копий хлоропластной ДНК, за счёт чего уровень экспрессии чужеродных белков достигает значений, сравнимых с уровнем экспрессии в E. coli (до 40 % от суммарного белка клетки) (Staub et al. , 2000; De Cosa et al. , 2001). Однако в литературе встречаются только единичные работы по получению растений с генетически модифицированными хлоропла-стами. Это связано с чрезвычайной сложностью методов их трансформации и последующего отбора.

Третий путь использования растений для накопления белков гетерологичного происхождения основан на природной способности растительных вирусов проникать в клетки растений и колонизировать растительные тка-ни (Mushegian, Shepherd, 1995). На этой основе возникает реальная возможность модификации вирусного гено-ма и адаптации его не только в качестве вектора для доставки в растения соответствующих генетических конст-рукций, но и в качестве матриц для транзиентной экспрессии генов, кодирующих синтез белков, представляющих коммерческий интерес. Для заражения растительных тканей используются рекомбинантные (+)РНК-содержащие вирусы растений, несущие в составе своего генома транскрипт чужеродного гена (Mushegian, Shepherd, 1995). Скорость мультипликации вирусной РНК в растениях чрезвычайно высока, за счёт чего достигается высокая ко-пийность транскриптов чужеродных генов в цитоплазме заражённых клеток. Поэтому продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений (Giddings et al. , 2000).

В настоящее время широко используются два вида вирусов для продукции чужеродных белков в растениях: ви-рус табачной мозаики (ВТМ) и вирус мозаики коровьего гороха (ВМКГ). Вектор на основе РНК ВТМ использовался для получения ингибитора репликации ВИЧ α-трихосантина в Nicotiana benthamiana (Kumagai et al. , 1993). Для этого целевую последовательность, кодирующую α -трихосантин, поместили под субгеномный промотор белка оболочки ВТМ. Спустя две недели после заражения рекомбинантный α -трихосантин накапливался в листьях N. Benthamianaв количестве 2 % от суммарного белка. На основе ВМКГ удалось получить химерные частицы этого вируса с экспонированными на поверхности антигенными детерминантами ВИЧ1 (gp41) (Porta et al. , 1996). Для этого последовательность эпитопа gp41 была "сшита" с геном белка оболочки ВМКГ. Такие частицы обладали высокой иммунногенностью и были способны нейтрализовать инфекционные свойства ВИЧ1 in vivo.

Сравнивая пути наработки гетерологичных белков в растительных тканях, необходимо отметить, что каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. В трансгенных растениях перенесенные гены стабильно встраиваются в геном и сохраняются в последующих поколениях, тогда как при интеграции генов в геном вирусов в зараженных вирусами растениях обеспечивается их временная (транзиентная) экспрессия. Накопление соответствующих бел-ковых продуктов будет определяться периодом вегетации зараженного растения-хозяина. С другой стороны, пре-имуществом вирусного пути накопления белков в растениях является короткий период размножения вирусных час-тиц, простота инфицирования растений, а также широкий диапазон различных видов растений, которые могли бы быть использованы для этих целей.

Растения-продуценты антител

Цель иммунизации организма вакцинами - индуцировать продукцию антител на патогенный агент. Альтерна-тивой такому подходу является метод пассивной иммунизации, основанный на введении готовых иммуноглобу-линов. Широкое применение такого подхода долгое время было ограничено высокой стоимостью антител, полу-чаемых традиционными способами. В 1989 г. была показана возможность сборки функционально активных им-муноглобулинов класса IgG и IgA из лёгкой и тяжёлой цепей в растениях табака (Hiatt et al. , 1989). С того момента в нескольких крупных лабораториях мира были получены трансгенные растения-продуценты различных типов антител к эпитопам ряда патогенных агентов. В таблице 1 представлена сводка этих результатов.

Таблица 1

Растения-продуценты антител

Как видно из таблицы 1, к настоящему времени получены трансгенные растения табака, люцерны, пшеницы, риса и сои. Среди этих растений выделяются две группы: продуценты иммуноглобулинов к антигенам двух пато-генных агентов (стрептококк и вирус простого герпеса второго типа) и антител, специфичных к раковому эмбрио-нальному антигену и к IgG человека.

Анализируя уровень экспрессии перенесённых генов в геноме растений-биопродуцентов антител, можно отме-тить, что уровень продуктивности иммуноглобулина к поверхностному антигену Staphylococcus mutants в растениях табака оказался наиболее высоким и составил 500 мкг/г сырого веса (табл. 1). Такие антитела, выделен-ные из трансгенных растений табака, предупреждали развитие кариеса у пациентов при непосредственном нане-сении их на зубную эмаль и не уступали по своим свойствам аналогичным антителам, получаемым из гибридомы мышей.

Иммуноглобулины к раковому эмбриональному антигену были получены в трансгенных растениях риса и пшеницы (табл. 1). Такие антитела используются в иммунотерапии онкологических заболеваний, а также для визуализации опухоли in vivo.

Трансгенные растения рассматриваются как потенциальный недорогой источник иммуноглобулинов для ме-дицинских и исследовательских целей. На рисунке представлена динамика стоимости одного грамма чистого IgA, производимого в разных экспрессирующих системах, по оценкам компании "Planet Biotechnology" (Daniell et al. , 2001). Из графика видно, что уровень экспрессии значительно влияет на конечную стоимость IgA в случае продукции в культуре клеток млекопитающих и молоке трансгенных животных. В меньшей степени зави-симость цены от уровня экспрессии наблюдается при использовании трансгенных растений. Это связано с тем, что конечная цена рекомбинантного белка складывается из стоимости наработки сырого материала и стоимости его выделения. Считается, что стоимость очистки приблизительно одинакова для всех систем, а различие обу-словлено затратами при наработке сырого материала, которая в клетках млекопитающих и трансгенных живот-ных гораздо выше.

Растения-продуценты субъединичных вакцин

Трансгенные растения-продуценты эпитопов болезнетворных агентов человека и животных получили название "съедобных вакцин". Механизм иммунизации такими вакцинами основан на антигенпредставляющей способности перитонеальных макрофагов тонкого кишечника млекопитающих. В кишечнике чужеродный белок, обладающий антигенными свойствами, распознается специальными М-клетками, которые широко представлены в толще слизи-стого эпителия. М-клетки транспортируют захваченный антиген к перитонеальным макрофагам и В-лимфоцитам, находящимся в лимфоидных образованиях тонкого кишечника (пейеровых бляшках). В результате презентации антигена на поверхности антиген-представляющих клеток происходит активация T-лимфоцитов-хэлперов, которые в сочетании с антигеном активируют В-лимфоциты. Дифференцированные В-клетки выходят из лимфоидных фолликулов слизистой оболочки и посту-пают через общую циркуляцию в мезентеральные лимфатические узлы, где происходит их созревание и превра-щение в плазматические клетки, синтезирующие специфические к антигену антитела. Плазматические клетки спо-собны снова мигрировать к слизистым оболочкам дыхательных путей, желудочно-кишечного и мочеполового трак-тов. Секреторные иммуноглобулины IgA транспортируются на поверхность слизистых оболочек, где они связыва-ются с чужеродными агентами и препятствуют их проникновению в организм. Следует отметить, что мукозная вак-цинация стимулирует как иммунный ответ слизистых оболо- чек - первого защитного барьера на пути патогенных агентов, так и общий иммунный ответ организма (Walmsley, Arntzen, 2000).

Рис. Динамика цены за 1 грамм рекомбинантного IgA, полученного из разных экспрессирующих систем в зависимости от уровня экспрессии. I - культура клеток млекопитающих; II - молоко трансгенной козы; III - трансгенные растения (семена); IV - трансгенные растения (зелёная биомасса) (По: Daniell et al., 2001).

Таблица 2

Антигены, экспрессированные в растениях

К настоящему времени получены трансгенные растения табака, картофеля, люпина, салата, томатов, кукуру-зы, A. thaliana и люцерны, синтезирующие антигены различных инфекционных патогенов человека и жи-вотных (табл. 2).

Первыми "съедобными вакцинами" были трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие по-верхностный антиген вируса гепатита человека HbsAg (Mason et al., 1992). Скармливание клубней картофеля-продуцента HbsAg мышам стимулировало развитие мукозного (слизистого) и общего гуморального иммунного от-вета (Thanavala et al., 1995).

Токсины, выделяемые энтеропатогеннной E. Coli и холерным вибрионом, вызывают желудочно-кишечные расстройства у человека и животных и являются сильными оральными иммуногенами. При попадании в кишечник токсины вызывают продукцию специфических IgG и IgA иммуноглобулинов. Созданы трансгенные расте-ния табака, картофеля и кукурузы, синтезирующие В-субъединицу энтеротоксина E. Coli (табл. 2). Была про-анализирована степень протективности иммунитета, приобретенного мышами при оральной вакцинации трансген-ным картофелем. Иммунизированные мыши обладали устойчивостью к действию орально вводимого токсина по сравнению с контрольной группой, потреблявшей нетрансгенные клубни, хотя уровень устойчивости был ниже, чем у мышей, иммунизированных введением в желудок эквивалентного количества В-субъединицы природного токсина. Полученные на животных моделях результаты по выработке защитного иммунитета против энтеропатогенной E. coli были подтверждены в дальнейшем в клинических исследованиях на добровольцах (Tacket et al., 2000). В аналогичной работе (Arakawa et al., 1997) было показано развитие защитного иммунитета у мы-шей после скармливания клубней трансгенного картофеля, экспрессирующего В-субъединицу токсина V. cholerae. Иммунизация сопровождалась выработкой антител классов IgG и IgA.

Не останавливаясь подробно на других антигенах, приведённых в таблице 2, следует отметить, что практиче-ски во всех полученных растениях-продуцентах происходила сборка индивидуальных молекул антигена в мульти-мерные комплексы или вирусоподобные частицы, которые стимулировали развитие как мукозного, так и общего гуморального иммунного ответа при скармливании экспериментальным животным. Основные преимущества "съе-добных вакцин" - экономичность, безопасность и доступность для широкой иммунопрофилактики населения.

Таблица 3

Фармацевтические белки, полученные в трансгенных растениях

Растения-продуценты фармацевтических белков

За последние несколько лет в ведущих биотехнологических центрах мира созданы трансгенные растения-продуценты широкого спектра гормонов, цитокинов, факторов роста и ферментов, имеющих потенциальное применение в фармакологии (табл. 3). Все они не уступали по биологической активности аналогам, получаемым из других систем экспрессии.

По закону, принятому Всемирной организацией здравоохранения, любые предлагаемые источники лекарствен-ных препаратов, в частности трансгенные растения, должны быть зарегистрированы и пройти серию клинических испытаний. Первые клинические испытания трансгенных растений риса, синтезирующих активный человеческий a-1-антитрипсин для терапии фиброзного кистоза, были начаты в 1998 г.

Производство рекомбинантных белков для медицинских целей с использованием традиционных систем тре-бует значительных финансовых затрат. Так, например, недостаток лизосомального фермента гликоцеребрози-дазы в организме вызывает синдром Гоше. Единственным видом терапии этого заболевания является внутри-венное введение гликоцереброзидазы. Долгое время этот белок получали из плаценты человека, на поддержа-ние жизни одного пациента в течение года требовалось 160000$. Переключение продукции гликоцереброзидазы на культуру клеток млекопитающих снизило стоимость этого препарата, однако не вытеснило его из группы "са-мых дорогих лекарств в мире". В 1999 г. сотрудниками корпорации CropTech было показано, что трансгенные растения способны синтезировать биологически активную гликоцереброзидазу человека. В дальнейшем были получены высокопродуктивные трансгенные растения табака, в которых содержание гликоцереброзидазы чело-века варьировало от 1 до 10 % TSP. Ожидается, что получение рекомбинантной гликоцереброзидазы из таких растений позволит значительно снизить её стоимость (Giddings et al., 2000).

В заключение хотелось бы отметить, что несмотря на значительные достижения в области продукции реком-бинантных белков медицинского назначения в растениях, это направление находится лишь на начальном этапе своего развития. Учёные-биотехно-логи уверены, что в будущем рекомбинантные препараты, получаемые из генетически модифицированных растений, заменят дорогостоящие бактериальные и животные аналоги на фар-мацевтическом рынке. "Съедобные вакцины" позволят значительно усовершенствовать программы всеобщей иммунизации, особенно для населения развивающихся стран.

Список литературы

ArakawaT., ChongD., MerrittJ. etal. Expression of cholera and toxin B subunit oligomers in transgenic potato plants // Transgenic Res. 1997. V. 6. P. 403-413.

Budar F., Thia-Toong, Van Montagu M. Agrobacterium-mediated gene transfer results mainly in transgenic plants trans-mitting T-DNA as a single Mendelian factor // Genetics. 1986. V. 114. P. 303-313.

Carrillo C., Wigdorovitz A., Oliveros J. et al. Protective immune response to foot-and-mouth disease virus with VP1 ex-pressed in transgenic plants // J. Virol. 1998. V. 72. P. 1688-1690.

Chong D., Roberts W., Arakawa T. et al. Expression of human milk protein b-casein in transgenic potato plants // Trans-genic Res. 1997. V. 6. P. 289-296.

Chong D., Langridge W. Expression of full length bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants // Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 71-78.

Cramer C., Boothe J., Oishi K. Transgenic plants for therapeutic proteins: linking upstream and downstream technolo-gies // Current Topics in Microbiоl. and Immunol. 1999. V. 240. P. 95-118.

Daniell H., Streatfield S., Wycoff K. Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants // Trends in Plant Sci. 2001. V. 6. P. 219-226.

Deroles S.C., Gardner R.C. Analysis of the T-DNA structure in a large number of transgenic petunias generated by Agro-bacterium-mediated transformation // Plant Mol. Biol. 1988. V. 11. P. 365-377.

De Cosa B., Moar W., Lee S. et al. Overexpression of Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals // Nature Biotechnol. 2001. V. 19. P. 71-74.

De la Riva G., Gonzalez-Cabrera J., Vazquez-Padron R., Ayra-Pardo C. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation // Electronic J. of Biotechnol. 1998. V. 1, № 3. www.ejb.org.

Dieryck W., Pagnier J., Poyart C. et al. Human haemoglobin from transgenic tobacco // Nature. 1997. V. 386. P. 29-30.

Edelbaum O., Stein D., Holland N. et al. Expression of active human interferon-beta in transgenic plants // J. of Interferon Res. 1992 V. 12. P. 449-453.

Finnegan J., McElroy D. Transgene inactivation: Plants fight back! // Bio/Technology. 1994. V. 12. P. 883-887. Fromm E.M., Taylor L.P., Walbot V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electropora-tion // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 5824-5825.

Giddings G., Allison G., Brooks D., Carte A. Transgenic plants as factors for biopharmaceuticals // Nature Biotechnol. 2000. V. 18. P. 1151-1155.

Haq T., Mason H.S., Clements J. et al. Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants // Science. 1995. V. 268. P. 714-716.

Heberle-Bors E., Charvat B., Thompson D. et al. Genetic analysis of T-DNA insertion into tobacco genome // Plant Cell Rep. 1988. V. 7. P. 571-574.

Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants // Nature. 1989. V. 342. P. 76-78.

Higo K., Saito Y., Higo H. Expression of a chemically synthesized gene for human epidermal growth factor under the control of cauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenic tobacco // Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 1993. V. 57. P. 1477-1481.

Horsch R.B., Fraley R.T., Rogers S.G. et al. Inheritance of functional foreign genes in plants // Science. 1984. V. 223. P. 496-499.

Kapusta J., Modelska A., Figlerowicz M. et al. A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus // FASEB J. 1999. V. 13. P. 1796-1799.

Khoudi H., Laberge S., Ferullo J. et al. Production of diagnostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants // Bio-technology and Bioengineering. 1999. V. 64. P. 135-143.

Klein T., Wolf D., Wu R., Sanford J. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells // Nature. 1987. V. 327. P. 70-72.

Kumagai M., Turpen T.H., Weinzettl N. et al. High-level expression of biologically active alpha-trichosanthin in trans-fected plants by an RNA viral vector // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 427-430. Kusnadi A. Production of recombinant proteins in transgenic plants: practical considerations // Biotechnology and Bioen-gineering. 1997. V. 56. P. 473-484.

Leite A., Kemper E. Expression of correctly processed human growth hormone in seeds of transgenic tobacco plants // Mo-lecular Breeding. 2000. V. 6. P. 47-53.

Ma J., Hiatt A., Hein M. et al. Generation and assembly of secretory antibodies in plants // Science. 1995. V. 268. P. 716-719.

Ma J., Hikmat B., Wycoff K. et al. Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans // Nature Medicine. 1998. V. 4. P. 601-606. Mason H., Lam D., Arntzen C. Expression hepatitis B surface antigen in transgenic plants // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 11745-11749.

Mason H., Ball J., Shi J. et al. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996. V. 33. P. 5335-5340.

Mason H., Haq T., Clements J. et al. Edible vaccine protect mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic LT-B gene // Vaccine. 1998. V. 16. P. 1336-1343.

Matzke M., Matzke A. How and why do plants inactivate homologous transgenes? // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 679-685.

Matzke A., Neuhuber F., Park Y. et al. Homology-dependent gene silencing in transgenic plants: epistatic silencing loci contain multiple copies of methylated transgenes // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 244. P. 219-229.

McGarvey P., Hammond J., Dienelt M. et al. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes // Biotech-nology. 1995. V. 13. P. 1484-1487.

Menassa R., Nguyen V., Jevnikar A. et al. A self-contained system for the field production of plant recombinant inter-leukin-10 // Mol. Breeding. 2001. V. 8. P. 177-185.

Mushegian A., Shepherd R. Genetic elements of plant viruses as tools for genetic engineering // Microbiol. Rev. 1995. V. 12. P. 548-578.

Neuhaus G., Spandenberg G., Mittelstein O. et al. Transgenic rapesee plants obtained by the microinjection of DNA into microspore-derived embryoids // Plant J. 1987. V. 75. P. 30-36.

Ofoghi H. Cloning and expression of human calcitonin genes in transgenic potato plants // Biotechnol. Lett. 2000. V. 22. P. 611-615.

Park Y., Cheong H. Expression and production of recombinant human interkeukin-2 in potato plants // Protein Expres-sion and Purification. 2002. V. 25. P. 160-165.

Parmenter D., Boothe J.G., van Rooijen G. et al. Production of biologically active hirudin in plant seeds using oleosin partitioning // Plant Mol. Biol. 1995. V. 29. P. 1167-1180.

Porta C., Spall V., Lin T. et al. The development of cowpea mosaic virus as a potential source of novel vaccines // Intervi-rology. 1996. V. 39. P. 79-84.

Richter L., Thanavala Y., Arntzen C. et al. Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immuni-zation // Nature Biotechnol. 2000. V. 18. P. 1167-1171.

Ruggiero F., Exposito J., Bournat P. et al. Triple helix assembly and processing of human collagen produced in trans-genic tobacco plants // FEBS Lett. 1990. V. 469. P. 132-136.

Russel C., Clarke L. Recombinant proteins for genetic disease // Clinical Genet. 1999. V. 55. P. 389-394.

Sardana R., Alli Z., Dudani A. et al. Biological activity of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor is maintained in a fusion with seed glutelin peptide // Transgenic Res. 2002. V. 5. P. 521-531.

Sijmons P., Dekker B., Schrammeijer B. et al. Production of correctly processed human serum albumin intransgenic plants // Bio/Technology. 1990. V. 8. P. 217-221.

Staub J., Garcia B., Graves J. et al. High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts // Na-ture Biotechnol. 2000.V. 18. P. 333-338.

Stoger E., Vaquero C., Torres E. et al. Cereal crops as viable production and storage systems for phar-maceutical scFv antibodies // Plant Mol. Biol. 2000. V. 42. P. 583-590.

Streatfield S., Jilka J., Hood E. et al. Plant-based vaccines: unique advantages // Vaccine. 2000. V. 19. P. 2742-2748.

Tackaberry E., Dudani A., Prior F. et al. Development of biopharmaceuticals in plant expression systems: cloning, ex-pression and immunological reactivity of human cytomegalovirus glycoprotein B (UL55) in seeds of transgenic to-bacco // Vaccine. 1999. V. 17. P. 3020-3029.

Tacket C., Mason H., Losonsky G. et al. Human immune responses to a novel Norwalk virus vaccine delivered in trans-genic potatoes // J. of Infectious Diseases. 2000. V. 182. P. 302-305.

Tacket C., Mason H. A review of oral vaccination with transgenic vegetables // Microbes and Infection. 1999. V. 1. P. 777-783.

Thanavala Y., Yang Y., Lyons P. et al. Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 3358-3361.

Torres E., Vaquero C., Nicholson L. et al. Rice cell culture as an alternative production system for functional diagnostic and therapeutic antibodies // Transgenic Res. 1999. V. 8. P. 441-449.

Tuboly T., Yu W., Bailey A. et al. Immunogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein ex-pressed in plants // Vaccine. 2000. V. 18. P. 2023-2028.

Vandekerckhove J. Enkephalines produced in transgenic plants using modified 2S storage proteins // Bio/Technology. 1989. V. 7. P. 929-932.

Vaucheret H., Beclin C., Fagard M. Post-transcrip-tional gene silencing in plants // J. Cell Sci. 2001. V. 114. P. 3083-3091.

Walmsley A., Arntzen C. Plants for delivery of edible vaccines // Current Opinion in Biotechnol. 2000. V. 11. P. 126-129.

Wigdorovitz A., Carrillo C., Dus Santos M. et al. Induction of a protective antibody response to foot and mouth disease in mice following oral or parenteral immunization with alfalfa transgenic plants expressing the viral structural protein VP1 // Virology. 1999. V. 255. P. 347-353.

Zeitlin L., Olmsted S., Moench T. et al. A humanized monoclonal antibody produced in transgenic plants for immunoprotec-tion of the vagina against genital herpes // Nature Biotechnol. 1998. V. 16. P. 1361-1364.

Zhong G., Peterson, D., Delaney D. et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds // Mol. Breeding. 1999. V. 5. P. 345-356.

¹
А.А. Турчинович, аспирант

¹
Е.В. Дейнеко, к.б.н., зам. зав. лабораторией гетерозиса растений

²
М.Л. Филипенко, к.б.н., зав. сектором фармакогеномики

²
Е.А. Храпов, ст. инженер сектора фармакогеномики

¹
В.К. Шумный, академик

¹
Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

²
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск