--PAGE_BREAK--Модель інтенсифікації біосинтезу NAD+ в організмі створювали: а/ введенням тваринам NAm та/або N-ГАМК на 6 годин або упродовж 2 тижнів по 20, 100 або 200 мг на кг маси тіла; б/ введенням NAm за 6 годин до забою у дозі 500 мг на кг маси тіла (Чаговець Р.В. та інш., 1977).
Синаптосоми та синаптичні мембрани головного мозку виділяли методом диференційного центрифугування в градієнті густини сахарози за методом Abita J. et al. (1977). В основу процедури виділення ядер клітин головного мозку було покладено метод, розроблений Blobel G. et al. (1966).
У кислотних екстрактах головного мозку, які одержували при його обробці 0,6 н HClO4 (при температурі 0-4оС), визначали вміст NAD+, NADP+, ATP та сорбітолу ферментативними методами (Bergmeyer H.U., 1974).
Специфічне зв’язування [U-14C]NAD+ (питома активність 269 мКи/ммоль, «Amersham», Англія) синаптичними мембранами головного мозку щурів визначали радіолігандним методом (Варфоломеев С.Д. и др., 1982) як різницю між загальним (кінцева концентрація [U-14C]NAD+ 0,32 мкМ) та неспецифічним зв’язуванням у присутності 1000-кратного надлишку неміченого динуклеотиду.
Зворотне поглинання [2-14C]серотоніну (57 мКи/ммоль, «Amersham»), вивчали в інкубаційному середовищі об’ємом 1 мл, що містило 100 мМ Na – фосфатний буфер, рН 7,4; 120 мМ NaCl; 5 мМ КСl; 1 мM CaCl2; 1 мM MgCl2; 0,5 мM Na2HPO4; 10 мМ глюкозу; 10 мкМ іпроніазид (Gandhi V.C., 1990). До інкубаційного середовища вносили 0,5 мг білка синаптосом та преінкубували 5 хв при 37oC. Після цього додавали мічений серотонін, кінцева концентрація якого становила 1,48 мкмоль/л. Після закінчення інкубації (10 хвилин за температури 370С) проби швидко фільтрували через фільтри GF/C «Whatman» та промивали 15 мл 0,1 М фосфатного буферу. Поглинену синаптосомами радіоактивність на висушених фільтрах підраховували у РС-101 на рідинно-сцинтиляційному спектрометрі SL-30 («Intertechnique», Франція).
Для визначення вивільнення [2-14C]серотоніну фільтри з навантаженими міченим серотоніном синаптосомами поміщали у перфузійні камери, приєднані до перистальтичного насосу і промивали 6 мл інкубаційного середовища (в яке вносили досліджувані агенти) зі швидкістю 1,0 мл/хв. Фракції з радіоактивністю, що вивільнилась, збирали кожної хвилини упродовж 6 хв і підраховували радіоактивність в сцинтиляційній рідині РС-103.
Мембранний потенціал вимірювали за поглинанням ліпофільного катіону тетра[3Н]фенілфосфонію броміду ([3H]ТФФ+, 20 Ки/ммоль, «Amersham») синаптосомами головного мозку щурів (Pauwels P.J., 1986). Кінцева концентрація катіону становила 2,5 нмоль/л. Величину потенціалу розраховували як різницю поглинання [3H]ТФФ+ синаптосомами головного мозку за високої (1) та низької (2) концентрації K+, використовуючи рівняння Нернста: Е = ─ 26,7ln[3H]ТФФ1+/[3H]ТФФ2+, де [3H]ТФФ1+ та [3H]ТФФ2+ — радіоактивність на фільтрах після інкубування синаптосом у середовищі 1 та 2. За умов проведених експериментів величина Е дорівнювала 0 при концентрації KCl 120ммоль/л.
Активність Na+,K+-АТPази (АТР: фосфогідролаза 3.6.1.3)визначали за утворенням неорганічного фосфату як різницю між сумарною активністю АТРаз та активністю Ca2+,Mg2+-АТФази (у присутності 0,1 мМ уабаїну) (Rathbun P.J., 1969).
Про активність полі-ADP-рибозополімерази (NAD+: полі(аденін-дифосфат-D-рибозил)-акцептор-ADP-D-рибозилтрансфераза 2.4.2.30) судили за кількістю радіоактивно мічених ADP-рибозильних фрагментів NAD+, включених до загальних ядерних білків клітин головного мозку щурів, за методом Tanigawa Y. et al., 1977. Рівень базального та індукованого холерним токсином (2 мкг преактивованого у 20 мМ дитіотрейтолі токсину на 1 мг білка синаптосом) моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків оцінювали за включенням [U-14C]ADP-рибозильних фрагментів NAD+ до синаптосомальних білків (Qian Z. et al., 1983).
Інтенсивність процесів ПОЛ оцінювали за рівнем дієнових кон’югатів (Тимирбулатов Р.А., 1983) та ТБК-активних продуктів (Тимирбулатов Р.А., 1981). При визначенні вмісту дієнових кон’югатів у гомогенаті мозку, їх екстрагували у гептан-ізопропаноловій суміші та вимірювали оптичну густину гептанового шару (l = 233). Вміст ТБК-активних продуктів визначали спектрофотометрично за їх реакцією з тіобарбітуровою кислотою. Ступінь пошкодження ДНК визначали спектрофотометрично за (Ходарев Н.Н. и др., 1981).
Результати досліджень оброблялись статистично з використанням t-критерію Стьюдента.
Результати досліджень та їх обговорення
1. Молекулярні механізми нейромодуляторної дії NAD+ у нервових закінченнях. Мембранні системи пасивного та активного іонного транспорту, визначаючи проникність мембрани для іонів за деполяризації як необхідної передумови нейросекреції, можуть бути залучені до механізму NAD-індукованого вивільнення медіаторів. З огляду на це досліджували роль потенціалкерованих Na-каналів та Na+,K+-АТPази синаптичних мембран у прояві нейромодуляторних ефектів NAD+, використовуючи нейротоксини, дія яких на канальні структури збудливих мембран добре відома, а також інгібітор Na+,K+-АТPази – уабаїн.
Рис. 1. Вивільнення [2-14С]серотоніну синаптосомами головного мозку щурів при дії нейротоксинів та NAD+ (1мкМ), M±m, n=5-7; Примітка: абсолютну величину вивільнення в контролі (К) – 17,3 ±0,85 пмоль/0,2 мг білка прийнято за 100 ±4,3 %
Показано, що при внесенні у середовище інкубування синаптосом головного мозку щурів тетродотоксину (ТТХ) — специфічного блокатору потенціалчутливих Na-каналів — вивільнення [2-14C]серотоніну синаптосомами під дією NAD+ (1 мкМ) суттєво знижувалось (рис. 1). Блокувальний ефект ТТХ на NAD-індуковане
вивільнення медіатору свідчить про активацію саме потенціалчутливих Na-каналів у механізмі реалізації нейромодуляторних ефектів NAD+. На тлі дії активатору Na-каналів вератридину (VTD) або латротоксину (LTX, формує канали з широкою селективністю до одно та двохвалентних катіонів), які стимулювали вивільнення серотоніну на 70 та 120 % відповідно, істотні ефекти NAD+ відсутні (рис. 1). Вірогідно, модифікація під впливом досліджуваних токсинів канальних іонотранспортувальних структур призводить до швидкого виснаження екзосекреторної активності синаптосом, внаслідок чого NAD+ не спроможний додатково стимулювати процес вивільнення нейромедіатору.
Рис. 2. Вплив in vitro NAD+ та нікотинаміду (10-3,10-5,10-6 М) на мембранний потенціал (а) синаптичних закінчень мозку щурів (К – контроль; А – аденозин, 10-6 М; ● — NAm; □ – NAD+) та вивільнення [2-14С]серотоніну синаптосомами (б, контроль — 100%), M ± m, n=5
Це не виключає залучення пулу готових до вивільнення везикул у механізмі NAD-залежного вивільнення серотоніну. Внесення в інкубаційне середовище уабаїну призводило до 24 %-го підвищення рівня вивільнення [2-14С]серотоніну у порівнянні зі спонтанним. Додавання NAD+ у кількості, необхідній для створення його кінцевої концентрації 10-6 М, сприяло подальшому підвищенню вивільнення медіатору. Очевидно уабаїн, викликаючи помірну деполяризацію синаптичних мебран, залучає лише певну частину пулу готових до вивільнення везикул в даному активному секреторному процесі, що дозволяє динуклеотиду надалі стимулювати вивільнення нейромедіатору за механізмом екзоцитозу.
Дослідження залежності гідролізу АТР синаптосомальною Na+,K+-АТPазою від концентрації субстрату при одночасній дії NAD+ (1 мкМ) продемонструвало гальмівний ефект динуклеотиду на активність цього ферменту. Установлене інгібування відноситься до типу неконкурентного, адже воно не послаблювалось при підвищенні концентрації субстрату (1000-кратний надлишок). Показано також, що динуклеотид концентраційнозалежно (1 мМ – 0,1 мкМ) знижує активність Na+,K+-АТPази синаптосом, тоді як на рівні синаптичних мембран лише експозиція 1 мМ NAD+ призводить до 25 % інгібування активності. Одержані результати вказують на важливість субмембранних компонентів, які на відміну від очищених мембран може містити фракція синаптосом, для механізму NAD-індукованого гальмування активності Na+,K+-АТРази, що не виключає можливості опосередкованої модифікації Na+,K+-помпи певними протеїнкіназами функціонально асоційованими з NAD-зв’язувальним білком. Згідно з отриманими нами даними нейромодуляторна дія динуклеотиду, імовірно, може реалізуватись через активацію фосфорилювання ефекторних білків синаптичних закінчень під дією протеїнкінази С/А, з огляду на здатність Н7, інгібітору цих кіназ, блокувати ефекти NAD+ на вивільнення серотоніну.
Таблиця. Вміст нуклеотидів у головному мозку за діабетичної невропатії: ефект двохтижневого введення нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК, мкмоль на 1 г тканини (M ± m, n=6-8)
Передбачається, що нікотинамід може конкурувати за місця специфічного зв’язування NAD+ на синаптичних мембранах мозку щурів. Проте на сьогодні нема чіткої відповіді, яким є характер його нейромодуляторної дії in vitro. У зв’язку з цим у порівняльному аспекті вивчали ефекти NAD+ та NAm у синаптичних закінченнях з метою оцінки можливості залучення NAD+-зв’язувального білка синаптичних мембран до механізму реалізації нейротропної дії вітаміну РР. Як виявилось, ефекти NAm (0,001-1 мМ) на мембранний потенціал та вивільнення серотоніну є значно менш вираженими ніж при внесенні відповідних концентрацій NAD+ (рис. 2). Недостатня ефективність NAm у проведеному порівняльному дослідженні свідчить про те, що його нейротропна дія як попередника біосинтезу NAD+ можливо опосередкується нейромодуляторними ефектами динуклеотиду через NAD-зв’язувальний білок.
2. Специфічне зв’язування [U-14C]NAD+ синаптичними мембранами при цукровому діабеті 1 типу та за умов інтенсифікації біосинтезу NAD+. У ході роботи важливо було з’ясувати ті функціональні та біохімічні порушення у ЦНС, які можуть впливати на NAD-модуляторну систему за цукрового діабету 1 типу. Подібно до зниження внутрішньоклітинного вмісту нікотинамідних динуклеотидів як спільної патобіохімічної ознаки багатьох захворювань нервової системи [Maiese K. Chong Z.Z., 2003; Skaper S.D., 2003], за діабету також виявлено зниження рівня NAD+ у головному мозку (на 30 %), таблиця. Очевидно, що дефіцит NAD+ не пов’язаний з посиленням фосфорилювання динуклеотиду, так як вміст NADP+ був також знижений на 23 %. Установлені за ЦД1 зміни у забезпеченості мозку нікотинамідними динуклеотидами можна цілком
Рис. 3. Активність полі-ADP-рибозополімерази у ядрах клітин головного мозку щурів за введення нікотинаміду та N-ГАМК (мкмоль інкорпорованої [U-14C]ADP-рибози*10-5/хв на мг білка, M ± m, n = 8-10)
пояснити виявленим посиленим використанням NAD+ як субстрату у процесах полі-АDP-рибозилювання ядерних білків в ході репарації ДНК. Продемонстровано більш ніж 20 % підвищення активності ядерної полі-АDP-рибозополімерази за діабету у порівнянні з контролем (рис. 3). Це відбувається одночасно з інтенсифікацією вільнорадикальних процесів у ЦНС, про що свідчить акумулювання у мозку первинних та кінцевих продуктів ліпопероксидації — відповідно дієнових кон’югатів (не наведено) та ТБК-активних продуктів (рис. 4). Не виключено, що одним з фізіологічно небезпечних наслідків виснаження внутрішньоклітинного пулу NAD+, обумовленого інтенсифікацією NAD-залежного полі-ADP-рибозилювання ядерних білків, можна вважати паралельно встановлену за діабету нестачу ATP у мозку (таблиця).
Як видно з результатів дослідження, представлених на рис. 5 та 6, на тлі зниженого вмісту NAD+ за діабету має місце істотне, на 51 %, підвищення його специфічного зв’язування синаптичними мембранами у порівнянні з контролем, що здійснюється за рахунок підвищення кількості місць зв’язування NAD+ без зміни спорідненості білка-рецептора до нуклеотиду. Величина високоафінної компоненти зв’язування у контролі становить Кд = 0,33 мкМ (рис. 5).
Рис. 4. Вміст ТБК-активних продуктів у гомогенатах головного мозку щурів за введення нікотинаміду
Для оцінки залежності рецепції NAD+ від забезпеченості мозку нікотинамідними нуклеотидами у порівняльному аспекті досліджували короткотривалі (6 годин – час, за який досягається максимум біосинтезу динуклеотидів) та довготривалі (2 тижні) ефекти низької (20 мг/кг маси тіла) та високої (200 мг/кг) доз NAm та N-ГАМК за ЦД1. З’ясовано, що досліджувані сполуки у використаних дозах як за короткотривалого, так і за довготривалого введення приблизно однаково ефективно впливали на вміст NAD+, фактично повертаючи його до рівня контролю. Однак, прямої залежності між вмістом NAD+ та його рецепцією синаптичними мембранами за різної забезпеченості нервової системи цим динуклеотидом ми не виявили. Отримані результати засвідчили відсутність будь-яких суттєвих ефектів сполук у досліджуваних дозах на зв’язування NAD+ синаптичними мембранами за їх короткотривалої дії.Досягнення фармакологічного ефекту вітаміну РР на відновлення рецепції NAD+ потребувало хронічного введення його високих доз (рис. 6), що поряд з можливістю безпосередньої взаємодії NAm з NAD-зв’язувальним білком, фактично свідчить про залучення механізмів більш опосередкованої та віддаленої у часі дії вітаміну на нейрохімічні процеси у нервових клітинах, які можуть бути пов’язані зі встановленими антиоксидантними властивостями NAm та N-ГАМК (рис. 4), а також з їх роллю як інгібіторів полі-АDР-рибозилювання білків (рис. 3).
Рис. 5. Зв’язування [U-14C]NAD+ синаптичними мембранами в нормі та за умов діабету (A) та його графічний аналіз за Скетчардом (Б): 1-контроль; 2-діабет; 3- діабет + NAm (20 мг/кг), M ± m, n = 5
3. Стан серотонінергічної медіаторної системи за цукрового діабету та при введенні вітаміну РР. Оскільки з одного боку NAD+ та серотонін мають спільного попередника біосинтезу, триптофан, а з іншого – динуклеотид є модулятором серотонінергічної медіаторної системи, то виявлені зміни вмісту NAD+ у головному мозку та його рецепції синаптичними мембранами могли б призводити до змін у функціонуванні цієї нейромедіаторної системи. Установлено, що пов’язані з діабетом порушення синаптичної функціївключаютьзростання рівня спонтанного вивільнення міченого серотоніну (рис. 7), що супроводжується зниженням електрохімічного градієнту іонів у синаптичних мембранах нервових закінчень.
Рис. 6. Зв’язування [U-14C]NAD+ синаптичними мембранами головного мозку щурів: 1 – контроль; 2 – діабет; 3 – діабет + NAm (20 мг/кг); 4 — діабет + NAm (200 мг/кг); 5 — діабет + N-ГАМК (200 мг/кг)
Деполяризація синаптосом KCl (25 мМ) або 4-амінопіридином (4-AP, 0,1 мМ) індукувала вдвічі більш істотне, на додаток до базального, вивільнення серотоніну за діабету у порівнянні з контролем (рис. 7б). При цьому вивільнений серотонін в обох випадках, імовірно, походить з одного і того ж везикульованого пулу медіатору. Підвищена відповідь синаптосом на дію деполяризаторів за цукрового діабету узгоджується з можливістю посилення за патології ендогенного фосфорилювання певних ефекторних білків апарату екзоцитозу (Shoji-Kasai Y. et al, 2002). Як введення NAm, так і N-ГАМКпризводило до часткової нормалізації процесів зворотного поглинання та вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку, але при цьому дія NAm була більш вираженою.
Рис. 7. Вивільнення [2-14C]серотоніну синаптосомами головного мозку (а) за дії екзогенного NAD+ (1 мкМ); (б) 4-амінопіридину та KCl: 1 – відповідний контроль; 2 – 4-АР (0,1 мМ); 3 – KCl (15 мМ), M ± m, n = 10-12
Доказом того, що індуковані цукровим діабетом порушення у функціонуванні центральних нейромедіаторних систем можуть включати зміни у нейромодуляторних процесах за участю NAD+ є те, що екзогенно доданий до суспензії навантажених [2-14С]серотоніном синаптосом головного мозку діабетичних щурів NAD+ (1 мкМ) виявився не здатним у порівнянні з контролем істотно стимулювати вивільнення медіатору (рис. 7а). Отже, загальні зміни вмісту NAD+у клітинах мозку та порушення процесу його специфічного зв’язування за діабету, напевно, негативно позначаються на ефективності механізму функціонального спряження рецепторної та/або трансдукуючої/ефекторної ланки у клітинному сигналингу NAD+. Відновлення зв’язування супроводжувалось нормалізацією відповіді синаптосом на нейромодуляторну дію екзогенного NAD+ у групі тих діабетичних тварин, які отримували нікотинамід у дозі 200 мг/кг маси тіла.
4. Роль сигнального шляху Gs-білок/cAMP/протеїнкіназа А та процесів моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків у вивільненні серотоніну за ЦД1та при введенні вітаміну РР. Передача сигнальної інформації через NAD-зв’язувальний білокта нейрохімічні ефекти вітаміну РР і його біологічно активних похідних за умов ЦД1 можуть здійснюватись на рівні процесів, які пов’язані зі складною регуляцією синаптичної функції із залученням різних типів посттрансляційної модифікації функціонально важливих білкових молекул.Нами встановлено можливу патогенетичну роль активації сигнального шляху cAMP/протеїнкіназа А та PKA-залежного фосфорилювання у порушенні вивільнення серотоніну за цукрового діабету, так як H89, специфічний інгібітор PKA, знижує in vitro вивільнення [2-14С]серотоніну синаптосомами головного мозку діабетичних щурів (рис. 8).
продолжение
--PAGE_BREAK--