Извлечение и подготовка эмбрионов к пересадке. Извлечение эмбрионов проводили на 7-8 день полового цикла нехирургическим методом. Перед операцией донора готовили по методике, описанной в разделе 1.2, затем эпидурально вводили 5-7 мл 2 -го новокаина в зависимости от веса животного.
Беспокойным добавочно вводили 0,3-0,5 мл ромпуна. Ректально методом пальпации оценивали состояние полового аппарата, проводили подсчеты желтых тел и фолликулов. Для вымывания эмбрионов использовали катетеры различных конструкций. Промывная жидкость подавалась через закрытую систему самотеком из емкости, расположенной в верхнем гнезде штатива над донором. Промывание маточного рога проводили 8-10 раз, вводя по 60-50 мл промывной среды. На вымывание одного рога расходовали 450-500 мл модифицированной среды Дюльбекко с добавлением 1 инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота.
В научно-производственных опытах по санации промывных буферных сред добавляли комплекс антибиотиков гентамицин-ампициллин в концентрациях 12 мкг мл и 100 Ед мл, соответственно. Бактерицидную дозу санирующих препаратов испытывали на штаммах микроорганизмов, как монокультуре, так и в ассоциации, методом серийных разведении. Безвредность санирующих препаратов для эмбрионов определяли методом культивирования эмбрионов крупного рогатого скота в средах содержащих различные дозы испытуемых препаратов.
Эффективность применения санирующих препаратов учитывали по результатам приживляемости эмбрионов. Смыв отстаивали 15-20мин. при температуре 37 С в термостате. Надосадочную жидкость аспирировали с помощью сифона. Осадочную среду разливали в стерильные чашки Петри с расчерченным на полоски дном. Поиск зародышей производили под стереоскопическим микроскопом МБС-9. Обнаруженные эмбрионы переносили стерильным микрошприцем на малую чашку Петри диаметром 40мм. Жизнеспособность эмбрионов определяли по общепринятой методике оценки морфологического состояния эмбриона В. Shea et al 1976 , учитывая их компактность, симметричность, плотность.
Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, 1987 . В сравнительных опытах по многократному отмыванию эмбрионов использовали буферные среды, приготовленные за 10-15мин. до начала поиска эмбрионов.
Отмывная среда для эмбрионов состояла из стерильного буфера Дюльбекко с добавлением 15-20 инактивированной фетальной сыворотки, которую в стерильных условиях расфасовывали в полиэтиленовые ампулы по 2 мл. В другой емкости готовили такую же среду с добавлением комплекса антибиотиков гентамицин-ампициллин 12 мкг мл и 100 Ед мл. При отмывании использовали микрошприц и микропипетку для захвата эмбрионов с минимальным объемом среды. Устройство применяли с целью захвата, переноса и микробной деконтаминации эмбрионов.
Культивирование эмбрионов проводили при температуре 37,5 С без доступа кислорода в модифицированной среде Дюльбекко, содержащей 20 фетальной сыворотки крупного рогатого скота. В среду для культивирования подопытных эмбрионов вносили комплекс антибиотиков гентамицин-ампициллин 12 мкг мл и 100 Ед мл, в первом контроле использовали пенициллин 100 Ед мл и стрептомицин 50 Ед мл, во втором контроле для культивирования эмбрионов использовали среду без антибиотиков.
Эмбрионы в средах с антибиотиками выдерживали 2 часа. Затем меняли среду и культивировали 72 часа. Морфологическое состояние эмбрионов оценивали через 2, 24, 48 и 72 часа. 4.2.4 Влияние микробного фактора на приживляемость эмбрионовПри проведении опытов по определению влияния микробного фактора на приживляемость эмбрионов использовали чистые культуры микроорганизмов, ранее выделенные из половых путей коров-доноров и телок-реципиентов. Инокуляцию отмытых и подготовленных к пересадке эмбрионов проводили чистыми суточными культурами. Чистые культуры Stapha и Ecoli выделяли методом Коха. Принцип метода заключается в получении чистой культуры из колонии, рост которой считали результатом развития одной клетки.
Для выделения чистой культуры производили высев на поверхность агаровой среды из накопительной культуры с ее разведения. Разведение делали с таким расчетом, чтобы получить на поверхности агаровой среды изолированные колонии. Для посева на поверхность плотной агаровой среды наносили каплю этой культуры, которую осторожно распределяли по всей поверхности стерильным шпателем с последующим переносом ее на поверхность агара последовательно во вторую, третью и четвертую чашки.
В первых двух чашках после инкубации при температуре 37 С для Staph. aureus и 43 С для E.coli наблюдали сплошной рост микроорганизмов, тогда как в последующих чашках отмечали рост изолированных колоний. Одну из колоний отбирали стерильной петлей и производили высевы в пробирки с МПБ и на поверхность скошенного агара.
Идентификацию E.coli проводили путем высева на среду Булира и Эндо, a Staph. aureus на МПБ и МПА с добавлением 1 глюкозы. Чистые культуры Staphaureus и Е. coli в разведении 1 10 контаминировали в среды с эмбрионами. Для получения определенного количества микроорганизмов в 1 мл среды необходимо было получить суспензию этих культур и приготовить их разведение. Чаще всего для инокуляции используют чистые суточные культуры микроорганизмов в разведении 1 10 - 1 10. Для приготовления таких разведении, стерильный физиологический раствор разливали по 9 мл в стерильные сухие пробирки.
Затем 1 мл исходной суспензии, взятой стерильной пипеткой, переносили в первую пробирку с 9 мл стерильного физиологического раствора - получали первое разведение 1 10. Затем этой же пипеткой брали 1 мл полученного разведения и переносили его во вторую пробирку. Получали второе разведение Таким же образом готовили и последующие разведения. В эксперименте по определению влияния микробного факторана приживляемость эмбрионов было взято две группы животных-аналогов по 20 голов в каждой.
Телкам-реципиентам опытных групп пересаживали эмбрионы, инокулированные чистыми культурами микроорганизмов в вышеуказанных разведениях. 10 животным трансплантировали эмбрионы, инфицированные Staph. aureus, другим 10 - эмбрионы с внесенной культурой E.coli, 20 контрольным телкам пересаживали эмбрионы, отмытые в пяти чашках стерильными буферными средами, без добавления микроорганизмов.
В природе отмечено, что микроорганизмы в ассоциациях могут быть синергистами либо антагонистами. Поэтому нами проведены исследования по определению антагонизма микроорганизмов, выделенных из половых путей самок. В этих опытах применяли метод посева испытуемых микробов на чашках Петри с МПА радиальными штрихами к предварительно выращенным колониям предполагаемого антагониста по методике В.В.Аврех и А.Ф.Зак, описанной в справочнике И.О.Биргера 1973 . В экспериментах по определению бактериальной загрязненности половых путей доноров и реципиентов нами выделено в основном 4 вида бактерий Bac.subtilis, E.coli, Staph.aureus и Ps.aeruginosa.
Перечисленные виды микроорганизмов относятся к группе возбудителей специфических половых инфекций. Известно, что в определенных условиях резистентность организма значительно ослабевает и нормальный количественный и качественный состав микрофлоры изменяется или активизируется деятельность имеющихся микроорганизмов.
Попадание микробов в глубокие отделы полового аппарата самки в природных условиях при естественном спаривании явление не столь уж редкое. Именно вследствие этого возникла у самок активная защитная реакция в эстральном периоде. И у самих зародышей в процессе эволюции выработался защитный механизм, особенно необходимый на ранних стадиях развития, когда еще не существует плацента с ее барьерной функцией. Это подтверждено опытами Б.П.Токина 1956 . 4.3