--PAGE_BREAK--Визначення проапоптичної активності Igплазми крові хворих на РС проводили за методом G. Zauli (1993), використовуючи електрофорез тотальної ДНК моноядерних клітин периферійної крові (МКПК) хворих на РС. Розподіл фракцій деградованої ДНК визначали, використовуючи програму Gel-Pro 3.1. “Кометний” аналіз ДНК МКПК хворих на РС проводили, як описано у роботі Камінський В.О. та співавт. (2005). Підрахунок кількості комет ДНК проводили під мікроскопом при збільшенні Ч 200-400. У зразку рахували не менше 500 клітин. Комети поділяли на 5 класів залежно від співвідношення ДНК у «голові» та «хвості» комети.
Дослідження каталітичної дії Igплазми крові.
1. Гідроліз ОБМ. IgG досліджували, як описано у роботі Latry V. at al. (2003).
2. Визначення зв’язування ОБМ імуноглобулінами плазми крові за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА).ІФА здійснювали, як описано в Vojdani A. et al. (2003).
3. Активність IgGщодо гідролізу ДНК. ДНК-азну активність IgG визначали, як описано (Gabibov A.G. et al., 2000).
Статистична обробка отриманих результатів. Статистичне опрацювання результатів з визначення цитотоксичної дії препаратів Ig здійснювали за допомогою програми OriginPro 7.0, вираховуючи t-критерії Стьюдента. Достовірними вважали зміни показників за умови Р
Результати власних досліджень та їх обговорення. Згідно з результатами проведених нами досліджень (1-й етап), серед 173-х обстежених хворих переважали жінки над чоловіками (1,33:1), що підтверджує участь гормональної дисфункції в патогенезі РС. Показали деякі відмінності у порівнянні з даними літератури щодо вищої частоти захворювання в осіб віком 40 — 49 років (43,93%). Кількість хворих віком понад 50 років також виявилася вагомою (29,48%). Ймовірно, така перевага (73,41%) хворих старших 40 років й обумовлює злоякісність перебігу РС у західному регіоні України, зокрема у Львівській області. Найбільша кількість хворих мала тривалість захворювання понад 10-ть років (57,79%) і від 6-ти до 10-ти років (26,59%). Виявили статистично вірогідну більшу кількість хворих із тривалістю захворювання від 1-го до 5-ти років та від 6-ти до 10-ти років у ЕЗ порівняно з ЕЧ районами Львівської області. Кількість обстежених хворих із церебро-спінальною клінічною формою була найбільша порівняно із церебральною та спінальною (54,91% проти 28,9% та 16,18% відповідно) з перевагою у ЕЗ районах. Серед оглянутих хворих на РС переважали пацієнти із РР і ВП типами перебігу патологічного процесу (по 39,3% у кожній підгрупі). 20,8% пацієнтів перебували на етапі первинного прогресування, що є значно вищим відсотком порівняно з даними літератури (10-15%) (Вінничук С.М. та співавт., 2000; Завалишин И.А. и соавт., 2002; Соколова Л.І., 1998; Montablan X., Rio J., 2001; Runmarket B., Andersen O., 1993), і може пояснити агресивність перебігу РС у нашому регіоні. Водночас, кількість хворих на стадії вторинного прогресування виявилася вагомішою в ЕЗ порівняно з ЕЧ районами. Найбільшу кількість хворих на РС було виявлено із середньої тяжкості (42,19%) та тяжкими (50,87%) проявами патологічного процесу, з перевагою останніх у ЕЗ районах області.
Таким чином, статистично достовірну перевагу хворих із церебро-спінальною формою, тяжким ступенем інвалідизації (6-9,5 балів за шкалою Куртцке), а також у стадії вторинного прогресування патологічного процесу було зафіксовано в ЕЗ порівняно із ЕЧ районами Львівської області. Зроблено висновок про відсутність клінічних відмінностей у перебігу РС серед жителів одного навіть великого міста. Отримані еколого-епідеміологічні асоціації при оцінці клінічного перебігу РС і ступеня забрудненості грунтів, на яких проживають обстежені пацієнти, співпадають з даними інших авторів (Lauer K., 1995; Lauer K., 1989). При наявності генетичної схильності (Завалішин І.А. і співавт., 2002) цей та інші екзо- і/або ендогенні фактори ризику можуть впливати не тільки на ризик розвитку РС, але й на особливості клінічних виявів захворювання в подальшому.
При аналізі клінічних виявів РС у дебюті цього захворювання встановлено, що 78,61% серед оглянутих хворих – постійні мешканці нашого регіону, 89,02% із середніх та вищих соціальних верств, 89,01% мають середню спеціальну і вищу освіту, що узгоджується з даними літератури (Гусев Е. И. и соавт., 2004). Підтвердили факт збереження повних сімей при наявності хворого на РС одного із її членів (69,36%), а при аналізі умов соціально-побутового статусу та анамнезу захворювання у обстежених виявили професійні шкідливості (інсоляція, переохолодження, контакт з барвниками, розчинниками) у 45,66% осіб, перенесені інфекційні хвороби у 26,01%, шкідливі звички (вживання алкоголю, паління) у 24,85% та часті стресові ситуації – у 15,03% випадків. Водночас, частка осіб, які не змогли вказати на будь-який причинний фактор, також виявилася досить вагомою (31,21%).
На думку багатьох авторів (Бойко А.Н. и соавт., 2003; Длмина Т.Л. и соавт., 2006) клінічні особливості дебюту РС можуть вказати, як це захворювання буде себе вести в подальшому, що й було підтверджено власними дослідженнями. Так, незважаючи на перевагу моносиндромного дебюту РС у Львівській області (у 43,93% обстежених хворих) проти полі- і олігосиндромного, він володів наступними прогностично несприятливими ознаками: у 82,08% хворих був середньої тяжкості або тяжким, у 54,91% характеризувався гострим (до 7-ми днів) або інсультоподібним (години) початком, у 94,21% обстежених був тривалим (1 місяць і більше) або середньої тривалості (3 — 4 тижні), а у 94,79% — сповільнений (1місяць і більше) або поступовий (3 — 4 тижні) вихід з нього. Причому, в ЕЗ районах була статистично вірогідна перевага хворих на РС із тяжким, тривалим дебютом, інсультоподібним темпом входження і сповільненим виходом з нього.
Розглянувши особливості клінічного перебігу РР РС в ЕЧ та ЕЗ районах Львівської області, виявили статистично вірогідне превалювання хворих із рецидивами середньої тяжкості (23,12%) і різної тяжкості (9,25%) при мінімальній кількості пацієнтів із легкими рецидивами (2,31%); з поступовим (1 – 4 тижні) і сповільненим (більше 4 тижнів) темпами виходу з рецидиву; з одномоментною появою симптомів та синдромів при входженні у рецидив у жителів ЕЗ (10,4%) порівняно з ЕЧ (2,3%). Водночас, зафіксовано найбільшу кількість пацієнтів із короткотривалими (до 1 місяця) рецидивами (15,6%). Стосовно особливостей перебігу ВП РС було достовірно встановлено, що цей тип перебігу розвивався одразу після фази ремісії, яка йшла слідом за дебютом захворювання, без етапу попереднього рецидивування. Причому, стан прогресування у більшості обстежених був дуже коротким (від 1-го до 5-ти років). Отже, два типи перебігу РС (РР та ВП) у Львівській області мають низку негативних рис, які, не виключено, можуть бути обумовленими несприятливими екологічними факторами.
Первинне прогресування патологічного процесу в обстежених хворих виникало одразу після дебюту, часто минаючи етап стабілізації, з дуже короткими термінами первинного прогресування та поступово-прогресуючим варіантом перебігу (Р
Подальші наші дослідження ставили за мету прояснити значення механізмів реалізації патологічного впливу зовнішніх факторів ризику при цьому мультифакторному захворюванні. На сучасному етапі дослідження патогенезу РС здійснюється із загальнобіологічних позицій (Вершигора А.Ю. та співавт., 2005; Волошин П.В. и соавт., 2004; Hemmer B. et al., 2002; Latry V.J. et al., 2003). Характерною ознакою автоімунних захворювань є наявність у крові хворих антитіл (АТ) до власних антигенів. Оскільки ДНК-гідролізуючі абзими володіють високою цитотоксичною активністю, їхня присутність у крові хворих на РС може порушувати баланс лімфоїдних клітин в організмі. Визначення рівня абзимів у плазмі крові хворих на РС, є одним із важливих сучасних напрямків дослідження цієї патології (Polosukhina D.I. et al., 2004). Аналіз раніше опублікованих даних (Kozyr A.V. et al., 1988) свідчить про принципову важливість вибору високочутливого методу визначення АТ у хворих на РС та необхідність порівняння рівня цих АТ у хворих із різних популяцій. Тому на ІІ-му етапі власних досліджень визначали вплив фракцій Ig, виділених із плазми крові обстежених на ріст in vitro лейкемічних В- і Т-лімфоцитів людини і миші. Ig окремих хворих на РС було також перевірено на здатність індукувати апоптоз Т-клітин.
Встановили, що препарати Іg, виділених із плазми венозної крові клінічно здорових людей, володіли цитотоксичною активністю щодо Т-лімфоцитів. Препарати Ig плазми крові хворих на РС характеризувалися нижчою цитотоксичною активністю щодо Т-клітин (лінія МТ-4), а деякі з них навіть слабо стимулювали їх ріст у порівнянні з Ig клінічно здорових донорів. Таких відмінностей у дії цих Ig щодо В-клітин нами виявлено не було. Зниження рівня цитотоксичної дії препаратів Ig щодо Т-клітин може сприяти зростанню кількості та стійкості активованих автореактивних Т-клітин при РС і, як наслідок, посиленню процесів автоімунної деструкції, що мають місце при цьому захворюванні.
Цитотоксична активність досліджуваних препаратів Ig щодо Т-клітин (лінія МТ-4) знижувалася у послідовності контроль > легкий ступінь тяжкості РС > тяжкий ступінь РС. Нами було відзначено статистично вірогідну різницю при дії на ці клітини Ig плазми крові хворих із тяжким та легким ступенями вияву цієї хвороби порівняно з контрольною групою (рис. 1).
SHAPE \* MERGEFORMAT
Рис.1. Вплив Ig плазми крові донорів (К) та хворих із легким (Л) і тяжким (Т) проявами РС на ріст і виживання Т-лімфоцитів лінії МТ-4 in vitro
*- статистично вірогідна відмінність Р
** — статистично вірогідна відмінність Р
Виявили кореляцію між низькою цитотоксичною активністю Ig, виділених із плазми крові хворих на РС, на Т-лімфоцити і дуже тяжким прогредієнтним перебігом захворювання у всіх випадках із появою вираженого неврологічного дефіциту. Таким чином, показник цитотоксичної активності Ig плазми крові хворих на РС є однією із важливих складових у патогенезі цього захворювання і може слугувати додатковим діагностичним тестом тяжкості патологічного процесу. Відомо, що цитотоксичний ефект різних речовин може реалізуватися шляхом апоптозу клітин-мішеней, який супроводжується деградацією клітинної ДНК. Для того, щоб виявити, чи відбувається цей процес під час загибелі клітин під дією досліджуваних нами препаратів Ig, було використано електрофорез ядерної ДНК клітин у гелі агарози. Препарати Ig із цитотоксичною активністю викликали руйнування ДНК до низькомолекулярних фрагментів, здатних виходити за межі ядра клітини. Під час електрофорезу таких клітин спостерігалося утворення, так званих, “комет” ДНК, що характерно для апоптичних клітин. Це вказує на достатньо високий рівень апоптичної деградації ДНК Т-клітин лінії МТ-4 у проведеному нами дослідженні.
Нещодавно у плазмі крові хворих на РС були виявлені абзими, здатні гідролізувати ДНК (Барановський А.Г. и соавт., 1998) та ОБМ (Polosukhina D.I. et al., 2005). Оскільки гідроліз ОБМ є причиною демієлінізації аксонів, існують підстави припускати, що у цьому процесі задіяні абзими, які гідролізують ОБМ. Крім того, ми встановили, що абзими, які гідролізують ДНК, також володіють цитотоксичною дією щодо клітин різних типів (Kozyr A.V. et al., 1988). Це дало нам підстави припустити, що абзими, наявні в організмі хворих на РС, здатні руйнувати ДНК і ОБМ і тому можуть діяти як патогенні чинники. У ІІІ-му розділі власних досліджень ми порівняли здатність Ig, виділених із плазми крові хворих на РС, гідролізувати ДНК і ОБМ, а також обговорили потенційну роль цієї активності абзимів, як патогенетичного чинника та діагностичного маркера при РС. Виділені нами препарати IgG були протестовані за допомогою ІФА на наявність у їх складі автоантитіл, здатних взаємодіяти з ОБМ. В усіх отриманих нами препаратах IgG у хворих на РС містилися автоантитіла, які взаємодіяли із ОБМ. Ці результати дають підстави припустити, що саме ці антитіла є абзимами, здатними гідролізувати ОБМ. Дослідження каталітичних властивостей IgG продовжили у наступній серії експериментів. Для цього використали комерційний препарат ОБМ бика, в якому ОБМ є домінуючим за вмістом білком з мол. масою 21 кДА. Протеазну активність препаратів IgG оцінювали за результатами електрофорезу, який дозволив виявити руйнування білка 21 кДа, який є ОБМ, та показав накопичення низькомолекулярних продуктів його гідролізу. Встановили, що два препарати IgG із 9-ти досліджених суттєво знижували вміст білка 21 кДа на електрофореграмі, що передбачає їх властивість гідролізувати цей білок. Причому, виявили клініко-імунобіологічну кореляцію між здатністю Ig плазми крові хворих на РС викликати гідроліз ОБМ та клінічними особливостями перебігу цього захворювання (дебют, пізній початок розвитку хвороби, спінальна клінічна форма та досить тривалий перебіг РС, ПП тип перебігу, тяжкий ступінь прояву неврологічного дефіциту). Це дозволило нам припустити, що дослідження ензиматичної активності Ig щодо ОБМ можна використовувати, як діагностичний та прогностичний маркер при цьому захворюванні. Отже, IgG, очищені із плазми крові хворих на РС, володіють здатністю руйнувати ОБМ. Водночас, препарати IgG хворих на РС суттєво різняться між собою за рівнем їх активності щодо гідролізу ОБМ. Найбільш ймовірно, ензиматичні активності Ig значною мірою залежать від індивідуальних клінічних характеристик РС, зокрема його довготривалості, типу перебігу, ступеня тяжкості та стадії патологічного процесу.
Найчастіше ДНК-азну активність абзимів визначають за їх властивістю гідролізувати ДНК плазміди (Король В.Н. и соавт., 2001; Buneva V.N. et al., 1994). Це пов’язано з тим, що продукти гідролізу невеликої за розміром плазмідної ДНК досить легко детектувати за допомогою електрофорезу в гелі 1% агарози. Виявили, що у плазмі крові окремих хворих на РС одночасно присутні абзими (IgG), які володіють здатністю не лише гідролізувати ОБМ, але й ДНК. У зв’язку з тим, що IgG лише одного із 9-ти обстежених нами хворих на РС мав таку подвійну каталітичну активність, можна було припустити, що індукція таких абзимів при захворюванні на РС не є масовим явищем, проте вона, певним чином, корелює із клінічними проявами цього захворювання.
Метою досліджень, результати яких наведені у останньому розділі роботи, було вивчити вплив лікування Бетафероном на цитотоксичну дію Ig, отриманих із плазми крові хворих на РС, яким вводили Бетаферон впродовж 9 місяців. Для оцінки цитотоксичної дії Ig визначали: 1) кількість живих і мертвих людських лейкемічних Т-лімфоцитів лінії Jurkat за тестом із використанням барвника трипанового синього; 2) апоптичну фрагментацію ДНК цих клітин за умов дії на них препаратів Ig, виділених нами із плазми крові хворих на РС. Аналіз усереднених даних, отриманих нами щодо залежності цитотоксичної проапоптичної активності препаратів Ig із плазми крові хворих на РС від тяжкості цієї патології засвідчив зниження такої активності із зростанням тяжкості захворювання у 3-х із 10-ти обстежених хворих. Водночас, результати дослідження динаміки проапоптичної дії препаратів Ig протягом 3-х і 6-ти та 9-ти місячних курсів лікування хворих свідчать про неоднозначний характер змін проапоптичної активності препаратів Ig плазми крові окремих хворих на РС із різним ступенем прояву захворювання, а також до і після лікування цих хворих Бетафероном. Хворі на РС із відносно високою цитотоксичною активністю Ig плазми крові не реагують подальшим зростанням такої активності у відповідь на лікування Бетафероном. Результати такого спостереження корелюють із клінічними показниками стану цих хворих під час їх лікування Бетафероном. Лікування Бетафероном сприяє посиленню апоптозу активованих автореактивних Т-клітин. Ця дія є найбільше вираженою при РР перебігу РС у хворих із повними ремісіями, незважаючи на тяжкість загострень у цих хворих. Клінічні загострення РС корелюють із процесами апоптозу ДНК автореактивних Т-клітин, які ми опосередковано спостерігали, вивчаючи цитотоксичну активність Ig, плазми крові щодо різних Т- і В-клітинних ліній. Виявили зростання цитотоксичної активності Ig залежно від тривалості лікування хворих. Показали, що зменшення кількості загострень у хворих, повний вихід з них, незважаючи на значну вираженість цих загострень, а також зменшення ступеня тяжкості РС за шкалою рухових розладів EDSS, відповідають зростанню цитотоксичної активності Ig плазми крові хворих, їх здатності індукувати апоптоз автореактивних Т-клітин шляхом фрагментації ДНК останніх. Тому визначення цитотоксичної активності Ig, виділених із плазми крові хворих на РС, можна використовувати, як важливий діагностичний критерій тяжкості і перебігу РС, а також з метою прогностичної оцінки ефективності його лікування.
продолжение
--PAGE_BREAK--