--PAGE_BREAK--2.2 Гемопоэтические стволовые клетки
Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) определяются по их способности давать все гемопоэтические линии in vivo и поддерживать образование этих клеток в течение всей жизни человека. В отсутствие надежных прямых маркеров ГСК, их идентификация и подсчет зависят от функциональных и мультилинейных исследований репопуляции in vivo. Необыкновенно низкая встречаемость ГСК в любой ткани и отсутствие специфического ГСК фенотипа сделали их очистку и характеристику весьма трудной задачей. ГСК и примитивные гемопоэтические клетки могут быть отличимы от зрелых клеток крови по отсутствию у них линия — специфичных маркеров и присутствию некоторых других поверхностных антигенов, таких, как CD133 (для человеческих клеток) и c-kit и Sca-1 (у мышиных клеток). Функциональный анализ субпопуляций примитивных гемопоэтических клеток привел к созданию нескольких процедур для изоляции клеточных популяций, которые сильно обогащены клетками, проявляющими активность стволовых клеток in vivo. Упрощенные методы для получения этих клеток с высоким выходом были важны для практического использовании таких наработок /61/.
ГСК широко использовались для ауто и алло трансплантаций в течение десятилетий, хотя мало было известно об их миграции, выживании, самообновлении и дифференциации. Сортировка их по CD34 (+) маркеру, который они экспрессируют на клеточной поверхности, привела к открытию ГСК в CD34 (-) компартменте, что может предшествовать появлению CD34 (+) ГСК в процессе дифференцировки. До недавнего времени стволовые клетки в костном мозге считали специфичными для гемопоэза. Эксперименты, включающие клинические испытания, показали образование различных тканей, например, мускульных, нервных клеток и гепатоцитов, после трансплантации медуллярных клеток и опровергнули эту догму. Фактически, доказательства такой трасдифференцировки ГСК все еще отсутствуют, и данные могут быть получены при изучении дифференцировки других мультипотентных клеток, присутствующих в костном мозге, таких, как мезенхимальные стволовые клетки и более примитивные мультипотентные взрослые зародышевые клетки и клетки побочной популяции /10/.
В последние годы стало очевидным, что хемокин SDF-1 и его рецептор CXCR4 играют пилотную роль в нормальном гемопоэзе. Они являются важными для нормального онтогенеза гемопоэза в течение эмбриогенеза и продолжают играть ключевую роль в сохранении гемопоэтических прогениторных клеток в микроокружении костного мозга у взрослых. В сязи с этой роли прерывание взаимодействий SDF-1/CXCR4 приводит к мобилизации гемопоэтических прогениторных клеток, а стандартный протокол мобилизации препятствует им. Сходно, взаимодействия SDF-1/CXCR4 требуются для хоуминга и приживления трансплантанта во время трансплантации. SDF-1 регулирует локализацию лейкемических клеток, и, как их нормальные двойники, большинство лейкемических клеток отвечают на SDF-1 увеличенными адгезией, выживанием и пролиферацией. Однако в некоторых случаях ответы лейкемических клеток на SDF-1 могут быть разрегулированы, а влияние этого на прогрессирование болезни неизвестно /25/.
Было показано, что стволовые клетки из различных тканей способны дифференцироваться в клетки, характерные для отдельных тканей, по-видимому, в ответ на сигналы микроокружения. Это иерархическая пластичность. Показано, что как человеческие, так и мышиные клетки из нейросферы, имеющие потенциал дифференцироваться в нейроны, олигодендритные клетки и астроциты, продуцировали гемопоэтические стволовые клетки при пересадке в 3,5 дневные бластомеры овцы или мыши. Также продемонстрирована альтернативная форма пластичности стволовых клеток: функциональная пластичность на различных точках в клеточном цикле и на различных фазах циркадного ритма. Показано, что длительная пересадка обратимо варьирует по мере того, как примитивные мышиные стволовые клетки (линейные — негативные к родамину и Hoechst) переходят в клеточный цикл после стимуляции интерлейкином-3, ИЛ-6, ИЛ-11 и стальным фактором. Приживление трансплантанта дефектно в поздней S/ранней G2. Приживление транспланттанта заметно меняется вместе с циркадным ритмом. Предполагаемые механизмы для этих фенотипических сдвигов включают изменения в экспрессии белков адгезии с последующими изменениями в хоуминге в костный мозг. Показано, что дифференциация стволовых клеток заметно меняется в зависимости от фазы клеточного цикла. Имеются другие свойства гемопоэтической стволовой клетки, которые заставляют предположить, что это высокопластичная клетка обладает способностью быстро изменять свой мембранный фенотип и проявляет необычную направленную подвижность. Следовательно, пластичность, вызванная фазами клеточного цикла и циркадного ритма, должна быть рассматриваема, как важнейшая дополнительная черта фенотипа гемопоэтических стволовых клеток /46/.
Нормальный устойчивый гемопоэз происходит в микроокружении костного мозга. Растворимые факторы, также как контактные взаимодействия между гемопоэтическими клетками и микроокружением костного мозга, диктуют судьбу гемопоэтических клеток и прогениторных клеток. В последние десять лет стало ясно, что клетка-клетка и клетка — экстраклеточный матрикс взаимодействия через рецепторы адгезии играют главную роль в гемопоэтическом процессе. Они необходимы для резиденции стволовых клеток, так же, как и для хоуминга стволовых клеток и прогениторных клеток в костном мозге в месте поселения клеток трансплантанта стволовых клеток. Более того, рецепторы адгезии играют важную роль в регуляции поведения клеток, либо через прямую активацию сигнальных путей, важных для выживания клеток, клеточного роста и судьбы клеток или модулировании ответов на факторы роста. Понимание механизмов ненормальностей, видимых в этих взаимодействиях при болезнях гемопоэтической системы, поможет развить лучшие терапевтические стратегии, основанные на патогенезе этих болезней /45/.
ГСК являются привлекательной мишенью для генной терапии генетических болезней иммунной и гемопоэтической систем, и для лекарство — резистентных стратегий, в которых гены, ответственные за резистентность к различным хемотерапевтическим агентам, преобразовываются. Стволовые клетки относительно легко получить пункцией костного мозга или мобилизацией с помощью G-CSF в периферическую кровь, и обогатить с помощью анти — CD34 + моноклональных антител. Для обычной ретровирусной трансдукции нормальные покоящиеся ГСК должны быть активированы в клеточный цикл путем использования соответствующих цитокинов, и было критически важным найти комбинацию цитокинов, которые сохраняют способность к самообновлению на длительный период репопулирующих ГСК. Стало очевидным, что стратегии оптимизирующие ГСК цикл и провирусную интеграцию могут уменьшить способность трансдуцированных ГСК конкурировать in vivo против эндогенных ГСК или ГСК, которые не были активированы в клеточный цикл. Вирусные векторы могут интегрировать гены в неделящиеся клетки, но возрастает эффективность трансдукции, если ГСК активированы в G1-фазу клеточного цикла. Эта уменьшенная эффективность длительной трансплантации ГСК может быть связана с нарушенным самообновлением или уменьшенной эффективностью хоуминга в костный мозг. Последняя может быть связана с уменьшением модуляции хемокиновых рецепторов, необходимых для хемотактического хоуминга в костный мозг. В качестве альтернативы или дополнения, возможно, существуют уменьшение модуляции: (1) молекул адгезии ГСК, необходимых для адгезии к эндотелию и выхода из циркуляции; (2) металлопротеиназ, секретируемых ГСК, которые способствуют миграции через экстрацеллюлярный матрикс и обеспечивают критические растворимые факторы в микроокружении костного мозга. Более противоречивый взгляд заключается в том, что ведущие к смерти клеток пути, например, те, которые включают FasR (CD95), могут быть активированы находящимися в клеточном цикле ГСК, в результате чего наступает их селективная деструкция при трансплантации и локализации в сайтах, богатых Fas лигандами, таких, как печень /39/.
Ex vivo экспансия гемопоэтических предшественников, прогениторных клеток и стволовых клеток представляют современную эру клеточной терапии в 21 веке. В течение последних 10 лет развитие способов идентификации и очистки гемопоэтических стволовых клеток и цитокинов способствовали улучшению ex vivo технологий экспансии стволовых клеток. Однако технология пока не достигла такой стадии, когда размножившиеся ex vivo гемопоэтические прогеиторные и стволовые клетки могут рутинно использоваться для заместительной терапии. Уроки, полученные в последние 10 лет при исследованиях, сосредоточеных на развитии оптимальной ex vivo экспансии стволовых клеток, привели к гораздо лучшему пониманию биологии стволовых клеток. Это знание привело к новым попыткам ex vivo экспансии гемопоэтических предшественников, прогениторных клеток и стволовых клеток и должно привести к нового покаления клеточных терапий. Три области ex vivo экспансии стволовых клеток, которые определяют их клиническую осуществимость, включат в себя: (1) выбор оптимальной популяции стволовых клеток для экспансии; (2) определение желательных характеристик популяции стволовых клеток в состоянии экспансии, которые могут быть использованы при трансплантации; (3) развитие новых реагентов и процедур для экспансии и инфузии гемопоэтичесих прогениторных клеток и стволовых клеток /50/.
Поддержание зрелых клеток крови требует присутствия гемопоэтических стволовых клеток, характеристиками которых являются способность к самообновлению и образование дифференцированного потомства. Предлагается стохастическая модель для механизма самообновления и дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток с использованием in клональной культуральной техники in vitro. Недавний прогресс в молекулярной биологии способствовал изоляции и получению характеристик некоторых цитокинов (IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, G-CSF и фактор стволовых клеток factor (SCF)) /42/.
Таким образом, гемопоэтические стволовые клетки способны образовывать не только клетки крови, но и другие типы клеток. В настоящее время создаются способы увеличивающие выход ГСК из костного мозга. ГСК являются важнейшим источником получения собственных стволовых клеток.
продолжение
--PAGE_BREAK--2.3 Мезенхимальные стволовые клетки
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были изолированы из костного мозга, надкостницы, трабекулярной кости, жировой ткани, синовиальной оболочки, скелетной мускулатуры и молочных зубов. Эти клетки обладают способностью дифференцироваться в клетки соединительной ткани, включая кость, жир, хрящ и мускулатуру. Много было выяснено в последние годы об изоляции и характеристиках МСК и о контроле над их дифференцировкой. Эти клетки вызвали большой интерес из-за перспектив их использования в регенеративной медицине и тканевой инженерии. Существуют драматические примеры, взятые из преклинического и клинического использования МСК, которые иллюстрируют их терапевтическую ценность. По мере того, как развивались новые методы, выявлено несколько аспектов взаимодействий имплантированных клеток с хозяином. Они должны быть рассмотрены перед тем, как понять лежащие в их основе механизмы. Взаимодействия м\имплантированных клеток с хозяином включают иммунный ответ хозяина на имплантированные клетки, механизмы хоуминга, которые направляют клетки к месту повреждения, и дифференциация in vivo имплантированных клеток под влиянием локальных сигналов /4/.
Популяции стволовых клеток найдены в большинстве взрослых тканей и в обшем их дифференцирочный потенциал может отражать локальные клеточные популяции. Были описаны гемопоэтические, эпидермальные, мезенхимальные, невральные и гепато — стволовые клетки были. Возможно, что во взрослом организме эти клетки являются резервуаром репаративных клеток, которые мобилизуются повреждением и мигрируют в рану, где в кооперации с локальными клетками участвуют в репаративном ответе. Мезенхимальные стволовые клетки, изолированные из костного мозга, имеют способность дифференцироваться в клетки соединительной ткани. Некоторые разительные примеры терапевтического использования МСК были недавно описаны для таких случакв, как коронарная болезнь артерий, повреждение спинного мозга, болезнь Паркинсона и регенерация печени. В ортопедической медицине МСК применялись для восстановления костей и хряща и при лечении остеоартрита. Вопрос о реакции хозяина на имплантированные МСК становится критическим по мере развития клинических приложений. Есть несколько аспектов взаимодействий имплантированных стволовых клеток с хозяином, которые нужно рассмотреть для понимания механизмов, лежащих в основе терапии стволовыми клетками. Это (1) иммунный ответ хозяина на имплантированные клетки, (2) механизмы хоуминга, которые направляют клетки к месту повреждения, (3) дифференциация имплантированных клеток под влиянием локальных сигналов /3/.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются предшественниками всех клеток соединительной ткани. МСК были изолированы из костного мозга и других тканей у взрослых множества видов позвоночных. Они размножались в культуре и диффренцировались в несколько ткань — образующих клеток, таких, как кость, хрящ, жир, мускулатура, сухожилие, печень, почки, сердце, даже клетки мозга. Последние достижения в практическом применении МСК при регенерации человеческого суставного мыщелока синовиального сустава являются примерами их функциональности и многосторонности /1/.
Таким образом, мезенхимальные клетки при дифференцировке образуют различные клетки соединительной ткани.
2.4 Стромальные стволовые клетки
Созданы линии человеческих мезенхимальных стволовых клеток, которые могут дифференцироваться в различные тканевые клетки, включая кость, нервные клетки, стромальные клетки костного мозга, поддерживать рост гемопоэтических стволовых клеток и так называемых “стромальных опухолевых клеток”, смешанных с опухолевыми клетками. Обладающие теломеразой человеческие стромальные клетки из костного мозга обладают повышенной продолжительностью жизни и поддерживают рост гемопоэтических клоногенных клеток. Перенос гена индийского ежа (дикобраза) существенно увеличил экспансию гемопоэтических стволовых клеток, поддерживаемую человеческими стромальными клетками костного мозга. Генномодифицированные мезенхимальные стволовые клетки полезны, как терапевтические инструменты для лечения повреждения мозговых тканей (например, в результате инфаркта мозга) и злокачественных мозговых неоплазм. Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток защищает мозг от острого ишемического повреждения при окклюзии среднемозговой артерии на животной модели. Полученный из мозга нейротропный фактор (BDNF) — генной трансдукции еще больше увеличил протективную эффективность против ишемического повреждения. Мезенхимальные стволовые клетки обладают отличной способностью к миграции и оказывают ингибиторный эффект на клетки глиомы. Генная модификация мезенхимальных стволовых клеток терапевтическими цитокинами увеличивает антиопухолевый эффект и пролонгирует выживание животных с опухолями. Генная терапия, использующая мезенхимальные стволовые клетки, как тканепротективный и направленный цитореагент является многообещающим подходом /21/.
Этот обзор посвящен стволовым клеткам костного мозга. Методы индентификации, культивирования, накопления клеточной массы и пересадки стволовых клеток описаны, включая выделение линий гемопоэтических и мезенхимальных линий стволовых клеток и детальный анализ, использующий многочисленные CD и другие маркеры для идентификации малых субпопуляций стволовых клеток. За секцией, посвященной стволовым клеткам крови пуповины, следует детальное обсуждение современной ситуации в клиническом использовании стволовых клеток, его последние неудачи, связанные с эпигенетическими факторами, различные подходы к открытию высокомультипотентных стволовых клеток костного мозга, и краткое описание эмбриологических подходов к идентификации базовых стволовых клеток костного мозга на самых ранних стадиях развития эмбрионов млекопитающих /16/.
Костный мозг взрослых млекопитающих содержит не одну, а две отдельные популяции взрослых стволовых клеток. Первой и наиболее хорошо охарктеризованной является популяция гемопоэтических стволовых клеток, ответственная за поддержание продукции в течение всей жизни клеток крови. Биологические характеристики и свойства второй резидентной популяции стволовых клеток костного мозга, называемых стромальными клетками костного мозга или мезенхимальными стволовыми клетками, значительно менее понятны. In vitro культуры, произошедшие из суспензии разделенного на отдельные клетки костного мозга различных видов млекопитающих, образуют колонии стромальных клеток костного мозга, каждая из которых происходит от одной клетки — предшественника, называемой колониеобразующий фибробласт. Были разработаны условия культивирования для выращивания стромальных клеток костного мозга in vitro, которые сохраняли способность дифференцироваться в кость, жир и хрящ. Значительная доля современных знаний об этой популяции клеток базируется на анализе свойств этих культур клеток, а не на свойствах первичных инициирующих рост колонии клеток. Современные данные заставляют предположить, что стромальные прогениторы в костном мозге in situ ассоциированы с внешней поверхностью сосудов и могут делить идентичность с сосудистыми перицитами /51/.
Таким образом, стромальные стволовые клетки костного мозга являются одним из видов мезенхимальных стволовых клеток.
продолжение
--PAGE_BREAK--2.5 Тканеспецифичные стволовые клетки
Полагают, что стволовые клетки важны для регенерации нескольких взрослых тканей. В последнее время были идентифицированы взрослые стволовые клетки с очень широким потенциалом дифференцировки, хотя не известно представляют ли они примитивные стволовые клетки или продукты исключительно редких событий дедифференцировки, включающие тканевоспецифичные стволовые клетки. Была также продемонстрирована трансдифференцировка тканевоспецифичных стволовых клеток за границы линии, но относительная неэффективность процесса in vivo, даже в присутствии тканевого повреждения, подвергает сомнению физиологическое значение такого механизма. Интересно, что среди взрослых стволовых клеток. которые культивируются ex vivo продолжительные периоды времени, способность изменять линию наибольшая. Если решения о судьбе нормальных разнообразных стволовых клеток могут быть изменены с высокой частотой in situ, могут быть представлены возможные регенеративные терапии для большого разнообрзия болезней. Интегральное понимание транкрипционной регуляторной сети, которая включает различные взрослые стволовые клетки, также, как и сигнальных путей, управляющих их дифференцировкой в терапевтически полезные клеточные типы, будет способствовать клиническому приложению этих волнующих открытий /8/.
Таким образом, тканевоспецифичные стволовые клетки способны дифференцироваться в другие типы клеток, но in vivo этот процесс малоэффективен. Тем не менее сейчас разрабатываются подходы, сделающие возможным использования этого источника стволовых клеток.
3. Ангиогенные стволовые клетки
Открывшаяся в настоящее время возможность изолировать стволовые клетки и изучать их специфичную способность самообновления с образованием различных клеточных типов открыла волнующую перспективу помочь восстановлению поврежденной ткани, и даже образования новых тканей. Процесс васкулогенеза (васкуляризация ишемических или инжиниринговых тканей) сходен с эмбриональным процессом в котором “гемангиобласты" дифференцируются в клетки крови, также как в примитивные сосуды. Хотя и обусловленный клетками происходящими из костного мозга, во взрослой жизни васкулогенный восстановительный механизм вносит лишь небольшой вклад в механизмы восстановления сосудов: а именно (i) ангиогенез (рост сосудов из существующих сосудов); и (ii) артериогенез (направляемое моноцитами увеличение калибра существующих артериолярных коллатералей). Большинство попыток увеличить восстановление сосудов с помощью стволовых клеток проходило с использованием факторов роста, которые мобилизовывали стволовые клетки из костного мозга в кровь, иногда комбинированное с изоляцией и реинфузией этих клеток после экспансии и дифференцировки ex vivo в эндотелиальные клетки — предшественницы. Четкое улучшение перфузии областей ишемии и васкуляризации наблюдалось in vivo в основном на животных моделях. Периферический хоуминг и его регуляция, а также (конечная) дифференцировка в местах восстановления сосудов менее изучены, но имеют первостепенное значение для эффективности и безопасности. Использование эмбриональных стволовых клеток встречает этические возражения. Более того, специальное внимание и меры требуются для того, чтобы преодолеть аллогенные барьеры, с которыми обычно сталкиваются эти клетки. В общем, длительное и сложное ex vivo культивирование, требующиеся для получения достаточного потомства от весьма небольшого числа стволовых клеток для использования в качестве стартового материала, дорого и обременительно. Как фундаментальные исследования концептуальных вопросов, так и работа по эффективному удешевлению продукта должны пройти долгий путь перед клиническим использованием в клинике/63/.
Таким образом, ангиогенные стволовые клетки происходят из костного мозга.
4. Рекрутирование (мобилизация) стволовых клеток
Высокомобильный групповой белок 1 (High mobility group box 1) (HMGB1) является негистоновым белком, требующемся для поддержания архитектуры хроматина. Последние исследования показали, что он может действовать, как цитокин, регулирующий различные биологические процессы, такие, как воспаление, миграция клеток и метастазирование. Ранее показано, что HMGB1 может пассивно освобождаться клетками, которые погибают в результате травмы или непрограммируемым путем, и может быть сигналом повреждения тканей. HMGB1 может рекрутировать стволовые клетки: HMGB1 индуцирует стволовые клетки к трансмиграции через эндотелиальный барьер, более того, когда шарики, содержащие HMGB1 имплантировали в здоровый мускул, они рекрутировали стволовые клетки, введенные в общую циркуляцию. Роли HMGB1 в воспалении и в регенерации тканей могут быть строго взаимосвязаны /43/.
Мобилизация гемопоэтических стволовых клеток и клеток — прогениторов из костного мозга в циркуляцию повторяющимися ежедневными стимуляциями только G-CSF или в комбинации с циклофосфамидом все шире используется в клинике; однако механизм этого все еще не до конца понят. Более того, вслед за мобилизацией стволовые клетки возвращаются назад в костный мозг, что заставляет предположить, что освобождение/мобилизация и хоуминг представляют собой последовательные события со своими физиологическими ролями. Ранее была определена роль для мобилизации стволовых клеток цитокинов, таких, как G-CSF SCF, и молекул адгезии, таких, как VLA-4 и P/E селектины. Результаты последних исследований с использованием моделей на экспериментальных животных и клинические протоколы мобилизации продемонстрировали важное участие хемокинов, таких, как происходящий из стромы фактор 1 (stromal derived factor-1 (SDF-1)) и интерлейкин-8, также, как эластаза и катепсин G в процессе мобилизации /29/.
CD34 (+) гематопоэтические стволовые клетки из периферической крови обычно используются для аутологичной или аллогенной трансплантации, следующей за терапией высокими дозами при злокачественных заболеваниях. Применение таких гемопоэтических факторов, как G-CSF, сильно увеличивает мобилизацию CD34 (+) клеток. Механизм мобилизации стволовых клеток все еще не ясен. Похоже, что это многоступенчатый процесс с участием цитокинов и молекул адгезии. Важную роль в мобилизации и хоуминге CD34 (+) клеток играют гемопоэтические факторы роста, хемокины и молекулы адгезии CD34 (+) клеток. Лекарства, такие, как моноклональные антитела, специфические пептиды или олигонуклеотиды, имеют целью молекулы адгезии /28/.
Мобилизация гемопоэтических прогениторных клеток, как оказалось, является мультифакторным процессом, который, по крайней мере частично, регулируется на уровне микроваскулярного эндотелия костного мозга (МВЭКМ). С целью изучения регуляции миграции прогениторных клеток эндотелием in vitro были развиты методы изоляции МВЭКМ из аспиратов костного мозга. Обретшие бессмертие МВЭКМ клеточные линии были сгенерированы. При использовании модели миграции через эндотелий костного мозга in vitro показано, что только небольшое число более зрелых, дифференцированных прогениторных клеток мигрируют спонтанно. В этой модели участвуют молекулы адгезии семейства бета2-интегрина и соответствующие им эндотелиальные лиганды. Низкая спонтанная миграционная способность предполагает, что дополнительно к молекулам адгезии, которые опосредуют прямые клеточные контакты, паракринные цитокины и хемокины могут играть роль в миграции прогениторных клеток через эндотелий. Стимулированные фактором роста гемопоэтические клетки могут продуцировать цитокины, которые действуют на эндотелиальные клетки (сосудистый эндотелиальный фактор роста — VEGF), модифицируя их подвижность, рост, проницаемость и распределение. Поэтому VEGF может участвовать в мобилизации и хоуминге гемопоэтических стволовых клеток. Более того, трансэндотелиальная миграция прогениторных клеток in vitro существенно увеличивается хемокином из стромы stromal-cell-derived factor-1 (SDF-1), который продуцируется стромальными клетками костного мозга. Более примитивные прогенаторы, которые не мигрируют спонтанно, также реагируют на хемокин. Сделан вывод, что трасэндотелиальная миграция прогениторных клеток регулируется молекулами адгезии, паракринными цитокинами и хемокинами. Stromal-cell-derived factor-1 (SDF-1), мобилизующие гемопоэтические факторы роста стимулируют пролиферацию гемопоэтических клеток, которая может о приводить к изменениям в локальной “атмосфере” цитокинов и хемокинов непрямым образом и в конце концов приводить к мобилизации гемопоэтических прогениторных клеток /37/.
Гемопоэтические прогениторные клетки, мобилизуемые в переферическую кровь, теперь широко используются в трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток для лечения ряда злокачественных и некоторых незлокачественных болезней. Хотя изначально использовалась только химеотерапия, все современные протоколы лечения в настоящее время включают использование цитокинов, с или без химеотерапии. Развитие получила предварительная терапия рака с целью получения урожая прогениторных клеток, расширились знания о кинетике мобилизации и совершенствовались необходимые навыки в собирании и криоконсервации прогениторных клеток. Для предсказуемого исхода Более аккуратные измерения числа гемопоэтических прогениторных клеток и определение необходимого их количества для оптимального выздоровления после терапии высокими дозами химиопрепаратов были разработаны. Хотя использование G-CSF обычно оказывается успешным, у некоторых пациентов не удается добиться достаточной мобилизации или требуется дополнительное число отборов клеток. Клинические исследования цитокинов раннего действия, фактора стволовых клеток в комбинации с G-CSF продемонстроровали увеличенный выход прогениторных клеток у ряда пациентов, что может дать клинические преимущества в избранных ситуациях. На животных моделях, и в меньшей степени у людей, другие цитокины, такие, как тромбопоэтин и Flt-3 лиганд или некоторые малые молекулы с единичной или множественной активностью агонистов для цитокиновых рецепторов (IL-3, Flt-3L, TPO, G-CSF) также оказались многообещающими мобилизационными агентами. Дальнейшие исследования относительной важности клеточной пролиферации, клеточной адгезии и роли вспомогательных клеток и других сигнальных событий ведут к улучшению понимания механизмов, лежащих в основе мобилизации гематопоэтических прогениторных клеток. Введение надлежащей химиотерапии высокими дозами вслед за реинфузией гематопоэтичесих прогениторных клеток, способных к длительной существованию, уже давно применяется в лечении ряда злокачественных (преимущественно гематологических) и незлокачественных болезней. В течение многих лет прогениторные клетки получали прямой аспирацией костного мозга при анестезии, отсюда термин трансплантация костного мозга. Однако было достигнуто понимание, что гемопоэтические стволовые клетки можно получать из периферической крови, хотя и в небольших количествах, а также из пуповинной крови. Дальнейшее эмпирическое изучение показало, что число гемопоэтических прогениторных клеток, циркулирующих в крови, может быть временно увеличено после химеотерапии и/или введения одного или нескольких цитокинов. Улучшения клинической практики мобилизации прогениторных клеток, сбора и размножения клеток оказались столь успешными, что во многих случаях стволовые клетки крови заместили костный мозг, как предпочтительный источник /19/.
Таким образом, в процессе мобилизации стволовых клеток принимают участие некоторые белки хроматина, цитокины, хемокины и молекулы адгезии.
продолжение
--PAGE_BREAK--5.Пролиферация стволовых клеток
Вклад стволовых клеток в ранние фазы гемопоэтической трансплантации противоречив, также как и вопрос о числе стволовых клеток, необходимых для успешной длительной трансплантации у человека. Существует большое количество данных для мышей, но степень обоснованности их переноса на человека дискуссионна. Другие варьирующие показатели, касающиеся стволовых клеток, включают их эффективность в хоуминге в костный мозг, их предыдущая пролиферативная история, влияющая на длину теломеров и их способность усиливать активность теломеразы. Степень увеличения числа стволовых клеток in vivo после трансплантации или ex vivo после стимуляции цитокинами обсуждается и поднят вопрос о нестохастических внешних влияниях для изменения вероятности самообновления стволовых клеток /38/.
Гематопоэтические стволовые клетки (ГСК) образуют все клетки крови и иммунные клетки и используются в клинических протоколах по трансплантации для лечения разнообразных заболеваний. Способность увеличивать число ГСК vivo или in vitro обеспечит новые возможности для лечения, но амплификации ГСК было трудно достигнуть. Понимание механизмов самообновления ГСК сделало амплификацию ГСК важной клинической целью /53/.
Микроокружение костного мозга представляет собой сложную трехмерную структуру, где гемопоэтические клетки пролиферируют, приобретают зрелость, мигрируют в синусоидальное пространство и выходят в циркуляцию регулируемым образом. Стромальные клетки в микроокружении костного мозга обеспечивают подходящее окружение для самообновления, пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток. Внутри гемопоэтического микроокружения существует эмбриональный желточный мешок, зародышевая печень или взрослый костный мозг. Микроваскулярный эндотелий не только действует, как сторож ворот, контролирующий траффик и хоуминг гемопоэтических прогенаторов, но также обеспечивает клеточный контакт и секретирует цитокины, которые разрешают сохранение устойчивого состояния гемопоэза. В последнее время гомогенные слои эндотелиальных клеток костного мозга были изолированы и культивировались в условиях клеточной культуры. Длительные культуральные исследования показали, что монослои эндотелиальных клеток костного мозга являются уникальным типом эндотелия и могут поддерживать длительную пролиферацию гемопоэтических прогенаторных клеток, в особенности мегакариоцитов и миелоидных прогенаторных клеток путем выработки линия — специфичных цитокинов, таких, как G-CSF, GM-CSF, M-CSF, Kit-лиганд, IL6, FLK-2 лиганд и ингибиторный фактор лейкемии. Прямые клеточные контакты между гемопотическими прогенаторными клетками и эндотелиальными клетками костного мозга через специфические молекулы адгезии, включающие бета1, бета2 интегрины и селектины играют критическую роль в траффике и возможно пролиферации гемопоэтических стволовых клеток. Дисфункции микрососудистых эндотелиальных клеток в гемопоэтическом микроокружении могут приводить к расстройствам функции стволовых клеток и прогрессировании пластических анемий, а также вносят вклад в нарушения приживления трансплантанта при трансплантации костного мозга. Дальнейшее изучение роли микроваскулярного эндотелия в регуляции хоуминга гематопоэтических клеток может увеличить наше знание о патофизиологии стволовых клеток и лейкемии /47/.
Интерлейкин — 3 является мультипотентным фактором роста, продуцируемым активированными Т клетками, моноцитами/макрофагами и стромальными клетками. Человеческий ген IL-3 локализуется на хромосоме 5 около сегмента 5q31. Рецептор высокой аффинности для человеческого IL-3 состоит из альфа и бета субъединиц. IL-3 делит общую бета субъединицу с гранулоцит — макрофаг колние-стимулирующим фактором (GM-CSF) и IL-5; эта субъединица картируется на хромосоме 22q13.1 Биологические эффекты IL-3 изучались на человеческих и мышиных линиях гематопоэтических клеток и нормальных клетках человеческого костного мозга. Добавление IL-3 к культуральной среде индуцирует пролиферацию, созревание и возможно самообновление плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток и клеток миелоидной, эритроидной и мегакариотической линий. Человеческий IL-3 был клонирован в 1986 году, и с этого времени различные клинические исследования подтвердили in vivo потенциал рекомбинантного человеческого (rhIL-3). Первоначальные результаты исследования фазы I/II IL-3 в дозе 5-10 микрограм/кг подкожно ежедневно в течение 5-10 дней у пациентов с рецидивом лимфом, малоклеточным раком легкого, раком груди и раком яичников показали, что постхимеотерапевтическое применение IL-3 индуцируют более быструю регенерацию гранулоцитов и тромбоцитов. Однако эти результаты не были подтверждены для 111 стадии. Роль применения только IL-3 в лечении миелопластического синдрома, апластической анемии и других болезней костного мозга была также разочаровывающей. Однако предварительное изучение IL-3 в комбинации с химеотерапевтическими агентами и иммуносупрессивной терапией продемонстрировали обнадеживающие результаты у пациентов с миелопластическим синдромом и апластической анемией. Терапевтический потенциал IL-3 определяется увеличением выхода стволовых клеток из периферической крови. Первые результаты по комбинирорванию IL-3 с GM-CSF или позднее — действующими факторами роста, такими, как гранулоцит — колониестимулирующий фактор показали увеличение выхода стволовых клеток периферической крови. В последние годы доступность агонистов синтетического рецептора IL-3 (IL-3R) и сходных химерических молекул с большей активностью in vitro и меньшими воспалительными побочными эффектами увеличило возможности использовать и сравнивать эти молекулы и rhIL-3 для предотвращения индуцированной химеотерапией миелосупрессии. Роль IL-3 и IL-3R агонистов в ex vivo экспансии стволовых клеток требует дальнейшего изучения. Представляется, что будущее применение IL-3 в комбинации с другими цитокинами является привлекательным путем для предотвращения связанной с лечением смертности и заболеваемости у онкологических пациентов /34/.
Таким образом, пролиферация стволовых клеток является сложнорегулируемым процессом, в котором играют роль, как межклеточные взаимодействия, так и растворимые факторы (цитокины и др.).
продолжение
--PAGE_BREAK--6. Хоуминг стволовых клеток
В биологии стволовых клеток хоумингом называется поселение ствловых клеток в месте повреждения (в широком смысле слова) и поселение трансплантата гемопоэтических клеток в костный мозг (в узком смысле слова).
Рост и дифференцировка гемопоэтических стволовых клеток являются высоко зависимыми от регуляторных молекул, продуцируемых стромальными клетками костного мозга. Данные, накопленные в последние годы, показали, что рецепторы адгезии на гемопоэтических клетках и их лиганды на стромальных клетках и экстрацеллюлярном матриксе играют критическую роль в этих взаимодействиях. Интегрины семейтсва бета 1, в основном VLA-4 и VLA-5, наиболее хорошо охарактеризованы и были идентифицирорваны, как определяющие место прогениторных клеток в гемопоэтической иерархии, определяемой их долговременной способностью к репопуляции in vitro и in vivo. Функциональные исследования показали, что большинство прогениторных клеток эффективно связывются с эндотелиальными клетками костного мозга через бета 1 интегрин, и были описаны линия — и стадия созревания — специфичными различия. Существуют данные о прямом контроле поздней эритроидной дифференцировки VLA-4, но не ясно является ли критически важным участие бета 1 интегринов в функционировании гемопоэтических стволовых клеток в более незрелых стадиях. Многие другие интегриновые и неинтегриновые рецепторы участвуют в адгезивных взаимодействиях и экспрессируются на гемопоэтических прогениторных клетках и жестко регулируются в течение дифференцировки, но их функция остается противоречивой /12/.
У здоровых взрослых гемопоэз происходит в костном мозге, где находится большинство гемопоэтических клеток — прогениторов (ГКП). У пациентов, проходящих курс хемо и/радиотерапии, гемопоэз серьезно нарушен. Восстановление функции костного мозга может быть достигнуто трансплантацией костного мозга или трасплантацией стволовых клеток из периферической крови. Успех трансплантации стволовых клеток зависит от способности внутривенно введенных стволовых клеток размещаться в костном мозге. Этот процесс называется хоумингом. Однако, молекулярный механизм, управляющий этим процессом еще плохо понят. Выдвинута гипотеза, что хоуминг является многоступенчатым процессом, состоящий из адгезии ГКП к эндотелиальным клеткам синусоид костного мозга, за которым следует трансэндотелиальная миграция, направляемая хемоатрактантами, и закрепление во внесосудистых пространствах костного мозга, где уже происходят пролиферация и дифференцировка. В этом связи важны роли хемокина происходящего из стромы фактора 1 (SDF-1) и его рецептора CXCR-4, участие молекул адгезии в индукции полимеризации актина в ГКП. Определение роли хемокинов и молекул адгезии в миграции и приживлении трансплантанта стволовых клеток человека поможет раскрыть внутренние механизмы, которые регулируют хоуминг стволовых клеток, и, в конечном счете, приведет к прогрессу в трансплантации стволовых клеток /59/.
Все зрелые клетки крови могут быть получены из ГСК. Как и все другие гемопоэтические клетки, стволовые клетки мобильны, и эта способность к мобильности позволила трансплантации костного мозга стать рутинной клинической процедурой. Успешная трансплантация требует, чтобы гемопоэтические стволовые клетки поселились в костном мозге, вышли из периферического кровообращения и были стабилизированы в регуляторных нишах во вне сосудистом пространстве костного мозга. Этот процесс хоуминга обратим — гемопоэтические стволовые клетки могут быть освобождены из костного мозга за счет молекулярных взаимодействий, что также важно в хоуминге после за трансплантации. Молекулярные события, регулирующие этот двунаправленный процесс, начинают устанавливаться, и появилось много новых данных, которые проливают свет на процессы в этих сложных физиологических событиях /60/.
Хоуминг транспалантированных стволовых клеток в костный мозг реципиента является критическим шагом в приживлении трасплантанта и инициировании реконструкции костного мозга. В настоящее время достигнуто только частичное понимание клеточных и молекулярных механизмов, управляющих хоумингом. Существует только неполный список молекул адгезии, участвующих в направлении траффика стволовых клеток в микроокружение костного мозга. Альтернативная гипотеза, которая связывает хоуминг с организованным и оркестрованным каскадом событий или со случайной миграцией цирулирующих клеток, находит достаточное экспериментальное подтверждение. Также неопределенна судьба осевших в костном мозге клеток вскоре после трансплантации и скорость, с которой они начинают пролиферировать в своем новом микроокружении. Ограниченное число исследований в этом направлении и несоразмерность в их экспериментальном дизайне увеличивает неразбериху, окружающую эти критические аспекты биологии стволовых клеток. Однако эта область исследований быстро развивается и приближается получение результатов, проясняющих многие из этих вопросов /54/.
Селектины — это лектины клеточной поверхности, участвующие в опосредовании адгезии белых клеток крови к эндотелиальным клеткам и тромбоцитам. Они распознают фукозилированные, сиализированные и в некоторых случаях сульфатированные лиганды, экспрессируемые на гликопротеинах, служащих как функциональные контр — рецепторы. Селектины регулируются на уровне траскрипции, через протеолитический процессинг, через клеточную сортировку и через регулируемую экспрессию гликозил — трансферераз, ответственных за образование функциональных лигандов. Селектины физиологически важны при воспалении, хоуминге лимфоцитов, иммунологических ответах и хоуминге стволовых клеток костного мозга. Они играют роль при атеросклерозе, повреждении ишемии — реперфузии, воспалительной болезни и метастатическом распространении некоторых опухолей /32/.
Недавнее открытие того, что взрослые стволовые клетки способны образовывать новые кровеносные сосуды и клетки паренхимы в тканях, которые они колонизируют, вызвали огромный оптимизм и надежду на то, что эти клетки обеспечат функциональное восстановление поврежденного органа. Использование взрослых стволовых клетк ля регенеративной медицины ставит задачу получения эти клеток в нужном месте с минимальной смертностью и максимальной эффективностью. В идеале тканевоспецифичная колонизация должна быть достигнута путем внутрисосудистого введения стволовых клеток и использования нормальных физиологических процессов, управляющих клеточным траффиком. Критическим для успеха этого направления является использование стволовых клеток, несущих соответствующие мембранные молекулы, которые опосредуют хоуминг из сосудов в тканевой компартмент. Гемопоэтические клетки экспрессируют новую гликоформу CD44, известную, как E-/L-selectin лиганд гемопоэтических клеток (HCELL). Эта молекула является наиболее сильным Е-селектин лигандом, экспрессируемом в любой человеческой клетке /48/.
Таким образом, хоуминг стволовых клеток регулируется межклеточными взаимодействиями и растворимыми факторами. Особую роль в хоуминге принадлежит селектинам.
продолжение
--PAGE_BREAK--7. Маркеры стволовых клеток
Стволовые клетки были идентифицированы и охарактеризованы в различных тканях. Обсуждаются возможные общие свойства стволовых клеток. Высказано предположение, что независимо от их линейного происхождения, стволовые клетки отвечают сходным образом на регуляторные сигналы самообновления и дифференцировки, и похоже на то, что контроль клеточного цикла, контроль ассиметрии/дифференцировки, механизмы клеточной защиты и репарации ДНК и связанные апоптоз/старение сигнальные пути имеют более высокий уровень регуляции в стволовых клетках, возможно, за счет сходных механизмов. Предложен набор генов кандидатов, специфичных для стволовых клеток /9/.
Таким образом, предложен набор генов, характерных для всех стволовых клеток (генные маркеры стволовых клеток).
8. Болезни стволовых клеток
Предложена новая концепция классификации болезней стволовых клеток: (1) аплазия стволовых клеток (апластическая анемия); (2) пролиферативный синдром гемопоэтических стволовых клеток (лейкемия и миелодиспластический синдром); (3) пролиферативный синдром поликлональных гематопоэтических клеток (системные и органоспецифичные аутоиммунные заболевания). Рассатриваются следующие две группы болезней стволовых клеток: болезни мезенхимальных клеток и органоспецифичные болезни стволовых клеток. Связанные с возрастом болезни, такие, как болезнь Альцгеймера, остеопороз и фиброз легких принадлежат к первой, в то время, как карциносаркома в легких и аденокарцинорма эндокринных клеток в животе принадлежит ко второй. Предложен новый метод трансплантации аллогенного костного мозга с использованием резистентных к химеризму, подверженных аутоиммунным заболеваниям MRL/lpr мышей. В этом методе клетки костного мозга, содержащие небольшое количество Т клеток и мзенхимальных стволовых клеток инъецировались непосредственно в полость костного мозга. MRL/lpr мыши, леченные инъециями стволовых клеток, жили более 2 лет без симптомов аутоиммунного заболевания. Для приложимости этого метода к людям разработана его модификация для стволовых клеток костного мозга, полученных от обезьян. В этом методе клетки получали из длинных костей с использованием перфузионного метода, и инъецировали их прямо в полость костного мозга реципиентов. Этот новый метод может стать мощной стратегией лечения различных трудноизлечимых заболеваний /24/.
Таким образом, в настоящее время определены болезни, которые являются болезнями стволовых клеток.
9. Модели для изучения человеческих стволовых клеток
Область изучения мышиных моделей ксенотрансплантации очень выросло в последние две декады. Многие важные аспекты биологии человеческих стволовых клеток могут быть исследованы in vivo с использованием иммунодефицитных мышей, поэтому число различных линий и моделей постоянно увеличивается /35/.
Таким образом, многие вопросы биологии стволовых клеток человека могут быть исследованы на моделях на животных.
1. Иммунология стволовых клеток
Несколько исследований показали, что терапия клеточной трансплатацией, проводившаяся вслед за инфарктом миокарда обладает определенной эффективностью в способствовании заживлению миокарда и последующим восстановлением его функции Крупномасштабная продукция человеческих эмбриональных стволовых клеток, дающих при дифференцировке кардиомиоциты может потенциально обеспечить обильный запас донорских клеток для миокардиальной трансплантации. Существуют, однако, иммунологические барьеры для их использования в клинической терапии у человека. Новый подход состоит в использовании полученных из человеческих эмбриональных клеток кардиомиоцитов для репрограммирования аутологичных взрослых стволовых клеток для экспрессирования кардиомиогенной функции вместо того, чтобы прямо использовать их для трансплантации. Это может быть достигнуто с помощью нескольких новых технологий. Цитопласты с удаленным ядром, полученные из кардиомиоцитов, в свою очередь полученные из эмбриональных стволовых клеток, могут быть внесены в аутологичные взрослые стволовые клетки для получения цитоплазматических гибридов. Взрослые стволовые клетки могут также быть временно пермеализированы и подвергнуты действию цитоплазматичесих экстрактов, полученных из этих кардиомиоцитов. Или альтернативно, интактные или энуклеированные цитопласты из кардиомиоитов, полученных из человеческих эмбриональных стволовыф клеток могут быть культивируемы совместно со взрослыми стволовыми клетками in vitro для обеспечения клеточных контактов и электрических соединений, которые могут способствовать некоторой трансдифференцировке /23/.
Изолированные из ранней бластоцисты эмбриональные стволовые клетки захватывают короткий момент плюрипотентности в развивающемся эмбрионе, о чем свидетельствует их дифференцировка во многие типы соматических клеток in vitro. Хотя эти свойства помогают удовлетворить спрос на “запасные части" для замещения больных или изношенных тканей, их использование в так называемой терапии клеточной замены ставит несколько проблем, не последней из которых является их последующее отторжение. Эмбриональные стволовые клетки могут порождать клеточные типы, необходимые для лечения болезни, в то же время они являются источником гемопоэтических стволовых клеток или терминально дифференцированных дендритных клеток, которые могут содействовать индукции трансплантационной толерантности к замещающим тканям /17/.
Трансплантация стволовых клеток при аутоиммунной болезни отягощена отсутствием определенных клинических данных, способных подтвердить ее пользу. Этот недостаток усугубляется по мере того, как растет стимул ввести и оценить ценность дополнительных технологий, направленных на увеличение безопасности и эффективности процедуры. Развитие эффективного суррогатного анализа для предсказания исхода путем измерения возродившихся аутоиммунных клонов или путем применения основанных на геномике или протеомике технологий для определения ранних рецидивов болезни может иметь ценность для определения преимуществ этих модификаций без необходимости проводить полномасштабные, длительные, рандомизированные исследования. Введение более безопасных аллогенных трансплантационных технологий может увеличить эффективность процедуры, в то время, как работа над пластичностью стволовых клеток костного мозга и/ или интеграции предполагает, что трансплантация стволовых клеток может служить не только для остановки аутоиммунного процесса, но также поставлять клетки, способные заживлять или регенерировать больные органы. Введение терапевтических трансгенов в трансплантируемые клетки может увеличить эффективность трансплантации стволовых клеток, хотя регуляторные сложности испытаний генной терапии, возможно, затормозят этот процесс. Все эти инновации обеспечат большие изменения в практике и целях трансплантации стволовых клеток для лечения аутоиммунных заболеваний в следующем десятилетии /7/.
Lewis X антиген (Le (X)) является маркером стволовых эмбриональных клеток, эмбриональных клеток карциномы, мультипотентных клеток раннего эмбриона у мышей. Le (X) расположен на разветвленных, высокого молекулярного веса поли-N-ацетиллактозаминах (эмбриогликанах). В то время, как эмбриогликан присутствует в человеческих эмбриональных клетках карциномы, он не экспрессируется в человеческих эмбриональных стволовых клетках или клетках внутренней массы. Вместо этого эти клетки экспрессируют SSEA-3 и SSEA-4, оба из которых находятся на гликолипидах. Le (X) является маркером изначальных зародышевых клеток или мультипотентных стволовых клеток, полученных из изначальных зародышевых клеток у мыши и человека. У других видов позвоночных Le (X) широко экспрессируется в ранних эмбриональных клетках и изначальных зародышевых клетках, но способ экспрессии не является полностью одинаковым среди различных видов. Le (X) экспрессируется в невральных стволовых клетках у человека и мышей. Гемопоэтические стволовые клетки не экспрессируют эти углеводные маркеры. Маркером этих клеток является CD34, связанный с мембраной сиаломуцин. Другой сиаломуцин, CD164 (MGC-24v), экспрессируется гемопоэтическими прогениторными клетками. В качестве функции для Le (X) в стволовых клетках предложено способствование действию интегрина, что основано на анализе гликопротеинов маркера, экспериментов по трансфекции сДНК и ингибиторных эффектах анти — Le (X) антител. Наиболее вероятно, что Le (X) антиген, также как поли-N-ацетиллактозамины участвует во взаимодействиях на той же самой мембране. С другой стороны О-связанные олигосахариды CD34 и CD164, вероятно, участвуют в регуляции клеточной адгезии и пролиферации через межклеточное узнавание /40/.
Таким образом, иммунология стволовых клеток является важным разделом биологии стволовых клеток. Особый интерес здесь вызывают иммунологические реакции, вызываемые введением аллогенного трансплантанта стволовых клеток, и определение антигенных маркеров различных типов стволовых клеток.
продолжение
--PAGE_BREAK--