А.В.Пизов – кандидат биологических наук, ассистент кафедры методики преподавания естественно-математических дисциплин в начальной школе Ярославского государственного педагогического университета им.К.Д.Ушинского; В.Н.Левин – доктор медицинских наук, профессор, зав.кафедрой МБОС Ярославского государственного педагогического университета им.К.Д.Ушинского.
В последние годы внимание специалистов всё больше привлекает изучение функциональных свойств таких клеток крови как лейкоциты, к которым относятся гранулоциты, моноциты и лимфоциты. Лейкоциты играют главную роль в развитии воспаления (C. Rosales et al., 1995). Воспаление может быть острым или хроническим, однако в процессе развития воспалительной реакции, как правило, наблюдаются признаки обоих форм воспаления.
Несмотря на то, что роль лейкоцитов в защите организма известна ещё со времен работ И. И. Мечникова в 1892 году, а каждый вид лейкоцитов имеет свои характерные особенности и свою уникальную роль в защите, детали и механизмы исполнения лейкоцитами, их функций пока изучены неполно.
Ценность любой фагоцитарной реакции в её скорости, опережающей развитие микробного или иного повреждения. Перемещение лейкоцитов в пространстве относится к числу наиболее характерных признаков белых клеток крови. У лейкоцитов достаточно хорошо выражены обе основные формы клеточного движения – ненаправленная, или случайная миграция, и направленная, или хемотаксис.
В литературе встречаются работы о целенаправленном движении фагоцитов – хемотаксисе ( N.D.Tan et al., 1995). Первыми были работы S. Boyden (1962), показавшего способность лейкоцитов к активной миграции. Активное перемещение в пространстве характерно для большинства клеток белой крови, однако наиболее характерно для нейтрофилов (А.Н.Маянский и соавт., 1989; R.A.Erger et al., 1995).
Двигательная активность лейкоцитов изменяется при различных заболеваниях. Так, выявлено значительное нарастание миграционной способности белых клеток крови у больных в острой фазе воспаления, а при таких состояниях, как агранулоцитоз, отмечено снижение двигательной активности. Нарушение хемотаксиса происходит при ряде врожденных заболеваний фагоцитарной системы: синдроме Чедиака-Хигаси, синдроме Швахмана-Диамонд, болезни накопления гликогена, дефиците специфических гранул нейтрофилов; а также вторичных (приобретенных) иммунодефицитных состояниях, развивающихся при ожоговой болезни, диабете, злокачественных заболеваниях, у больных с хроническими вирусными (СПИД, грипп, герпес и др.) и грибковыми инфекциями.
Изучение миграционной способности белых клеток крови способствует расширению знаний об активных свойствах лейкоцитов и отражает их функциональные возможности при протекающих в организме патологических процессах. Материал и методы исследования
Объектом исследования служила кровь из локтевой вены, взятая у 36 больных с диффузным заболеванием соединительной ткани. Все больные – женщины в возрасте от 30 до 44 лет. Средний возраст на момент обследования составил 37 лет.
Оценка степени активности болезни (обострение – ремиссия) у пациентов СКВ проводилась согласно критериям В.А.Насоновой (1972; “Ревматические болезни”, 1997) в соответствии с выраженностью клинических симптомов и уровнем лабораторных показателей.
Контрольную группу составили 10 практически здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту.
Миграционную активность лейкоцитов оценивали в тесте миграции на стеклянных пластинках под агаром ( Т.Ф. Соколова и соавт., 1983; T.E.Clausen, 1971; R.D.Nelson et al., 1975).
Суспензию клеток вносили в две лунки агарового геля (из расчёта 7-10х105 клеток в каждую лунку), который предварительно готовили следующим образом: 15 мг агарозы добавляли в стерильную воду (5 мл), кипятили в течение 20 минут на водяной бане, охлаждали до 45 С. Пять миллилитров питательной среды № 199, предварительно нагретой до 45 С, смешивали с агарозным гелем и полученную агаровую среду заливали на стеклянные пластинки. После застывания агара в нём пробойником делали 3 одинаковые лунки диаметром 2,5 мм и глубиной – 2,0-2,5 мм: две, контрольную и опытную, для суспензии лейкоцитов, третью — для хематтрактанта. После этого стеклянные пластинки помещали во влажную камеру, где клетки культивировали в течение 18 часов при 37 С в атмосферном воздухе с 5% содержанием СО2. Затем препараты фиксировали 1,5 часа 2,5% раствором глутарового альдегида. После этого агар удаляли, клетки окрашивали азур II-эозином. Делали микрофото и определяли площадь миграции лейкоцитов. В качестве хематтрактанта использовали аутологичную сыворотку крови, малый фрагмент сывороточного комплемента которой (С5а) является сильным хемотаксическим фактором для лейкоцитов.
Определяли следующие величины: А — площадь миграции лейкоцитов в контрольной лунке (спонтанная двигательная активность); Б — площадь перемещения белых клеток крови в опытной лунке (стимулированная миграция). Кроме этого, вычисляли следующие показатели: Б-А – хемотаксическая разница. Результаты и их обсуждение
Как было указано выше, способность белых клеток крови к миграции играет важную роль в воспалительных реакциях организма за счёт поступления лейкоцитов в очаг воспаления. Нарушение этого процесса снижает резистентность к инфекции и способствует её распространению.
В ходе исследования определяли площадь спонтанной и стимулированной миграции лейкоцитов у практически здоровых лиц и у больных ДЗСТ в периоды обострения и ремиссии основного патологического процесса.
В группе практически здоровых лиц средняя величина спонтанной миграции лейкоцитов составляла 4,4 0,3 мм2 и колебалась от 2,3 до 5,5 мм2, средняя площадь стимулированной миграции составляла 4,4 0,2 мм2.
Площадь спонтанной миграции лейкоцитов при ДЗСТ в период обострения в среднем была равна 6,5 2,2 мм2, варьируя от 3,3 до 28,8 мм2. В 90,9% случаев площадь миграции составляла 8,4 мм2. Площадь стимулированной миграции лейкоцитов у больных ДЗСТ составляла 5,9 1,6 мм2. Максимальная площадь при этом соответствовала 21,5 мм2, минимальная – 1,7 мм2. В большинстве случаев (81,8%) площадь стимулированной миграции занимала 5,7 мм2.
При ДЗСТ отмечалась более интенсивная спонтанная миграционная способность лейкоцитов (p
При ДЗСТ в период обострения площадь стимулированной миграции лейкоцитов (S 1 = 5,9 мм2 ) в среднем уменьшалась на 0,6 мм2 по сравнению с площадью спонтанной миграции лейкоцитов (S 2 = 6,5 мм2). При ДЗСТ отмечается достоверное увеличение площади спонтанной миграции лейкоцитов по сравнению с группой практически здоровых лиц (p
Таким образом, при ДЗСТ в период обострения наблюдается достоверное увеличение площади спонтанной миграции лейкоцитов. Однако площадь стимулированной миграции лейкоцитов в ответ на действие хематтрактанта (сыворотка крови) при ДЗСТ не имела достоверных различий по сравнению с практически здоровыми лицами.
В период ремиссии основного патологического процесса площадь спонтанной миграции лейкоцитов у больных ДЗСТ в среднем составляла 7,1 1,9 мм2. Максимальный размер площади спонтанной миграции в этот период составлял 23,9 мм2, минимальный — 1,2 мм2. В 72,7% случаев площадь миграции варьировала в пределах 1,2 — 5,7 мм2. В период ремиссии основного патологического процесса отмечалось достоверное увеличение площади спонтанной миграции по сравнению с контрольной группой в среднем на 2,7 мм2 (p
Площадь стимулированной миграции при ДЗСТ в период ремиссии основного патологического процесса в ответ на действие хематтрактанта в среднем была равна 7,0 1,6 мм2. Максимальная площадь миграции лейкоцитов при этом составляла 17,9 мм2, минимальная — 0,5 мм2. В 55% случаев площадь стимулированной миграции была зарегистрирована в пределах 3,9 — 7,5 мм2. У больных ДЗСТ в период ремиссии основного патологического процесса отмечалось достоверное увеличение площади, занимаемой лейкоцитами в ходе стимулированной миграции (p
При ДЗСТ в период ремиссии площадь, занимая лейкоцитами при стимулированной миграции, в среднем уменьшилась на 0,1 2,4 мм2 по сравнению с площадью при спонтанной миграции.
Таким образом, по данным изучения миграционной активности лейкоцитов при ДЗСТ в период ремиссии основного патологического процесса видно, что эти больные имеют достоверные различия по размерам площадей, занимаемых лейкоцитами как при спонтанной, так и при стимулированной миграции по сравнению с контрольной группой, что отражает более активную способность клеток белой крови к миграционным процессам. Площадь, занимаемая лейкоцитами в ходе спонтанной и стимулированной миграции, в период ремиссии была достоверно больше (p
/>
1– средняя площадь спонтанной миграции, мм2;
2– средняя площадь стимулированной миграции, мм2.
Рисунок 1
При изучении хемотаксических свойств лейкоцитов наблюдалось усиление миграции лейкоцитов как при обострении, так и при ремиссии основного патологического процесса по сравнению с группой здоровых лиц. Площадь распространения белых клеток крови при спонтанной миграции была достоверно выше при обострении процесса (6,5 2,2 мм2). По достижении ремиссии наблюдалось дальнейшее увеличение площади спонтанной миграции лейкоцитов (7,1 1,9 мм2) по сравнению с контрольной группой (4,4 0,3 мм2). Такая же закономерность наблюдалась и при исследовании стимулированной миграции лейкоцитов: с переходом обострения в стадию ремиссии стимулированная миграция достоверно увеличивалась с 5,9 1,6 мм2 до 7,0 1,6мм2, достоверно отличаясь (p
В то же время была определена взаимосвязь между субпопуляциями лейкоцитов и их миграционной активностью. Увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов в период обострения сопровождалось увеличением площади при спонтанной миграции лейкоцитов (r=0,7720, p
Таким образом, дезорганизация соединительной ткани, происходящая у больных ДЗСТ, сопровождается нарушениями функциональных свойств нейтрофильных гранулоцитов, которые проявляются в изменении миграционной активности. Выявленные нарушения функций являются следствием морфофункциональных изменений лейкоцитов у пациентов с ДЗСТ по сравнению с практически здоровыми лицами. Список литературы
Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге.-Новосибирск: Наука, 1989.- 254 с.
Мечников И.И., Акад. собр. соч. – М., 1950. – Т.6.
Насонова В.А. Системная красная волчанка.-М.: Медицина, 1972.-248 с.
Ревматические болезни. Руководство для врачей. / Под ред. В.А.Насоновой, Н.В.Бунчука.- М.: Медицина, 1997.- 520 с.
Соколова Т.Ф., Редькин Ю.В. Изучение спонтанной миграционной активности лейкоцитов под агаровым покрытием. // Лаб. дело.- 1983.- N 1.- С. 31-33.
Boyden S.The chemotactic of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.// J. exp. Med.-1962.-Vol. 115.-P. 453-466.
Clausen J.E. Tuberculin-induced migration inhibition of human peripheral leucocytes in agarose medium. // Acta Allerg. – 1971.- V 26.- P. 56-61.
Erger R.A., Casale T.B. Comparative studies indicate that platelet-activating factor is a relatively weak eosinophilotactic mediator. // Am-J-Respir-Cell. Mo. Biol.- 1995.- Vol. 12, N 1.- P. 65- 70.
Nelson R.D., et al. Chemotaxis under agarose: a new and simpl method for measuring chemotaxis and spontanequs migration of human polymorphonuclean leukocytes and monocytes. // J. Immunol.-1975.- N 115.- P. 1650- 1656.
Rosales C., Juliano R.L. Signal transduction by cell adhesion receptors in leukocytes. // J. Leukoc. Biol.- 1995.- Vol. 57, N 2.- P. 189- 198.
Tan J., Deleuran B., Gesser B. et al. Regylation of human T lymphocyte chemotaхis in vitro by T cell-derived cytokines IL-2, IFN-gamma, IL-4, IL-10, and IL-13. // J. Immunol.- 1995.- Vol 154, N 8.- P. 3742- 3752.