Резюме
Легочныйтуберкулезразвиваетсякак сложнаякомбинациямежду экологическимифакторами игенетическойвосприимчивостью.В данном исследованииассоциациямежду человеческимилейкоцитарнымиантигенами(HLA) и туберкулезомбыла изученав несколькихпопуляциях, но результатыоказалисьпротиворечивыми.
Предполагаемаяоценка II классаHLA проводиласьметодом полимеразнойцепной реакции(ПЦР) с помощьюнабора специфическихпраймеров иолигонуклеотидовв мексиканскойпопуляции.
ИсследованиепроводилосьКлиническойслужбой Туберкулезаи Отделомиммунологии, Национальноминститутереспираторныхболезней, Мексика.
В качествеобследуемыхбыли четырегруппы пациентов:95 здоровых; 50неиммуносупрессированныхпациентов стуберкулезомлегких; 15 ВИЧ-инфицированныхпациентов стуберкулезом;37 ВИЧ-инфицированныхпациентов васимптотическойстадии.
В результатеисследованиябыли полученыданные: частотыаллелей DQA1*101, DQB1*501,DRB1*1501 были значительноувеличены унеиммунодепрессированныхпациентов стуберкулезомлегких по сравнениюсо здоровымипациентами.В отличие отэтого, частотыаллелей DQB1*402, DRB1*4 иDRB1*8 были значительноуменьшены упациентов стуберкулезом.Также, значительноеувеличениечастоты аллеляDRB1*1101 было обнаруженоу ВИЧ-положительныхпациентов.
Генетическоевлияние, связанноес системой HLAиграет важнуюроль в развитиитуберкулезалегких. Хотяэта восприимчивость, возможно, неиграет у ролиу пациентов, с серьезныминарушениямииммунной системы(такими, какВИЧ-инфекция).
Введение
Туберкулезостается однойиз важнейшихмировых проблем.По приблизительнымоценкам примернотреть населениязараженаMycobacterium tuberculosis. Около 8миллионовслучаев активноготуберкулезаи 2,9 миллионовсмертей регистрируетсякаждый год.
Болезньприблизиласьк эпидемическимпропорциямс ухудшениемокружающейсреды, социоэкономическихусловий, такихкак перенаселение, неправильноепитание ирасположениесточных вод.Также, в последнеевремя эпидемическаякартина ассоциированас ВИЧ.
Однако, исследования, выполненныена людях илабораторныхживотных, доказывают, что в дополнениек окружающейсреде генетическаяпредрасположенностьможет игратьроль в прогрессированиизаболевания.Недавно открыто, что изменениягенетическойинформациидля ассоциированногос врожденнымиммунитетомпротеина I макрофагасвязаны свосприимчивостьюк туберкулезуу жителей ЗападнойАфрики.
Главныйкомплексгистосовместимостичеловека играетважную рольв формированиииммунногоответа. Возможнаяассоциациямежду антигенамиHLA и туберкулезомисследованана многих популяциях, но результатыоказалисьпротиворечивыми.Несоответствиямогут бытьсвязаны сметодологическимипроблемами, потому чтоисследованиябыли сделаныглавным образомсерологическимиметодами, которыемогут даватьперекрестныереакции и иметьнизкую специфичность.Кроме того, серологическиеметоды даютошибочныезначения HLA классаII более чем в25% случаев посравнению сболее точнымметодом ДНК-типирования.Также восприимчивостьк туберкулезунаходится подмногофакторнымгенетическимконтролем, включающими контроль засистемой HLA.
HLA регион находитсяна короткомплече шестойхромосомы иделится на трирегиона: HLA классаI, кодирующийHLA-A, -B, -C антигены;HLA класса II, кодирующийHLA-DR, DQ и DP антигены;HLA класса III, кодирующийвторой и четвертыйкомпонентыкомплементаС2 и С4, факторB, туморонекротическийфактор αи β, белок тепловогошока 70 и 21-гидроксилазу.Гены классовI и II кодируютповерхностныеклеточныегликопротеины, функция которыхпрезентоватьантигенныепептиды дляCD8+ CD4+ клеток, играющихфундаментальнуюроль в гомеостазе.
Система HLA –самая полиморфнаябиологическаясистема, ипопуляционныеразличия представленычастотамиспецифическихаллелей и подтипов, а также ихкомбинацией.HLA-система рестриктируетТ-клетки и тесносвязана с генамииммунногоответа и супрессии.Ответ антиген-специфическихТ-клеток связанс презентациейпроцессированногопептида в ассоциациис поверхностнымигликопротеинамиМНС класса I иII. В частности, белки, кодированныегенами МНСкласса II, функционируюткак рестриктирующийэлемент, которыйопосредуетузнаваниеантигенарегуляторнымиТ-клетками, итесно связаныс иммуннымраспознаваниеми ответом.
Цель данногоисследования– сравнитьчастоту геновHLA класса II у взрослыхс туберкулезомлегких и здоровыхлюдей метомполимеразнойцепной реакции.Также былиисследованыВИЧ-положительныепациенты стуберкулезомили без него.
Материалыи методы. Исследованиепопуляции
В исследованиебыли включеныпятьдесятслучайно отобранныхнеиммунодепрессированныхпациентов стуберкулезомлегких. Пациенты, не связанныеродственнымисвязями, являлиськореннымижителями Мехико, были госпитализированыв Национальныйинститутреспираторныхболезней вовремя исследования.Во всех случаяхдиагноз туберкулезабыл поставленна основе световоймикроскопии, с помощью которойобнаруживалосьприсутствиекислотоустойчивыхбацилл в мокроте, а также культуральнымвысевом M. tuberculosis.
Чтобы признатьпациентовнеиммунодепрессированными, они были оцененыпо следующимкритериям: отсутствиеВИЧ-инфекции; нормальноеколичестволимфоцитови Т-клеток впериферическойкрови; подтвержденныйлегочной туберкулез.Пациенты сдиабетом, силикозом, циррозом печениили другимисистемнымизаболеваниями, а также пациенты, злоупотребляющиеалкоголем, небыли включеныв исследование.Пациенты соСПИДом исследовалисьнезависимо.
В качествеконтроляисследовались95 не связанныхродством здоровыхпациентов, отобранныепо этническими социоэкономическимособенностям;37 ВИЧ-инфицированныхпациентов безтуберкулезаи других инфекций(2-я стадия ВИЧ-инфекциипо классификацииЦентра по контролюи предотвращениюинфекций CDC).Дополнительноисследовались15 ВИЧ-инфицированныхпациентов стуберкулезом(4-я стадия ВИЧ-инфекциипо CDC) и 20 здоровыхне ВИЧ-инфицированныхгомосексуальныхпациентов.Диагноз ВИЧставился пометоду ИФА иподтверждалсяс помощью методаиммуноблотинга.Пациенты иконтроль родилисьв Мексике иимеют три поколенияпредков, коренныхжителей Мексики.Исследованиебыло одобреноНаучным и Этическимкомитетом, былополучено согласиевсех обследуемых.
Проект исследования
ГеномнаяДНК из цельнойкрови, содержащейэтилендиаминтетраацетатбыла извлеченас помощью стандартныхметодик. ДНКамплификацияи специфическаяидентификацияаллелей HLA-DQосуществлялисьс помощью методаПЦР с наборомспецифическихпраймеров(Bio-Sinthesis; Dallas, TX). ИдентификацияHLA-DRB1 проводиласьс помощьюспецифическихпоследовательностейолигонуклеотидовметодом обратнойгибридизацииdot blot (Amplicor kit; Hoffman La Roche; Базель, Швейцария).DR1, DR2, DR4, DRB1-DR52, DRB3 и DRB5 амплификацияпроводиласьметодом ПЦРс использованиемTaq-полимеразы(Promega; Madison, WI). Праймеры, используемыедля амплификации:DRBAMP-B для региона3’ из экзона 2, и DRBAMP-1, DRBAMP-2, DRBAMP-3 DRBAMP-4, DRBAMP-5 иDRBAMP-52 для региона5’ из экзона 2.Они были синтезированына автоматическомсинтезаторе(DNA-SM; Beckman; Пало-Альто, Калифорния).
Статистическийанализ
После того, как были определенычастоты фенотиповдля каждыхаллелей в исследуемойи контрольнойпопуляциях, различия былиустановленыи подтвержденыс помощью критерияχ2. Рискразвития туберкулезабыл проверенс помощьюкомпьютернойпрограммы(STATA и Windows 95; Microsoft; Редмонд,WA).
Результаты
Исследованиевключало 50неиммунодепрессированныхпациентов(средний возраст39,1±13,0 лет). В контрольбыли включены95 здоровых человек(35,4±10,1 лет); 37 ВИЧ-инфицированныхпациентов, незараженныхтуберкулезоми не имеющихновообразований;15 иммунодепрессированныхпациентов(ВИЧ-инфицированных)с туберкулезом(31,1±5,7 лет); 20 здоровыхне ВИЧ-инфицированныхгомосексуалистов(26,3±8,5 лет). Поздняягруппа контроляне имела существенныхотличий в фенотипеHLA с группойнесвязанныхздоровых людей.
С помощьюметода ПЦР игибридизациибыли показаныразличия междучастотамиаллелейнеиммунодепрессированныхпациентов сактивным туберкулезоми пациентамииз других групп.Различия частотв каждой группепоказаны втаблице 1. Среди50 неиммунодепрессированныхпациентов стуберкулезомбыло 30 пациентовс аллелем DQA1*0101,22 с аллелемDQB1*0501 и 24 с аллелемDRB1*1501 (по сравнениюс контрольнойгруппой из 95человек: 20, 12 и 9человек соответственно).
ВИЧ-инфицированныепациенты показаливысокие частотыаллеля DRB1*1101.
С другойстороны триаллеля ассоциированыс протекциейпротив туберкулеза:DQB1*0402, DRB1*4 и DRB1*8 (таблица1).
Обсуждениерезультатов
Молекулярноетипированиеоказалосьполезным дляопределенияассоциациимежду системойHLA и туберкулезом.Этот методоказался болееудобным, чемсерологический.В данном исследованииметод ПЦР всочетании соспецифическимиолигонуклеотиднымипробами показалиассоциациюмежду генамиDQA1*0101, DQB1*0501, DRB1*1501 и восприимчивостьюк туберкулезу.Эти маркерывосприимчивостиопределялисьнезависимодруг от друга, поэтому речьне идет о гаплотипе.Интересно, чтоВИЧ-инфицированныепациенты стуберкулезомне имели данныхгенов. Предполагается, что приобретениесерьезногоиммунодепрессивногостатуса предрасполагаетк развитиютуберкулеза, независимоот генетическойсоставляющей.Однако размерэтой группыбыл слишкоммал, чтобы делатькакие-либозаключения, и необходимыдальнейшиеисследованиябольших группВИЧ-инфицированныхпациентов стуберкулезом.Вдобавок частотынекоторыхаллелей HLA DR и DQлокусов у здоровогоконтроля былизначительноувеличены посравнению счастотами HLA упациентов стуберкулезом, что можно связатьс тем, что этиаллели могутвносить вкладв устойчивостьк данномуинфекционномузаболеванию.
Недавниеисследованияпациентов стуберкулезомиз Индии показалиассоциациюс геном HLA DRB1*2, нобольшая частьданных аллелейDRB1*1501 и DRB1*1502 была одновременнои у пациентови у контроля.Распределениегенов HLA DQ в данномисследованииизучено небыло. Позднеебыла найденаассоциациямежду HLA DQB1*503 и клиническимтуберкулезому пациентовиз Камбоджи.В этом исследованиибыло такжеотмечено небольшоеувеличениечастоты встречаемостиаллеля HLA-DRB1*2.
HLA-DQ молекулыуникальны средиII класса молекулМНС, потому чтообе α-и β-цепочкиочень полиморфны; более того, многие вариабельныеаминокислотныеостатки расположеныв α-спиральнойчасти антиген-связывающегокармана. С помощьюПЦР анализабыло выявленодва гена DQ аллеля, связанных стуберкулезом.
Также рискомк развитиюлегочных иэкстрапульмонарныхзаболеванийявляются воздействияокружающейсреды и первоначальныйрезультатвоздействиямикобактерийна организм.Хотя факторы, которые влияютна развитиеболезни и ееклиническоепроявление, еще недостаточноизучены. В частности, при воздействиимикобактерийна организмне всегда происходитзаражение; асреди зараженныхпрогрессированиев активноезаболевание, причины болезнии ее длительностьсильно варьируют.Наиболее вероятно, действуетсложный комплексгенетическихи экологическихфакторов. Хорошоизвестно, чтоплохие окружающиеусловия и некоторыеидентифицированныефакторы риска: диабет, силикоз, ВИЧ, злоупотреблениеалкоголем идругие, — всеони играют рольв предрасположенностик туберкулезу.В данном исследованиисемейный статуси правильноепитание, известныекофакторы вразвитии туберкулеза, были одинаковымив контрольнойгруппе и группепациентов стуберкулезом; пациенты снекоторымииз вышеупомянутыхнарушений былиисключены изгруппы больныхс туберкулезом, а ВИЧ-инфицированныепациенты стуберкулезоманализировалисьотдельно.
Генетическиефакторы хозяинамогут оказыватьвлияние и навосприимчивостьк инфекционномуагенту, и напатогенеззаболевания, хотя получитьсвидетельствогенетическойпредрасположенностик туберкулезудовольно сложно.Недавно былиполучены данные, что вариациив протеине Iчеловеческихмакрофагов, который ассоциированс врожденнымиммунитетом, связаны с измененнойчувствительностьюк мокрото-положительнымтуберкулезому населенияЗападной Африки.
Результатыисследований, как и данныеGoldfeld и др., показывают, что некоторыеаллели системыHLA II класса, особеннолокуса DQ1, могутприниматьучастие в возрастаниичувствительностии в восприимчивостик туберкулезу.HLA-рестриктированнаяпрезентацияпроцессированныхантигеновальвеолярнымимакрофагамиможет бытьизменена упациентов, экспрессирующихданные специфическиеаллели HLA.
Также былообнаруженовозрастаниечастоты DRB1*1101 аллеляу ВИЧ-инфицированныхпациентов. Прииспользованиистандартногометода микроцитотоксичностина мононуклеарныхклетках нескольколет назад былаполучена высокаячастота встречаемостигена HLA-DR5 у ВИЧ-инфицированныхпациентов.Однако неясно, предрасполагалли ген HLA-DR5 к развитиюВИЧ-инфекцииили к некоторымпоследующимосложнениям, таким как постояннаягенерализованнаялимфоаденопатияили саркомаКапоши. Послетого, как былодоказано, чточастота DRB1*1101 былазначительноувеличена наII стадии ВИЧ-инфекциипо CDC, результатыисследованиядоказывали: генетическаявосприимчивость, связанная сэтим маркером, предрасполагаетпациентов кВИЧ-инфекции, а не к вышеописаннымосложнениям.В доказательстводанной точкизрения былоисследовано20 мужчин-гомосексуалистовбез ВИЧ-инфекциипо HLA II класса.Частота аллеляHLA DRB1*1101 в этой группене отличаетсяот контрольнойгруппы. Однакоэти данныенужно использоватьосторожно, таккак несмотряна многиеисследованияотносительнотипа HLA и иммунногоответа на ВИЧ-I, вопрос о том, влияет ли HLA навосприимчивостьк данной вируснойинфекции остаетсянерешенным.
Проведенныеисследованиядоказывают, что три аллеляHLA вовлечены ввосприимчивостьк туберкулезув мексиканскойпопуляции.
Механизмы, лежащие в основенеустойчивостиили восприимчивостик инфекционнымзаболеваниям, связанные сHLA II класса, а такжеразличия междуDR и DQ локусамидо сих пор доконца не изучены.Хотя результатыисследованияподтверждают, что генетическоевлияние системыHLA может игратьроль в развитиитуберкулеза, но эта предполагаемаячувствительностьне играет ролиу пациентовс серьезныминарушениямииммунитета, как во времяВИЧ-инфекции.Также былопредположено, что ген DR5 можетбыть ассоциированс развитиемВИЧ-инфекции.
Таблица 1.Частоты геновHLA в четырех группахпациентовAllele Specificity Healthy Subject PTB Patients, % HIV-Positive Patients, % AIDS Patients with PTB, % DR1 10.52 20.00 5.40 6.66 DR3 12.63 20.00 16.21 13.33 DR4 46.31 12.00 13.51 33.33 DR7 22.10 18.00 16.21 33.33 DR8 33.68 4.00 18.91 6.66 DR9 1.05 8.00 5.40 6.66 DR10 1.05 4.00 0.00 6.66 DR11 (DRB1*1101) 11.57 24.00 45.94! 33.33 (DRB1*1102) 3.15 4.00 2.70 6.66 (DRB1*1103) 1.05 2.00 0.00 0.00 (DRB1*1104) 3.15 0.00 2.70 0.00 DR12 (DRB1*1201) 2.10 16.00 8.10 0.00 (DRB1*1202) 0.00 2.00 5.40 0.00 (DRB1*1203) 0.00 0.00 2.70 0.00 DR13 {DRB1*1301) 4.21 2.00 2.70 0.00 (DRB1*1302) 4.21 4.00 0.00 0.00 (DRB1*1305) 2.10 0.00 0.00 0.00 DR14 22.10 2.00 0.00 0.00 DR15 (DRB1*1501) 9.47 48.00! 24.32 33.33 (DRB 1*1502) 3.15 0.00 0.00 6.66 (DRB1*1503) 1.05 0.00 2.70 0.00 DR16 (DRB1*1601) 2.10 6.00 27.02 6.66 (DRB1*1602) 3.15 4.00 0.00 6.66 DQA (DQA1*0101) 22.10 62.00! 40.54 35.71 (DQA1*0102) 17.89 10.00 13.51 28.71 (DQAl*020l) 22.10 12.00 18.91 14.28 (DQA1*0301) 48.42 30.00 13.51 35.71 (DQA1*0401) 32.63 12.00 18.91 7.14 (DQA1*0501) 46.31 34.00 35.13 28.57 (DQA1*0502) 4,21 0.00 0.00 0.00 DQB (DQBl*0201) 33.68 26.00 16.21 35.71 (DQB1*0301) 35.78 24.00 13.51 28.57 (DQB1*0302) 43.15 32.00 32.48 35.71 (DQB1*0304) 1.05 0.00 0.00 0.00 (DQB1*0402) 33.68 6.00 8.10 0.00 (DQB1*0501) 12.68 44.00! 21.62 31.71 (DQB1*0502) 5.26 6.00 5.40 7.14 (DQB1*0503) 9.47 4.00 5.40 14.28 (DQB1*0504) 1.05 0.00 0.00 0.00 (DQB1*0602) 15.78 14.00 8.10 0.00 (DQB1*0603) 5.26 0.00 10.21 7.14 (DQB1*0604) 2.10 8.00 8.10 7.14 (DQB1*0609) 1.05 0.00 0.00 0.00