1. Разработана Айзенбергом и Кауцманом. Особое внимание обращается на масштаб времени наблюдения за структурой. Удалось обнаружить 3 структуры воды:
1) если сделать снимок с длительностью экспозиции намного меньше, чем период колебаний молекул воды (t<<tкол., t=2*10–13 c), то мы регистрируем М-структуру, которая характеризуется малой упорядоченностью.
2) если продолжить t>>tкол., но намного меньше времени вращения тел диффузии t=10–5 с, то удается пронаблюдать К-структуру. Она характеризуется упорядоченным расположением молекул воды, но случайностью ориентации.
3) при t>>периода вращения диффузии получается Д-структура. Она характеризуется регулярным расположением молекул воды и их правильной, закономерной ориентацией.
2. Кластерная модель Шерага.
Жидкая вода состоит из отдельных молекул и структурно связанных кластеров. Кластеры постоянно распадаются и возникают вновь. Это создает усредненное окружение для каждой отдельно взятой молекулы воды, - слабо учитывает молекулы воды в молекулярных группах.
3. Модель Самойлова
рассматривает структурные изменения воды при различных температурах. Предположим, что во время таяния льда, оторвавшаяся молекула воды заполняет пустоты кристаллической решетки, при этом увеличивается удельный вес. Максимальный удельный вес воды наблюдается при +40С, при более высокой t0 происходит увеличение амплитуды колебаний молекул воды, увеличение занимаемого ею объема и снижению плотности.
Растворимость различных веществ в воде
В воде хорошо растворяются электролиты вследствие высокой диэлектрической проницаемости воды, так же вещества с большим дипольным моментом и вещества, способные образовывать водородные связи с молекулами воды.
Рисунок. Нерастворимые вещества в воде: различные углеводороды, масла, жиры. Это объясняется тем, что контакты между молекулами Н2О–Н2О и С6Н6–О молекулами оказываются более выгодными, чем С6Н6–Н2О. В любой ситуации, когда свободная энергия раствора меньше свободной энергии воды и растворимого вещества, данное вещество хорошо растворяется в воде (и наоборот).
Гибкость полимерных молекул
Молекулы биополимеров сложны и обладают набором свойств.
Инфрмационность полимерных молекул базируется на разнообразии мономерных звеньев. Любая био молекула представляет собой своеобразный био текст и несет в себе некоторый объем информации. Для биофизики важны свойства и информация молекул, для этого информационные молекулы сравнивают с модельными молекулами. К ним относят каучук, он обладает эластчностью (свойство, характерное для биополимеров). Эластичность – это способность полимера испытывать большие упругие деформации (достигающие 100%) при малом модуле упругости. Но в каучуке нет информации, так как он состоит из мономеров, это достоинство используется для сравнения с биополимерами для выяснения биофункции.
Молекулы каучука подчиняются законам Гука
σ = ε(L0–L)/L0,
напряжение σ равно модулю упругости ε, L0 – начальная длина, L – конечная длина. Каучук обладает некоторыми свойствами идеального газа. Энтропийный характер упругости для идеального газа означает, что при движении поршня внутри цилиндра и росте давления в нем, мы переводим его из более вероятного состояния в менее верояное сжатое состояние, понижается энтропия газа. С каучуком происходит тоже самое. Между элементами каучука, связанными в линейную цепь, существуют связи между которыми могут происходить вращения, в результате чего изменяется конформация цепи. В биополимерах так же есть такие связи: С-С, С-N, С-О, вокруг которых могут происходить вращения – молекулы биополимеров обладают конформационной лабильностью. Эти конформационные свойства играют важную роль, так как на них базируются все функционально важные свойства биополимеров.
Клубок, глобула и условия их существованиия
Рисунок. Благодаря вращению вокруг единичных связей, цепочка биополимеров сворачивается самопроизвольно в клубок.
N – количество звеньев
l – средняя длина звена (длины звеньев не равны)
h – расстояние между началом и концом
Нужно найти размер клубка.
h=0, так как конец цепочки может равновероятно находиться в любом месте по отношению к началу, поэтому находят h2 , так как он не равен нулю.
h2=Nl2*(1+cosQ)/(1-cosQ)
рисунок. Q – угол вращения, угол между продолжением и звеном цепи. h2 характеризует размеры полимерного статического клубка. Состояние клубка является наиболее вероятным состоянием биополимера. Ему соответствует максимальная энтропия.
Есть прямые доказательства существования клубка биополимеров. Фотографии. При сворачивании в клубок между атомами возникают взаимодействия двух типов.
1) Взаимодействия ближнего порядка – взаимодействия между соседними полимерными звеньями.
2) Дальние взаимодействия, очень объемные эффекты. Они возникают между атомами, которые в цепочечной структуре биополимера отстоят далеко друг от друга, но вследствие изгибов цепи оказались на небольшом расстоянии. Вследствие объемных эффектов плотность звеньев в пространстве, занятом молекулой биополимера, может изменяться от точки к точке. Существует пространственная корреляция. В состоянии клубка флукитуация (колебания) плотности имеет порядок самой плотности. Однако наличие объемных взаимодействий может привести к такому состоянию в котором флуктуация плотности окажется малой по сравнению с плотностью. Такое состояние носит название глобулы.
Условия существования клубка и глобулы.
Важны заряды, расстояния между мономерами и t0. Увеличение t0 способствует отталкиванию звеньев, снижение приводит к притягиванию. Существуют t0 при которых отталкивание между мономерами полностью компенсируется их взаимным притяжением. Такая t0 соответствует точке Гетта Q (тепла). В Q-точке макромолекула представляет собой клубок с размерами R ≈ lN1/2. При увеличении t0 выше Q-точки возрастают силы отталкивания между мономерам и R > lN1/2 но макромолекула будет в виде клубка. При снижении t0 ниже Q-точки в объемных взаимодействиях будут преобладать силы притяжения между мономерам. Это приведет к конденсации полимерного клубка в плотное слабо флуктуирующее образование, которое называют глобулой, R ≈ lN1/3. Таким образом изменение t0 приводит к изменению размеров макромолекулы, изменению плотности мономеров, и как следствие к изменению энергии взаимодействия и изменению агрегатного состояния.
Свободная энергия взаимодействия звеньев зависит от плотности агрегации этих звеньев.
Рисунок. Вид клубка при нулевой температуре, F- свободная энергия, n – число звеньев. В состоянии клубка молекула имеет min свободной энергии при N ≠ 0. Где F=0 будут осуществляться обратимые переходы между клубком и глобулой. Переходы могут быть двух видов:
1) переходы первого рода: при изменении t0 наблюдается тепловой эффект, S и внутреняя энергия изменяются скачками.
2) фазовый переход второго рода: без тепловых эффектов. Теплоемкость при этом изменяется скачкообразно, S и внутреняя энергия изменяются плавно. В результате удельный V системы не испытывает скачкообразность изменений.
Таким образом вид перехода определяется свойствами макромолекулы. В случае жесткой полимерной цепи переход клубок-глобула осуществляется как фазовый переход первого рода, в случае гибкой цепи – как фазовый переход второго рода.
Рисунок. Графическая зависимость плотности мономерных звеньев от t0. n – плотность мономерных звеньев, 1 жесткая цепь, 2 гибкая цепь. В случае гибкой цепи нет конкретной Q точки, выделяется Q лишь область. В реальных био молекулах гибкость цепи может изменяться в силу различий отдельных участков.
Статистическая картина фазового перехода усложняется в реальных молекулах. Структуры перестройки зависят от физической природы взаимодействий между мономерными звеньями и необязательно усредняются по всему объему, занятому данной молекулой.
Статистическая теория полимерных цепей
СТПЦ берет начало в 50х годах ХХ века из Ленинграда. Основная идея СТПЦ заключается в том, что в полимерной цепи реализуются не любые повороты атомных групп вокруг единичных связей, но существуют лишь определенные поворотные изомеры. Конформацию ротомеров можно установить, если мы знаем химическую структуру цепи.
Рисунок. Этан. Более выгодня транс-конформация, так как вокруг единичной связи вращается молекула и меняется Е потенц.
Рисунок. Графическая зависимость Е потенц. от угла вращения. φ=0 при транс. При поворотах вокруг единичной связи молекула этана преодолевает своеобразный энергетический барьер = 12200 Дж/моль.
Величина энергетического барьера имеет в своей основе энергию дисперсионных сил, если взаимодействующие звенья не полярны; если же они полярны, то кроме дисперсионных сил, свой вклад вносят ориентационные и индукционные силы.
Рисунок. Бутан. СН3–СН2–СН2–СН3 энергетически более выгодна транс-конформация, при которой СН3 группы находятся на max расстоянии друг от друга. Время превращения одного ротомера в другой 10–10 с. Ротомеры нельзя разделить, они непрерывно переходят из одной конформации в другую.
Биофизика клетки. Мембранология.
Все клетки окружены цитоплазматической мембраной, которая представляет собой функциональную структуру, толщиной в несколько молекулярных слоев, которая ограничивает цитоплазму и большинство внутриклеточных структур, а так же образует единую систему канальцев, складок и замкнутых полостей, расположенных внутри клетки. Толщина редко превышает 10 нм, в этой структуре плотно упакованы липиды и белки, поэтому сухой вес мембраны составляет более ½ сухого веса клетки.
В середине XIX века Дюбуа-Реймон впервые сообщил, что между внутренней и внешней поверхностью кожи лягушки имеется разность потенциалов. Моль ввел термин "мембрана" , он изучал цитоплазму клеток растений и выяснил, что она окружена полупроницаемой мембраной. 1877 г. Пфейфер-ботаник, исследуя явление осмоса, пользовался как естественной, так и искусственной мембраной из осадочного ферроцианида. Cu → cходнства между ними → естественная мембрана участвует в явлении осмоса. Позднее стали говорить о генерации биопотенциала мембраны (конец XIX века). 1902 г – Бернштейн – мембранная теория потенциала покоя и потенциала действия → развитие мембранологии. Хаксли, Ходжкин и К0 впервые показала, что потенцилы покоя и действия базируются на избирательной проницаемости мембраны к определенным ионам (К+) – неодинаковое распределение ионов по обе стороны мембраны, в основе чего лежат процессы активного транспорта ионов через мембрану. С участием мембраны связаны: фоторецепция, рецепция, БАВ, передача нервного импульса, синтез ДНК.
Химический состав мембраны
Достаточно высокое содержание липидов, они составляют мембранную матрицу; белки составляют вариабильную часть; углеводы в виде гликопротеидов и гликолипидов. В мембране всегда находится небольшое кол-во воды (важная роль).
Липиды мембраны:
Классификация
I. Классы:
1. Липиды – производные глицерина. Кефалины – фосфодиэтаноламин, Лецитин – фосфатидилхолин.
2. Липиды – производные сфингозина. Сфингомиолин, цереброзиды.
3. Стерины – холестерин, β-ситостерин, эргостерин, зимостерин и т.д.
4. Минорные липиды - β-каротин, витамин К.
II. Группы:
1. Нейтральные липиды – холестерин, триглицериды.
2. Цвиттерионы – 2 заряда диполя – фосфотидилэтаноламин, фосфотидилхолин.
3. Липиды – слабые кислоты, фосфотидилсерин.
4. Липиды – сильные кислоты – фосфотидиловые кислоты и сульфокислоты.
Мембранные белки
С трудом поддаются выделению, многие вообще не выделяются без нарушения структуры. Белки в мембране отличаются большим разнообразием. Большинство белков в мембране находятся в виде клубка, 30% белков могут находится на поверхности мембраны в виде спирали. Существует несколько классификаций мембранных белков:
I. Функциональная классификация
1. ферментативные,
2. транспортные,
3. рецепторные,
4. каналообразующие,
5. воротные,
6. структурные.
II. Классификация по локализации по отношению к липидам.
1. интегральные,
2. периферические.
Интегральные белки погружены в мембрану или пронизывают ее насквозь. Периферические белки на поверхности мембраны и слабо связаны с ней – слабые взаимодействия. На поверхности интегральных белков имеется значительно меньше участков, несущих электрический заряд, чем на поверхности периферических белков.
Вандеркой и Капалди 1972 г. – все аминокислоты делятся на полярные, неполярные и промежуточные. Полярность а-к первой группы приняли за 1, полярность а-к второй группы – за 0, полярность а-к третьей группы – за ½. Изучили состав периферических и интегральных белков: 20 видов мембранных белков: средняя полярность всех белков равна 0,46; интегральные белки имеют полярность от 0,3 до 0,4; периферические белки имеют полярность от 0,41 до 0,53.
Углеводы мембран
В связанном виде не встречаются. В состав мембранных углеводов входят следующие сахара:
- Д-галактоза,
- Д-глюкоза,
- ацетилглюкозамин,
- ацетилгалактозамин,
- Д-фруктоза,
- Д-манноза,
- Д-ксилоза.
Родопсин – гликопротеин оболочки сетчатки, состоит из углеводородной цепочки (4%), связанной с белками М=28000 Да. Гликопротеиды являются рецепторами для гормонов, медиаторов, пептидов и др. Большое кол-во гликопротеидов в вирусных оболочках (до 40% оболочки).
Вода
С ней связаны многие структурно-функциональные свойства мембран, а так же процессы стабилизации и формирования мембран. Вода входит в состав мембран и делится на свободную, связанную и захваченную. Связанная и свободная вода различается по подвижности молекул воды и растворяющей способности. Наименьшей подвижностью и растворяющей способностью обладает внутренняя связанная вода. Она присутствует в липидной зоне мембран в виде отдельных молекул. Основную часть связанной воды представляет вода гидратных оболочек. Эта вода окружает полярные группы белков и липидов, имеет min подвижность и практически не обладает свойствами растворителя. Свободная вода в порах и каналах. По ней могут перемещаться свободные ионы. Она является хорошим растворителем, подвижная и обладает всеми свойствами жидкой воды. Захваченная вода обладает изотопным движением, характерным для жидкой воды, является хорошим растворителем. Она встречается в центральной зоне мембран, между ее липидными слоями, но эта вода пространственно делится как с внеклеточной жидкостью, так и с цитоплазмой. У нее нет возможности свободно с ними обмениваться.
Струкрурная организация мембран
Плохо изучена, но внедряется электронная микроскопия, ЯМР, ЭПР.
Мембраны – 3х слойная структура с наружным и внутренним слоем, тонкие, темные до 2,5 нм, внутренний слой между ними светлый до 3,5 нм. Считается, что основой биомембран в большинстве случаев являются мембранные липиды. 1925 г. Грейбель и Гортер описали свойство фосфолипидов самопроизвольное образованием ими угла биомолекулярного слоя с замкнутой поверхностью в водной среде. Липиды образуют шаровидные образования.
Рисунок. В другой работе показано, что такие образования сохраняют устойчивость, если внешний d этой замкнутой поверхности не меннее 30 нм, так как чем меньше d, тем зазоры между головками липидов больше и вода просачивается внутрь замкнутого образования и нарушает стабильность. Стабильность бислоя определяется заряженными головками липидов.
Ассимметричность – 2ух слоев, они могут состоять из разным липидов.
Эритроцитарная мембрана: во внешнем слое много фосфатидилхолина и сфингомиелина, во внутреннем слое много фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина. Во многих случаях неполярные хвосты содержат цепочки от 10 до 22 атомов С, между которыми могут быть насыщенные и ненасыщенные связи, это обуславливает ряд свойств мембран. Чем больше ненасыщенных связей, тем ниже t0 замерзания липидного бислоя. Внутренний слой бислоя нерыхлый, он содержит множество холестерина, он заполняет пространство между неполярными хвостами, влияет на t0 замерзания бислоя: чем больше холестерина, тем ниже t0 кристаллизации. Холестерин участвует в стабилизации мембран и будет влиять на проницаемость мембран, чем его больше, тем ниже проницаемость мембраны.
Мембранные липиды обладают динамическими свойствами:
- способность липидной молекулы к латеральной диффузии, коэффициент латеральной диффузии равен 3,25*10–8 см/сек. Коэф отражает способность перемещения липидной молекулы вдоль мембраны,
- вращательная диффузия, К=10–9 сек,
- flip-flop переход, липидные молекулы пересекают мембрану, переходя из одного слоя в другой. К=10–3 сек средняя величина, показывающая число переходов – 1 переход в 1000 сек.
Организация мембранных белков
Большая часть мембранных белков находится в виде клубка (≥70%), основная часть может разворачиваться на поверхности липидного бислоя вследствие электростатического взаимодействия с липидными головками. В этом случае белки будут расположены на поверхности липидов в виде спирали.
Родоспин, М=28000 Да, форма сферы, d=4 нм, мелкая молекула.
Динамические свойства белков.
1. Латеральная диффузия. все значения для белков с М=100000, К=3*10–10 см/сек. Но белки могут объединяться в кластеры, которые мало подвижны.
2. Вращательная диффузия К=0,34 сек.
3. flip-flop переходы, К=10–4 сек – частота flip-flop перехода.
Модели биологических мембран
В 1935 г. модель Даниэля Доусона унитарная модель био мембран. Липидный бислой – структурная основа. Наружный и внутренний слои – глобулярные белки. Симметричная модель.
Модель Робертсона (середина 60х г). Мембрана представляет собой 3х слойную структуру, средний слой из липидов. Белковые молекулы развернуты на поверхности двойного липидного слоя вследствие электростатических взаимодействий заряженными головками фосфолипидов. Модель Робертсона ассимметрична, так как на наружной поверхности мембраны – гликопротеиды.
В группе моделей предполагается наличие белков матрицы. Модель Лючи (середина 60х г.) – белково-кристаллическая модель.
Модель _______________ (1970) сохраняется концепция липидного бислоя, однако этот слой прирастается участками симметрично расположенных белков, они жестко фиксированны пространственно за счет дальнодействующих белок-белковых свойств.
Модель Сенгера и Николсона. 60-70 г. Основа – липидный бислой, в который включены молекулы интегральных и периферических белков.
Жидкомозаичная модель. С ее помощью объясняется проницаемость мембран.
Мембранный транспорт
Активный: вещества переносятся через мембрану против концентрационного, электрического и других видов градиентов, на это тратится энергия клеточного метаболизма. Первичный активный транспорт и вторичный активный транспорт.
Пассивный: вещество без затрат энергии клеточного метаболизма переносится через мембрану в направлении градиента. В его основе диффузия и осмос.
Диффузия
определяется движением молекулярных частиц по направлению концентрационного градиента. Диффузия в физике рассматривается на примере простых моделей. Для полной диффузии необходимо несколько суток. Для био систем скорость диффузии не изменяется, но она осуществляется очень быстро. Процесс диффузии через мембрану изучают на примере:
Скорость диффузии будет определяться количеством вещества, диффундирующем в единицу времени.
Закон Фика.
dQs/dt=Ds*A*dCs/dx
dQs/dt – количесво вещества диффундирующее в единицу времени
Ds – коэффициент диффузии
А – площадь поверхности
dCs/dx – концентрационный градиент (изменение концентрации вещества с расстоянием)
Для скорости диффузии важной величиной является концентрационный градиент. Коэф диффузии зависит от природы и молекулярной массы растворенного вещества и растворителя. Из правого в левый движение хаотичное, но оно не велико. Будут наблюдаться однонаправленные потоки – количество растворенного вещества, пересекающих единицу площади поверхности молекулы за 1 секунду в данном направлении.
Iоднонапр потока = dQs/dt , I измеряется в моль/см2*сек.
Однонаправленный поток вещества в одном направлении не зависит от потока этого же вещества в противоположном направлении.
dQs/dt=P*(C1-C2),
для описания диффузии незаряженных молекул.
Р – проницаемость мембраны,
(C1-C2) – разность между концентрацией вещества 1 и 2.
[C]=моль/см3,
[P]=cм/с.
Скорость движения незаряженных молекул является линейной функцией концентрационного градиента. Р является функцией рассматриваемых мембран и диффунцирующего вещества.
Р=Дм*К/х,
Дм коэффициент диффузии вещества внутри мембраны (чем больше вязкость мембраны, тем больше диффузия молекул, тем ниже эта величина). К- коэффициент распределения. х – величина толщины мембраны. Коэффициент проницаемости от 10–12 до 10–2 см/сек эритроцитарный.
Под действием антидиуретического гормона проницаемость мембраны может возрастать в 10 раз.
Осмос
1748 г. – открытие осмоса. Офицально считается, что открыл Жан-Антуан Молле. Особые свойства мочевого пузыря лягушки. установил, что эта мембрана обладает особым свойством: если по одну сторону чистая вода, по другую растворенные вещества (растворы сахаров). В этих условиях вода начинает активно проникать через мембрану мочевого пузыря в раствор.
Осмос заключается в переходе молекул воды через мембрану по направлениям ее концентрационных градиентов. Наступает равновесие (динамическое) определяется фактором осмотического давления (направление слева направо).
Гидростатическое давление раствора в правом отсеке, когда эти два давления уравновесили друг друга, то мы получим равновесие. Вывод: для того, чтобы измерить осмотическое давление раствора нужно измерить гидростатическое давление во втором отсеке.
В 1877 г. Пфейффер определил количественный показатель осмоса с помощью осмометра (имеет полупроницаемую мембрану – из осадочного ферроцианида Сu). Пфейффер сделал заключение – осмотическое давление пропорционально концентрации растворенного вещества.
Вант-Гофер: в термодинамическом отношении молекулы воды ведут себя подобно молекулам газа.
π=RTS или π=RTη/V,
π – осмотическое давление,
RTη – количество молей вещества,
R – газовая постоянная,
Т – абсолютная температура,
С – концентрация.
Это выражение справедливо лишь для разбавленных растворов.
Осмотичность:
два раствора, в которых создается одинаковое осмотическое давление по обе стороны мембраны проницаемой только для воды называются изоосмотическими, растворы содержат в единице объема одинаковое число растворенных молекул. Если один из растворов имеет осмотическое давление по отношению к другому, то первый раствор называется гиперосмотически, второй – гипоосмотическим.
Тоничность:
определяется по реакции клеток и тканей на их погружение в раствор; если при погружении в раствор ткань не набухает, не сморщивается, такой раствор называют изотоническим по отношению к ткани. Если при погружении ткань набухает – раствор гипотонический, если ткань сморщивается – раствор гипертонический.
Транспорт ионов
Необходимо учитывать и влияние электрических сил.
1. На заряженные частицы (органические и неорганические ионы) действуют 2 силы, определяющие их диффузию через мембрану: концентрационный градиент и электрическая сила (определяется разностью потенциалов). Совокупность этих двух сил составляет электрохимический потенциал.
2. Существует разность потенциалов, уравновешивающая действующий на данный ион концентрационный градиент и предотвращающая трансмембранный перенос данного иона. В этой ситуации будет существовать некоторое состояние равновесия – электрохимическое равновесие, а соответствующие потенциалы мембраны будут называться равновесными потенциалами. Например, на мембране много К+, идет отток К+. Если зарядить внутреннюю поверхность мембраны до –97 мВ, для Na+ равновесный потенциал ≈ +55 мВ.
3. Диффузия заряженных частиц может происходить против концентрационного градиента, если электрический градиент будет направлен противоположно концентрационному и будет превышать его действие.
Доннановское равновесие
Фредерик Доннан – физико-химик, 1911 г.
Если налить в сосуд с полупроницаемоей перегородкой воды, то в 1 и 2 будет вода. Доннан добавил в первый отсек соль KCl. По прошествии определенного времени концентрации различных ионов в двух отсеках стали равны. Доннан взял соль с органическими ионами, которые не проходят через мембрану. Через некоторое время ионы K+ и Cl– начинают диффунцировать. Наступает ситуация при которой в первом отсеке [K+] больше, чем во втором, в первом отсеке [Cl–] меньше, чем во втором.
Вывод: анион, не проходящий через мембрану оказывает на распределение анионов и катионов, свободно проходящих через мембрану между отсеками.
Такая же ситуация наблюдается и в клетках и в биосистемах. Установленное Доннаном равновесие обусловлено несколькими фактами:
1. Оба отсека по отдельности должны быть электронейтральными, то есть в каждом отсеке число "+" ионов должно быть равно числу "–" ионов.
2. Диффундирующие ионы (K+ и Cl–) пересекают мембрану парами, при этом сохраняется электронейтральность отсеков. Вероятность пересечения мембраны этими ионами определятется произведением их концентраций [K+]*[Cl–].
3. В равновесии скорость диффузии KCl в одном направлении равна скорости диффузии KCl в противоположном направлении. Поэтому [K+]*[Cl–] должно быть одинаковым для обоих отсеков.
Математическое выражение Доннановского равновесия:
[K+]2/[K+]1=([A–]1+[Cl–]1)/[Cl–]2.
Механизмы пассивного транспорта через мембраны
Пассивный транспорт осуществляется главным образом тремя способами:
1. Вещества, находящиеся в водной фазе по одну сторону мембраны, растворяются в липидно-белковом слое мембраны, пересекают его и вновь переходят в водную фазу с противоположной стороны мембраны.
2. Вещества, которые перемещаются через поры или каналы мембраны, заполненные водой.
3. Молекулы транспортируемого вещества соединяются с молекулой переносчиком, встроенным в мембрану и переносчик опосредует или облегчает транспорт – этот транспорт называют облегченной или опосредованной диффузией. Молекулы переносчика всегда жирорастворимы, они ускоряют транспорт веществ по их концентрационному или электрохимическому градиенту.
Первый механизм:
Простой транспорт. Он осуществляется под влиянием теплового движения частиц. Для того, чтобы попасть из водной фазы в липидную, молекула должна разорвать все свои водородные связи с водой, на это затрачивается энергия 5 ккал/моль водородных связей. Чем меньше молекула образует водородных связей, тем больше ее шансы проникнуть через мембрану. Этот вид транспорта только для незаряженных молекул. На подвижность молекулы внутри мембраны будет влиять молекулярная масса и форма молекулы. Но самый главный фактор – это коэффициент распределения. Он определяется экспериментально: берется пробирка, соедржащая равные объемы (количества) воды и оливкового масла, затем в нее добавляется исследуемое вещество. Пробирку хорошенько встряхивают, чтобы смесь распределилась по всему объему. Затем определяют концентрацию этого вещества в воде и в масле.
Коэф. распр. К = конц в-ва в липидной фазе / конц в-ва в водной фазе.
1937 г. Колландер Р. провел очень большие исследования на гигантских клетках пресноводных водорослей, которые были посвящены изучению зависимости коэф. распр. и проницаемости мембраны для веществ Þ существует некая генеральная зависимость.
Распределение точек для различных веществ. Но были исключения, например H2O, CO2 и другие мелкие незаряженные молекулы – наблюдаются большие колебания К и проницаемости. Гексанол (1 ОН) и монитол (6 ОН) одинаковы по элементарному составу. Это приводит к тому, что –ОН группы образуют водородные связи с водой, поэтому снижается растворимость вещества в липидах, это сказывается на К. Наличие только одной –ОН группы снижает К » в 40 раз.
Поэтому гексанол диффундирует гораздо быстрее, чем монитол.
В отношении воды было сделано предположение: она дополнительно диффундирует через поры мембраны. Это было доказано экспериментально: если брать синтетическую мембрану, но состоящую только из липидов, вода проходит через нее Þ еще одни механизм, связанный с динамическими свойствами липидов. Так как во время этих динамических движений образуются дефекты и очень подвижные молекулы воды успевают протикнуть через них через мембрану.
Кинетика такого транспорта характеризует графическую зависимость скорости поступления через мембрану от концентрации вещества вне клетки. Эта прямая отражает кинетику без насыщения (то есть концентрация вещества может возрастать до бесконечености). Такая кинетика отличает простую диффузию от двух других механизмов пассивного транспорта.
Второй механизм:
Диффузия через мембранные каналы. Основная масса каналов специфична (пропускает только один вид ионов), другие или не- или частично специфичны, причем каналы заполнены водой. Это доказано экспериментрально в наблюдениях на искусственном липидном бислое. Если на его поверхность поместить электролит, то прохождения ионов нет, если добавить каналообразующие белки, то возникает электрический ток. Каналообразующие белки выделяют из природного сырья, причем они самостоятельно встраиваются в мембрану. В настоящее время разработаны методы выделения каналообразующих белков. Нестатин – противогрибковый антибиотик, его молекулы представляют собой стержневидные образования, которые могут встраиваться, как в естественные, так и в искусственные мембраны.
Через такие поры могут проходить отрицательные ионы (Cl–, молекулы воды, мочевина, мелкие незаряженные частицы, +заряженные частицы не проходят). На такой модели изучали этот вид транспорта. В области высокой концентрации наблюдается явление насыщения, так как пропускная способность ионноых каналов ограничена. Но в биосистемах явления насыщения не встречается.
Третий механизм:
Облегченная диффузия.
Это говорит, что скорость увеличивается только при относительно низких концентрациях. Это кинетика насыщения.
Причины кинетики насыщения:
1. Связывание проникающей молекулы с определенным участком внутри канала или вблизи него.
2. Основная причина – транспорт вещества через мембрану с помощью молекулы-переносчика:
а) количество молекул-переносчиков ограничено,
б) скорость из реагирования с переносимым веществом так же лимитирована.
Скорость облегченной диффузии достигает max, когда все молекулы переносчика будут заняты транспортируемым веществом.
Теория облегченной диффузии напоминает теорию субстрат-связывающего комплекса. Данный вид транспорта можно ингибировать с помощью химических аналогов транспортируемого вещества.
Механизмы первично активного транспорта
Энергия клеточного механизма концентрируется в виде АТФ. Существуют специальные мембранные насосы, их совокупность – первично активный транспорт. Источник энергии – клеточный метаболизм, если отключить источник энергии, то ионы расположатся равномерно, относительно мембраны. Концентрационный градиент направлен внутрь клетки, ионы Na пассивно поступают внутрь клетки. Но концентрационный градиент постоянен, так как ему противостоят Na насосы.
Основные особенности первично активного транспорта:
1. Осуществляется против концентрационного градиента.
2. Система первичного транспорта в высшей степени специфична (Na система не перекачивает другие ионы).
3. Для его обеспечения необходима АТФ или другие источники энергии (метаболические яды блокируют насос).
4. Обменивает один вид ионов на другой (К-Na насос).
5. Многие виды ионных насосов выполняют электрическую работу, перенося заряды через мембрану (реогенный насос – это насос, при работе которого создается электрический ток).
6. Активный транспорт с помощью ионных насосов избирательно подавляется блокирующими агентами. (Существуют специфические вещества, которые блокируют данный насос, например, убаин – сердечный гликозид. Это вещество конкурентно блокирует участки, связывающие ионы К+.)
7. Энергия, необходимая для первично активного транспорта, высвобождается при гидролизе АТФ ферментами, расположенными в мембране. Активность ферментов зависит от концентрации ионов.
Современная гипотеза первично активного транспорта
K-Na-АТФаза – молекула из двух субъединиц, имеющих внутренние полости: a-большая субъединица (полипептид), b-малая субъединица (гликопротеид). a обладает высоким сродством к Na +, b - к К+. Полость a-субъединицы заполняется 3 ионами Na+, полость b-субъединицы заполняется 2 ионами К+. Потом у a-субъединицы сродство к Na+ падает, а у b-субъединицы сродство к К+ возрастает.
За счет флуктуации происходит пространственное совмещение полостей субъединиц и обмен ионами. В конце цикла полости открываются, и ионы их покидают.
Другая гипотеза. В начале происходит заполнение полостей описанным выше способом, затем поворот K-Na-АТФазы на 1800. После чего ионы покидают полости, а K-Na-АТФаза опять поворачивается на 1800. Если молеула постоянно переворачивается, то это должно привести к перестройке молекулярного слоя – спорный момент.
Механизм вторично активного транспорта
заключается в переносе веществ через мембрану против концентрационного градиента, обеспечиваемом энергией, которая высвобождается при переносе другого вещества по градиенту. То, что транспортируется по градиенту, называется синпортом, или ко-транспорт. Пример, транспорт а-к или сахаров через био мембраны.
Транспорт в клетки аланина.
В присутствии внеклеточных ионов Na+ транспорт аланина в клетки осуществляется до тех пор, пока внутриклеточная концентрация Na+ будет в 7-10 раз больше внеклеточной. Если во внеклеточной среде Na+ отсутствует, то концентрация аланина внутри клетки не отличается от внеклеточной.
2 рисунка. max скорость транспорта в двух случаях одинакова. Внеклеточный Na+ оказывает непосредственное влияние на транспорт аланина (различный наклон графиков). Если повысить внутриклеточную концентрацию Na+, то аланин из клетки будет выходить во внеклеточную среду. Вторично активный транспорт не зависит от концентрации Na+ вне клетки, а зависит от концентрации градиента ионов Na+. Градиент Na+ является движущей силой, промежуточной стадией в процессе использования энергии (в системе вторично активного транспорта).
Системы антипорта, или контр-транспорта – это система вторично активного транспорта, функциорующая на основе переносчика обменника, обеспечивающего выведение из клетки транспортирующего вещества против его концентрационного градиента в обмен на сопряженный, пассивно поступающий в клетки поток ионов Na+. Движущей силой является потенциальная энергия концентрационного градиента ионов Na+.
Примеры:
1. Транспорт Ca2+ в обмена на Na+, осуществляется во многих типах клеток. Уровень концентрации внутриклеточного Ca2+ 10–9 моля, внеклеточной – 10–6 моля. Мышечное сокращение, выделение нейромедиаторов синапсами регулируется Са2+-зависимыми К+-каналами. Механизм: и ионы Nа+ и ионы Са2+ имеют один и тот же переносчик, у внутренней поверхности мембраны, обладающей высоким сродством к Са2+, у наружной – к Nа+. Са2+-насос удаляет Са2+ из клетки.
2. Антипортная система клеток проксимальных отделов нефрона, обменивающая Nа+ на Н+. Из мочи к клетки проксимальных отделов нефрона выделяется Nа+, взамен выводится Н+. Система не совершает электрическую работу, поэтому не надо тратить энергию. K-Na-насос сохраняет Nа+ в организме.
Визикулярный транспорт
происходит путем эндо- и экзоцитоза. Это вид транспорта, при котором вещества перекачиваются внутрь клетки или из нее внутри маленьких пузырьков или визикул. Жидкие вещества – пиноцитоз, твердые вещества – фагоцитоз. Когда переносятся гормоны или медиаторы, то вначале они взаимодействуют с мембранными рецепторами. Рецепторы обладают способностью к латеральной диффузии, при этом образование комплекса рецептора с лигандом вызывает перемещение этого комплекса в углубление мембраны.
Образуется окаймленная ямка. Внутренняя поверхность покрыта особым белком – клатрином, он связывает занятую лигандом молекулу рецептора, затем этот белок участвует в отшнуровывании визикулы от поверхности мембраны. Визикулы разрушаются, но некоторые проходят насквозь, и тогда вещества высвобождаются с другой стороны. Когда визикула разрушается внутри клетки – эндоцитоз, вне клетки – экзоцитоз. Мембранный материал вновь включается в клетку Þ круговорот.
Потенциал покоя
это разница потенциалов между цитоплазмой и внеклеточной средой, существующая в каждой живой клетке, находящейся в состоянии покоя. Внутриклеточная среда заряжена отрицательно. Величина ПП может быть различной, зависит от состояния клетки от –15 до –90 мВ у большинства клеток.
Для того, чтобы измерить величину ПП используется микроэлектродная техника. Используется специальный вид электродов, отличающийся намного меньшим диаметром кончика (доли мкм, или 1 мкм). Бывают стеклянные и металлические, по форме напоминают копье, необходим раствор электролита для хорошего проведения электрического тока.
Основные теории ПП:
1. В 1848 г. Дюбуа-Реймон "теория электромоторных молекул" (теория заряженных диполей). Дюбуа-Реймон предположил, что на мембране находятся диполи, ориентированные отрицательным зарядом внутрь. При возбуждении диполи поворачиваются на 1800, что приводит к положительному заряду внутри клетки. Разность потенциалов в этой теории является предшествующей.
2. В 60-е годы XIX в. – альтернативная теория Германа. В состоянии покоя мембрана клетки не заряжена, и ПП отсутствует. Однако при повреждении, в поврежденном участке появляется избыток отрицательного заряда, в силу наличия кислых продуктов. Поэтому между поврежденными и неповреждеными участками возникает электрический ток. Теория Германа исключала существование разности потенциалов на мембране.
3. Теория полупроницаемой мембраны Берштейна. 1906 г. Положения:
~ мембрана обладает свойством полупроницаемости (в специальных экспериментах в группе Пфейффера показали: при пропускании электрического тока – поляризация мембраны и появление концентрационной электро-двигательной силы.
~ наличие концентрационных градиентов на биологической мембране. В исходном состоянии К+, Сl–, Na+ и другие распределены различно на мембране. Берштейн обратил внимание на К+-концентрационный градиент по направлению из клетки наружу.
Существуют механические насосы. Перемещение из клетки через мембрану осуществляется по градиенту; но выход не бесконечен, как только К+ выйдет из клетки, образуются силы, противодействующие этому выходу. 1. Первый положительный заряд на мембране препятствует выходу остальных (электростатическое отталкивание). 2. Крупные молекулы, которые не могут проходить через мембрану, мембраны их не пропускают, они не будут пропускать К+ мембранный слой ионов К+ снаружи, слой анионов изнутри. При повреждении мембраны анионы выходят наружу и создается электрический ток.
Еm = RT/F * ln([K+]ant/[K+]in)
Еm – ПП, F- число Фарадея.
Эксперимент: кнаружи поверхности мембраны облицеров. соли К+ Þ выход ионов К+ из клетки затруднен Þ величина ПП?
Результат: ампликация солей К+ к наружной поверхности мембраны приводит к снижению величины ПП, степень снижения оказалась пропорциональной концентрации К+ в облицеров. растворе.
Вывод: К+ имеет основное значение в генерации ПП.
Если удалить Na+ или изменить его концентрацию во внеклеточной жидкости, это не толко не снизит величину ПП, но даже приведет к небольшой дополнительной поляризации мембраны Na+ не играет существенной роли в генерации ПП.
Прямые определения концентрации К+ в клетке и окружающей среде показали хорошее соотношение с теоретически рассчитанными значениями ПП. После Бернштейна данные подтверждались.
Джерард и Фурузава, 1930 г. Работали на нервах краба в условиях гипоксии и апоксии (полное отсутствие О2). ПП прогрессивно снижался и, наконец, исчез в нормальном целостном участке нерва.
Вывод: энергия, необходимая для генерации ПП берется из окислительных процессов.
Современная мембранная теория
Ходжкин и Хаксли разработали в 30х годах ХХ в., используя микроэлектродную технику на гигантских аксонах кальмара. ПП –50 мВ. При возбуждении генерации ПД амплитуда до 100 мВ.
С позиции теории Берштейна. При возбужедении растет проницаемость мембраны для всех ионов. При этом происходит перераспределение этих ионов в сторону выравнивания концентрации внутри и вне клетки, поэтому ПД = ПП (» –50 мВ) Þ кризис мембранной теории Берштейна.
Основные положения современной мембранной теории
1. Клеточные мембраны обладают избирательной проницаемостью не только к ионам состоянии К+, но и к Na+ и к другим.
2. Эти виды ионной проницаемости обнаруживают самостоятельную изменчивость в зависимости от функционального состояния клетки.
В мембране диэлектриком явлется липидная фаза (конденсатор), чтобы зарядить конденсатор до –75 мВ на 1 мм2 должно находиться 5000 пар ионов. В генерации ПП участвует К+, концентрация внутри клетки в 20 раз выше Þ концентрационный градиент для внутрь клетки (так как во внеклеточной среде концентрация ионов Na+ в 5-15 раз больше, концентрация Сl– вне клетки в 20-100 раз больше.
Чем больше проницаемость мембраны для иона, тем больше в клетку вносится данного иона.
Р К+ : Р Na+ : Р Сl– = 1 : 0,04 : 0,045
Уравнение Гольдмана:
Em = RT/F * ln (PК+*[К+]out+ PNa+*[Na+]out+ PCl–*[Cl–]out)/(PК+*[К+]in+ PNa+*[Na+]in+ PCl–*[Cl–]in)
Потенцил Действия
1. Объясняется поворотом диполя на 1800.
2. Теория альтерации Германа. При возбуждении возникает избыток кислых продуктов, которые несут отрицательны заряд, что приводит к разности потенциалов между возбужденным и невозбужденым учаском.
3. Мембранная теория Берштейна. В возбужденном участке мембраны резко увеличивается проницаемость для всех ионов, концентрации ионов смешиваются и участок становится электронейтральным.
4. Ходжкин и Хаксли. Рост проницаемости мембраны для ионов в месте воздействия. При возбуждении электропроницаемость мембраны увеличивается примерно в 500 раз. Max увеличивается проницаемость мембраны для Na+ (отсюда Na-теория ПД). Na+ свободно проходит внуть клетки. При возбужедении электро-химическое равновесие определяется потенциалом Na+. Равновесный потенциал для К+ = –97 мВ, для Na+ = +50 мВ. При возбужедении мембрана перезаряжается. Положение обратной активации и инактивации Na+-каналов, Na+-канал может активироваться (открываться) при определенных значениях потенциала. Причина активации Na+-каналов – деполяризация мембраны, чем больше деполяризация, тем больше проницаемость мембраны для Na+. Зависимость близка к линейной в подкор уровне; как только мембрана достигнет критического уровня деполяризации – зависимость нелинейная, лавинообразный вход Na+ в клетку.
1). Для объяснения реполяризации используется положение об инактивации Na+-каналов. При приближении потенциала мембраны к равновесному для Na+, Na+-каналы инактивируются и посупление Na в клетку прекращается. К графику: в основе регенеративный процесс (сам себя поддерживающий), развивающийся по принципу обратной связи.
2). Рост К+ проницаемости мембраны. Не столь значителен, как для Na+ ( в 5-15 и 500 раз соответственно). Проницаемость для К+ развивается медленнее, чем для Na+. Ионы К+ в этой ситуации будут выходить наружу и выносить заряд.
3). Механизм активного транспорта, представленный K-Na-насосом. 3 Na+ внутрь и 2 К+ наружу.
Эксперименты Ходжкина и Хаксли.
Гигантский аксон кальмара. Из внеклеточной среды были удалены 2/3 Na+. При этом амплитуда ПД снизилась » на 50%. Замена внутриклеточного Na+ на другие ионы приводит к некоторому росту ПД. Замена ½ внутриклеточного К+ на Na+ приводит к значительному снижению ПД.
Метод фиксации потенциала
метод Петч-Клемпинга. С его помощью можно зафиксировать на длительное время значение мембранного потенциала на любом желаемом уровне. Это делается с помощью внешнего генератора напряжения
Суммарные мембранные токи при ПД
1. Подпороговая область:
Слабое изменение мембранного потенциала, суммарный ионный ток направлен от клетки наружу, так как поток К+, выходящий из клетки, уже усиливается из-за удаления мембранного потенциала от равновесного потенциала для К+. Входящий ток Na+ еще слаб, так как рост Na+-проницаемости пока невелик. Однако с развитием деполяризации Na-ый поток постепенно нарастает.
2. Критический уровень деполяризации:
В этот момент суммарный ионный ток через мембрану равен нулю, так как встречные токи ионов Na+ и К+ уравновешивают друг друга. Даже небольшая дальнейшая деполяризация приводит к росту входа Na+-тока в сотни раз.
3. Во время фазы деполяризации резко увеличивается Na+-проницаемость и суммарный мембранный ток, направленный внутрь клетки. Выходящий К+-ток растет медленнее и становится заметным только к моменту пика потенциала.
4. Фаза реполяризации:
В момент пика потенциала большинство Na+-каналов инактивированны, а К+-ток max. Поэтому суммарный мембранный ток – выходящий.
Кальциевая теория активации и инактивации Na+-каналов
В состоянии покоя у наружного отверстия Na+-канала находится Са2+, который электростатически тормозит проникновение Na+ в канал. При возбуждении наружная поверхность мембраны заряжена отрицательно, при этом Са2+ уходят со своих мест, вход открывается и Na+ входит в клетки.
Инактивация: по ходу деполяризации узкие Na+-каналы могут закупориваться Na+. Во многих каналах есть воротные белки (могут менять свое местоположение под влиянием изменения потенциала). В состоянии покоя активационный белок закрыт, а инактивационный открыт. При возбуждении открывается активационный белок в момент закрывания инактивационного белка. В конце реполяризации белки так же закрываются и потом открываются (исходное состояние).
Передача возбуждения по нервным волокнам
В начале 30х годов ХХ в. Хилл. 1932 г. "Химическая волна проведения в нервах". Хилл использовал разные нервы, но преимущественно краба. Даже в состоянии покоя в единицу времени вырабатывается некоторое количество тепла. Это тепло было названо теплопродукция покоя. Когда в нервном волокне возбуждение – теплопродукция возбуждения (ТВ), она делится на 2 фазы:
1. Начальная ТВ, которая составляет 2-3% от всей ТВ и приходится непосредственно на период возбуждения.
2. Задержанная ТВ » 97% всей ТВ. Если подать серийный импульс на нерв краба, то задержанную ТВ можно зафиксировать в течение 25-30 минут. Возбуждения в тканях уже нет, но ТВ имеет место.
3. Утечка тепла при работе Na.
Хилл разрабтал чувствительную теплоэлектрическую методику, которая позволяла фиксировать теплообразование в течение 20 мс. Эксперименты при О0 С. Начальную фазу теплопродукции делили на 2 периода: позитивная и негативная начальная теплопродукция. При О0 С для нерва краба позитив в начальные 20 мс = 14 мк кал. В течение последующих 150 мс » 85% тепла поглощается нервной тканью обратно (12 мк кал).
Позитивная начальная теплопродукция: причина: химические процессы, обуславливающие изменение проницаемости мембраны. При возбуждении в клетку поступает Na+ и смешивается с К+ и наоборот. Должно образовываться тепло. Это тепло покрывает до 50% позитивной начальной теплопродукции.
Негативная начальная теплопродукция: химические реакции в этот период могут быть эндотермическими. Негативная теплопродукция не является обязательной.
Проведение возбуждения
В 1885 г. Герман предложил теорию малых токов. Осуществляется последовательно между участками волокна. В участке, соседнем с возбужденным будет наблюдаться выход электрического тока.
Кабельная теория нервного волокна: нервное волокно внутри содержит проводящую среду, оболочка невного волокна имеет слой, который плохо проводит возбуждение. Нервное волокно омывается внеклеточной жидкостью, которая проводит электрический ток.
Эквивалентная электрическая схема нервного волокна
В состоянии покоя внутриклеточная среда имеет избыточный отрицательный заряд. Сила тока меняется с расстоянием от возбужденного сегмента, декремента.
Факторы, определяющие скорость распространения возбуждения по нервному волокну
1. Пространственная константа определяет величину декремента деполяризации, l - пространственная константа.
2. Коэффициент надежности, соотношение между амплитудой ПД, критической энергией и ПП. S=ПД/(Екр–ПП), ПД=120мВ, ПП=–70мВ, Екр=–55мВ Þ S=8. Чем больше S, тем быстрее проведение.
3. Временная константа t мембр. При возбуждении мембраны меняется заряд. Длительность перезарядки мембраны. tмембр=Rm*Cm. Чем больше t мембр, тем ниже С. Vраспр=S*l/tмембр.
Механизм распространения возбуждения
Возбуждение охватывает последовательно все отделы нервного волокна. R наруж влияет на скорость распространения возбуждения. В экспериментрах Ходжкина изменили внеклеточную среду на масло, которое имеет большее сопротивление, объем снизился на 30-50%. Эксперимент: нерв помещается на параллельные пластинки из серебра, замыкают с помощью ртутной ванночки, объем проведеним растет на 16-30%. Была подтверждена теория местных токов для безмякотных волокон. В мякотных нерных волокнах механизм проведения другой. Миелин имеет рост сопротивления и снижение емкости, миелиновая оболочка прерывается перехватами Ранвье – сальтаторное проведение. R на 1 см2 поверхности в перехвате Ранвье = 10-20 Ом, в миелиновой оболочке = 0,003-0,005 Ом. Петли тока в миелиновых нервных волокнах выходят через невозбужденый перехват Ранвье, находящийся спереди от возбужденного . Эксперименты Тасаки.
1. Электроды стоят на миелине, два выходящих тока (это токи, выходящие из последующего и предыдущего перехвата Ранвье. Входящий ток не регистрируется.
2. Средний электрод на перехвате. Появляется входящий ток.