Предупреждение заноса инфекции в матку при извлечении и пересадке эмбрионов. В настоящее время во многих странах ведутся интенсивные работы по разработке оптимальных способов получения и пересадке эмбрионов крупного рогатого скота.
Основной задачей этих исследований является повышение приживляемости эмбрионов, которая зависит от многих факторов. Одним из главных условий успешного применения метода трансплантации в животноводстве является асептичность всех проводимых операций.
Необходимо точно соблюдать санитарные правила при манипулировании с эмбрионами вне организма, чтобы не допустить их инфицирования и переноса инфекции реципиентам при эмбриотрансплантации H. Kupferschmid, 1984 E. Singh et al 1985 А.Овчинников, 1985 Ф.Осташко, 1986 М.Тибье, 1986 .Известно, что матка коровы легко инфицируется в лютеальной фазе полового цикла и устойчива к заражению в эстральный период Л.Роусон, 1953 А.В.Квасницкий, 1988 Л.К.Эрнст, Н.И. Сергеев, 1989 . Поскольку нехирургическая пересадка эмбрионов у крупного рогатого скота осуществляется в период диэструса, когда резистентность матки резко понижена к микробному фактору, то даже при отрицательной бактериологической оценке инструментов вирусный контакт не исключается.
Субклиническая инфекция у реципиентов после нехирургической пересадки приводит к частым абортам А.В.Овчинников, 1985 . Манипуляция вымывания эмбрионов и подготовка их к пересадке, как было сказано выше, требует тщательных асептических условий.
Но даже. при соблюдении их, возможность попадания различной микрофлоры в матку не исключена Ф.И.Осташко и соавт 1986 А.Гордон, 1988 А.И.Сергиенко и соавт 1988 . Одной из причин низкой результативности нехирургических пересадок, очевидно, является чувствительность матки к инфекции в лютеальную фазу Н.И.Сергеев, В.И.Горбунов, 1979 . Для предотвращения возможного заноса микрофлоры в полость матки применялись различные устройства.
И.Перрин и соавт. использовали приспособление, позволяющее в условиях ферм производить цервикальную трансплантацию не соприкасаясь со средой слизистой влагалища. При этом приживляемость эмбрионов повысилась на 21 I. Perrin et al 1982 . А.Овчинников 1985 для зачехления инструмента при пересадке эмбрионов использовал специальную защитную оболочку из парафинированной стерильной бумаги. В качестве дополнительной предосторожности от возможной влагалищной инфекции у реципиента сотрудники Кембриджского института покрывали наконечник пистолета Кассу пластиковым чехлом A. Brand et al 1978 .Большинство практиков в странах СНГ катетер для пересадки эмбрионов покрывают защитной полиэтиленовой оболочкой, которая предназначена для предупреждения контаминации прибора микрофлорой при введении его во влагалище до наружного отверстия шейки матки В.С.Шипилов и соавт 1988 . Ф.И.Осташко и соавт. 1986 для асептического получения эмбрионов сельскохозяйственных животных, их поиска, оценки и хранения создали специальное устройство.
Сыворотка и другие компоненты среды, используемые для сбора, отмывания и культивирования эмбрионов могут быть специальными источниками инфекции, поэтому качество их приготовления должно систематически контролироваться.
Кроме того, после извлечения эмбрионов из матки инфицированных и неинфицированных коров-доноров в промывных средах многие исследователи обнаружили бактерии и вирусы L. Archbald et al 1981 A. Bouillant et al 1981 F. Thovas et al 1975 E. Singh et al 1983 А.Д.Бугров, И.М.Величко, 1986 А.И.Сергиенко, 1987 , что послужило основанием для санирования промывных буферных сред антимикробными препаратами А.Д.Бугров и И.М.Величко, 1986 . В.И.Завирюха, С.П.Хомин, А.А.Гамота, С.Г.Шаловило 1987 отметили, что после проведения нескольких вымываний у коров-доноров развивается гнойный эндометрит.
Другим важным моментом при трансплантации является подготовка эмбрионов к пересадке. Ряд зарубежных авторов считают, что уязвимость эмбриона патогенами маловероятна из-за основной резистентности, которая обеспечивается зоной пеллюцида, и факторов вторичной резистентности таких, как ранний возраст, малые размеры и ограниченная подвижность, что уменьшает потенциальную возможность воздействия патогенов на эмбрион.
То, что многие бактериальные и вирусные патогены, как было доказано, слишком велики, чтобы проникнуть сквозь прозрачную оболочку и что некоторые не выживают в питательной среде эмбриона, объясняет дальнейшее уменьшение возможности передачи инфицирующего агента во время пересадки эмбриона.
Зона пеллюцида толщина 5-15 мкм является эффективным барьером для микроорганизмов. Исследования показали, что это касается большинства микробов, вызывающих заболевания у крупного рогатого скота. При тщательном промывании эмбриона, с интактной прозрачной оболочкой, исчезали все признаки патогенных агентов E. Singh et al 1982 R.A.Bowen et al 1983 D. Stringfellow et al 1984 Z. Mallek et al 1984 W. Hare et al 1985 . Микробиологические исследования in vitro показали, что отмывка эмбрионов в нескольких стерильных средах снижает концентрацию вирусов и бактерий в среде до неопасного субинфекционного уровня уже после третьего разбавления.
Технически отмывка эмбрионов выполняется путем последовательного переноса микропипеткой эмбриона с минимальным количеством жидкости около 0.01 мл из одной стерильной чашки с 1 мл среды в другую. Разбавление концентрации исходного раствора среды при этом таково, что уже в третьей чашке она превышает в 1000 раз, а в девятой чашке даже тонкий анализ не выявляет следов инфекции.
Дополнительную гарантию полного блокирования случайной инфекции дает добавление антибиотика в стерильную среду. Эффективность такого способа подтверждена в опытах с использованием вирусов блутанга, акабаны, инфекционной диареи E. Singh et al 1982 , бруцеллы абортус D. String fellow et al 1984 . В настоящее время известно, что только вирусы инфекционного ринотрахеита E. Singh et al 1982 и везикулярного стоматита L. Laurman et al 1985 взаимодействуют с оболочкой эмбриона и остаются на ней даже после многократных отмываний. Результаты исследований А.И.Сергиенко и соавт. 1988 показывают, что даже десятикратная промывка не обеспечивает освобождение эмбрионов от вируса ИРТ. Только обработка эмбрионов ферментами трипсином или антисывороткой эффективно удаляет вирусы с оболочки E. Singh et al 1983 . В результате обработки эмбрионов ферментом растворяется верхний слой оболочки и полностью удаляются инактивируются налипшие на ней вирусные частицы. С другой стороны, культивирование зародышей in vitro осуществляли при высокой концентрации микроорганизмов и вирусов в среде, которая в естественных условиях in vivo менее вероятна.
После использования трипсина вирусы ринотрахеита и везикулярного стоматита на оболочке не обнаруживали.
Повреждение оболочки или ее отсутствие приводило к инфицированию зародыша и его гибели при блутанге, ящуре, ринотрахеите.
Освободившаяся от прозрачной оболочки бластоциста представляет собой полый внутри шар, наружная стенка которого состоит из одного слоя питающих клеток трофобласт, а внутри на одном из полюсов бластоцисты, располагается скопление собственно зародышевых клеток эмбриобласт. В просвете матки бластоциста остается свободной и перемещается до 13-14 дня K.M.Shelesnyak, 1960 C. Lutwak - Mann, 1959 . В конце этого периода бластоциста прикрепляется трофобластом. к слизистой оболочки стенки матки имплантируется. В этот период отмечена высокая повреждаемость и смертность зародышей.
Разного рода неблагоприятные факторы извне могут, не повреждая самого зародыша, нарушить ход становления его связи с материнским организмом. К числу таких факторов относится патогенная и условно патогенная микрофлора. А.И.Сергиенко и соавт. 1988 обнаружили в среде Дюльбекко после вымывания эмбрионов 6 видов бактерий St.albus, St.citreus, B.subtilis, E.coli, Pr.vulgaris, грибы. Анализируя литературные данные Н.А.Мартыненко 1971 пишет, что обычно эмбриональная смертность на почве инфекции завершается изгнанием плода.
В абортированном материале чаще всего обнаруживаются стрептококки и стафилококки. Проникнув в матку, они находят там подходящую для себя среду и быстро размножаются, вызывая некроз котиледонов и нарушая таким образом связь плода с маткой, кроме того они проникают в ткани плода и отравляют его своими токсинами или вызывают внутриутробную инфекцию Д.Д.Логвинов, В.П.Плугатырев, Г.Г.Хатура, А.Г.Миллер, 1988 . Установлено, что матка коровы наиболее чувствительна к инфекциям в лютеальную фазу полового цикла, вначале которой трансплантируются эмбрионы.
Большинство авторов отмечают, что при нехирургической трансплантации катетер проходя через влагалище в шейку матки, неизбежно захватывает огромное количество микробов. Проблема микробной деконтаминации решается за счет антибиотиков или же надежной асептики. Последнее обеспечивается помещением трансплантационного инструмента в защитный чехол для проведения его через влагалище.
В литературе имеется достаточное количество сведений о наличии микрофлоры в матке коровы в разные периоды полового цикла и влияние ее в период беременности на материнский организм и зародыш. Однако, остается неясным вопрос о микробной контаминации отдельных участков половых путей на 7-8 день полового цикла, т.е. оптимального времени трансплантации эмбрионов. А также не разработаны методы профилактики и санитарного контроля на всех этапах извлечения и пересадки эмбрионов. 3.4 Влияние микроорганизмов на спермии, яйцеклетки и эмбрионы Многочисленные исследования были проведены учеными по определению влияния микроорганизмов на различные биологические объекты такие, как спермии, яйцеклетки и эмбрионы.
Несмотря на противоречивость данных о влиянии микроорганизмов на переживаемость спермиев БеликовА.А большинство исследователей придерживаются мнения, что микрофлора губительно действует на них, снижая переживаемость спермиев, их оплодотворяющую способность и даже на развитие плода С.Л.Семенов, 1955 И.Пантюхова, 1962, В.А.Яблонский, 1963 Г.В.Зверева, 1963, 1968, 1974 Н.Г.Балашов, 1965 J. Krolinski, 1977 . Часто из спермы быков выделяли большое количество микробов.
Д.Голубева 1965 выделила 16 видов микроорганизмов, М.Касумов 1963 - 16 видов, Е.П.Кремнев, А.Банакова 1974 - 23 вида, Т.Е.Яковлев 1968 -27 видов, Д.Е.Дорожилов и соавт. 1974 - 32 вида микробов и 13 видов плесени. При идентификации микроорганизмов, выделенных из спермы быков, установили их видовую принадлежность.
Это были чаще всего E.coli, Ps. aeruginosa, Bac. subtilis, Proteus vulgaris и различные кокковые формы А.Железнов, 1966 Н.Г.Балашов, 1989 . Об отсутствии отрицательных действий бактерий, в том числе и синегнойной палочки, на жизнеспособность спермиев сообщено в публикациях авторов Edmonson et al 1949 E. Hakkesteedt, 1949 W.P.Scheser, 1951 Baier et al 1971 . Одни исследователи утверждают, что микробы, находящиеся в сперме, располагаются около спермиев или оседают на них в один или 2-3 ряда. В местах оседания микробов оболочка спермиев как бы вдавливается, прогибается, а при длительном контакте ферменты бактерий вызывают распад спермия, а затем его гибель Г.В.Зверева, 1963 . В литературе есть данные по отрицательному влиянию микробов на яйцеклетки.
П.А.Волосков и соавт. 1971 сообщили, что микробы, абсорбированные спермиями, могут проникнуть и в яйцеклетку. Дальнейшая судьба инфицированного эмбриона зависит от вида и количества микробов и бактерицидных свойств жидкости бластоцисты.
Другие исследователи отрицают негативное влияние микробов на яйцеклетки. В 184 опытах Б.П.Токина, А.Г.Филатова 1953 , в которых яйцеклетки кролика помещались в зараженную среду, показали высокую бактерицидность. Они утверждают, что бактерицидные свойства яйцеклетки сохраняются ею и после оплодотворения Б.П.Токин и соавт 1956 . Однако, следует отметить, что в вышеописанных опытах Б.П.Токина и А.Г.Филатова в качестве среды служила капля физиологического раствора, зараженного одним из следующих видов микробов Microkoccus lysodeicticus, Bact. megatherium, Bact. speciens и соавт.
Во всех случаях вокруг яйцеклетки наблюдалось значительное угнетение роста и размножения бактерий Цитата по книге Н.А.Мартыненко, 1971 . Однако следует отметить, что в опытах Б.П.Токина и А.Г.Филатова с яйцеклетками и бластоцистами самой устойчивой оказалась культура золотистого стафилококка. Действие специфической половой инфекции ими не испытывалось. Насколько можно судить по результатам эксперимента Р.Гваткина R. Gwatkin, 1967 перед вирусной инфекцией яйцеклетка беззащитна.
Проникновение вирусов обычно происходит через и каналы прозрачной оболочки. Вирус Mengoencephalitis обнаруживали в перевителиновом пространстве мышиной морулы уже через 10 минут после помещения ее в среду, содержащую вирусы. Поражалось от 93 до 100 морул. С начала 80-х годов стали поступать новые научные данные о надежной барьерной функции неповрежденной зоны пеллюцида, окружающей эмбрион до 8-9 дня развития.
До выхода из оболочки эмбрион не может быть инфицирован микробным или вирусным агентом, даже если донор был искусственно заражен возбудителем бруцеллеза, лейкоза, вирусной диареи, инфекционного ринотрахеита, везикулярного стоматита, ящура, блутанга и акабаны W. Hare, 1986 С. Z1 Ecuger, 1986 H. Niemann, 1986 Е. Singh, 1987 M. Thibier, 1987 . Известно, что у крупного рогатого скота эмбрионы первые 13 дней свободно перемещается в просвете матки, а на 9-10 день она теряет зону пеллюцида.
Влияние в это время какого-нибудь неблагоприятного фактора, например, микроорганизмов или вирусов, может привести к гибели зародыша A.M.Scofield et al 1974 Н.П.Чечеткина, П.П.Фукс и соавт 1987 . Эти авторы подвергали бактериологическому исследованию матки 39 свиней, убитых через 9 или 13 дней после случки. При этом у 22 свиноматок матка не была инфицирована, у 12 - инфицирована и у 4 - частично инфицирована.
Авторы установили статистически значимое различие в количестве погибших яйцеклеток или эмбрионов в инфицированных и неинфицированных матках, и считают, что основной причиной гибели эмбрионов в ранний период супоросности является микробная загрязненность матки. И.Сакала и соавт И.Линн и соавт. установили, что введение в половые пути коров микробов, принадлежащих к группе коменсалов, населяющих обычно кишечник или кожный покров, приводит к нарушению полового цикла, патологическим явлениям и резкому снижению оплодотворения животных I. Sakala et al 1961 I.E.Lynn et al 1966 . Несмотря на противоречивость литературных данных, большинство авторов склонны к тому, что микроорганизмы отрицательно влияют не только на переживаемость и оплодотворяющую способность спермиев, оплодотворение яйцеклетки, но и на выживаемость эмбрионов.
Если для искусственного осеменения крупного рогатого скота приняты санитарные нормы для неразбавленной спермы быков, которыми допускается содержание не более 5 тыс. непатогенных микробов в 1 куб. см Н.Г.Балашов, 1989 , то при трансплантации эмбрионов этот фактор не учитывается, хотя предусмотрен санитарный контроль их качества.
В связи с этим перед нами возникла необходимость проведения исследований по влиянию количества и качества микроорганизмов на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов у крупного рогатого скота. 3.5 Влияние антибиотиков на спермии, яйцеклетки, эмбрионы Многие исследователи установили, что одной из причин снижения биологического качества спермы, возникновения гинекологических заболеваний, абортов и бесплодия самок может быть контамированная сперма Г.В.Зверева, 1971 В.С.Шипилов, 1977 Н.Г.Балашов, 1980 Ф.И.Осташко, 1977 С.И.Сердюк, 1979 . Поэтому учеными были проведены многочисленные исследования по санированию спермы.
В качестве санирующих средств испытали такие антимикробные препараты, как антибиотики и сульфаниламиды. Механизм действия большинства антимикробных средств был известен, при этом необходимо было подобрать вещества с избирательным действием на микроорганизмы так, чтобы они не оказывали токсичного действия на биологические объекты спермии, I яйцеклетки, эмбрионы и т.д. Н.Г.Балашов, 1980,1981 . Многие исследователи доказали эффективность большинства антибиотиков и сульфаниламидов при использовании их для санации спермы R.H.Foote et al 1948 N. Yoshida et al 1951 И.И.Соколовская и соавт 1956 . А также установили, что не все антибиотики можно использовать для деконтаминации спермы из-за их токсичности, устойчивости разных видов микробов к ним И.И.Соколовская, 1960 А.П.Волосевич, 1963 С.И.Сердюк и соавт 1970 . Примером является токсичность многих серий стрептомицина и резистентность микроорганизмов к пенициллину и стрептомицину.
Поэтому дальнейшие исследования были направлены на поиск комплексов антибиотиков широкого спектра действия и нетоксичных для спермиев КосаревС. Р С.Р.Косарев с сотрудниками 1984 испытали 15 антимикробных препаратов на их безвредность и влияние на микроорганизмы.
Ими установлено, что лучшими из них являются комплекс пенициллин канамицин по 250 тыс. Ед и гентамицина 150 тыс. Ед на 100 мл среды для разбавления спермы.
Т.Стоянов 1987 в своих опытах показал, что гентамицин, амоксициллин, канамицин и полимиксин сохраняют переживаемость сперматозоидов на том же уровне, что и контрольная среда без антибиотиков не убивает микробы, а лишь задерживает их рост и размножение, в дальнейшем они подавляются защитными силами макроорганизма Д.К.Червяков, А.Н.Терезова, 1980 . П.А.Чахмахчев 1989 изучил эффективность применения полимиксина- М сульфата, спермосана-3 и спермосана-ППК в средах при разбавлении спермы быков и установил, что лучшим препаратом является спермосан-ППК. В последние годы в ветеринарной практике широко используется антибиотик гентамицин, который обладает широким антимикробным спектром. Он действует бактерицидно, подавляя синтез белка, ингибируя процессы трансляции и активен по отношению к стафилококкам, эшерихиям и псевдомонадам А.С.Новохатский и соавт 1975 Д.Ф.Осидзе, 1981 С.М.Кузнецова, 1983 В.Ф.Ковалев и соавт 1988 . Несмотря на неодобрение многих авторитетов, применение комплекса антибиотиков стало обычным делом в клинической практике.
Наиболее хорошо известным примером синергизма между антибиотиками является взаимодействие пенициллинов саминогликозидами.
Этот комплекс проявляет синергизм в отношении зеленящих стрептококков, энтерококков, золотистых стафилококков, листерий и грамотрицательных палочек С.М.Кузнецова, 1983 . Механизм синергизма между пенициллинами и аминогликозидами не известен.
Он может состоять в увеличении проникновения аминогликозидов в бактериальную клетку в присутствии пенициллина, который ингибирует синтез клеточной стенки, как это было предложено при объяснении действия комбинации пенициллин аминогликозиды на энтерококки. Однако, независимо от возможного механизма имеющиеся данные показывают, что комбинированное лечение может значительно повысить эффективность антибиотикотерапии инфекций, вызванных Ps. aeruginosa И.С.Чекман и соавт 1986 В.Ф.Ковалев и соавт 1988 . Санирующий эффект препарата зависит от дозы чем больше доза препарата, тем отчетливее выявляется санирующий эффект.
Однако увеличение дозы приводит не только к усилению действия препарата, но и к повышению его токсичности Н.Г.Балашов, 1980 . А.С.Новохатский, С.С.Герасимова 1975 изучали цитотоксические свойства гентамицина. Они установили, что гентамицин в концентрации 10, 20 и даже 30 мкг мл не вызывал нарушений целостности клеточного пласта после 24 часовой инкубации при температуре 37 С. Концентрация 50 мкг мл и больше приводила к цитотоксическому изменению клеток. А.П.Простяков и С.П.Сергеева 1980 отметили высокую стабильность гентамицина в культуральной среде 6 дней период полураспада, а также цитотоксическую 3000 мкг мл и рекомендуемую концентрацию 200 мкг мл. В опытах Х.Г.Михаеляна 1988 в культуральной среде с концентрацией гентамицина 50 мкг мл созревание ооцитов достигло 100 , из них 84 клеток созрело до стадии метофазы II, в контроле без антибиотиков до этой же стадии созревало только 70 . Для подавления же большинства микроорганизмов достаточна концентрация гентамицина 4 мкг мл Д.Ф.Осидзе, В.Ф.Ковалев, К.С.Масловский, 1981 . В 1986г. для санации вымывных буферных сред в лаборатории трансплантации А.Д.Бугровым, И.М.Величко и соавт. предложен и испытан комплекс антибиотиков гентамицин пенициллин ампициллин в концентрациях 12 мкг мл и 100 Ед мл, соответственно.
Эта комбинация дала хороший антимикробный эффект по отношению к микроорганизмам, встречающимся в половых путях доноров E.coli, Staph. aureus, Bac.subtilis, Pseudomonas aeruginosa. По данным И.С.Чекмана 1986 гентамицин не совместим с антибиотиками из группы бензилпенициллин, совместим с изотоническим раствором хлористого натрия.
При совместном применении гентамицина с ампициллинонатриевой солью, карбенициллином или линкомицином усиливается их антибактериальный эффект. Т.А.Зацепилова и А.Н.Кудрин 1983 установили, что переход лекарственных веществ из жидкости матки через оболочку морулы и бластоцисты зависит от его молекулярной массы.
Многие авторы независимо друг от друга определяли влияние антибиотиков на яйцеклетку.
Так, М.Ф.Карашаев 1987 установил отрицательное влияние комплекса антибиотиков пенициллин стрептомицин 100 Ед мл и 50 мкг мл на созревание ооцитов. Таким образом, можно сделать вывод, что применением антибиотиков, как компонентов сред, можно контролировать развитие микрофлоры.
Однако не все антибиотики, которые обладают широким спектром антимикробного действия, можно использовать для санации спермы, промывных буферных сред, эмбрионов. Лучшими комплексами антибиотиков для них являются аминогликозиды в сочетании с пенициллинами, примером которых, является гентамицин. Из пенициллинов в комбинации с гентамицином лучше всего сочетается ампициллин. Анализ литературных данных показал, что несмотря на достигнутые успехи в эмбриотрансплантации, проблемными остаются вопросы по приживляемости эмбрионов.
Известно много причин, влияющих на приживляемость эмбрионов, одной из которых является микробный фактор. Хотя многие известные ученые не учитывают влияние микрофлоры на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов считая, что эмбрионы с интактной зоной пеллюцида надежно защищены от микробов и вирусов. Однако в литературе есть данные о том, что некоторые вирусы и прилипают к прозрачной оболочке и заносятся вместе с эмбрионом в матку реципиента, оказывая негативное влияние на него. Недостаточное количество противоречивых данных о влиянии микроорганизмов на приживляемость эмбрионов стало основанием для проведения исследований по данной проблеме.
С целью предупреждения заноса инфекции при трансплантации отечественными и зарубежными учеными разработаны различные технологии, приемлемые в хорошо оборудованных центрах трансплантации эмбрионов. В производственных условиях необходимы дополнительные меры профилактики микробной загрязненности.
Известно, что лучшими антимикробными средствами являются антибиотики. Тем не менее, в доступной для нас литературе мало данных о влиянии антибиотиков на эмбрионы. Поэтому перед нами встала задача изучить влияние различных антибиотиков и их доз для профилактики микробной контаминации на всех этапах эмбриотрансплантации. 2.