Окраска по Граму.
I этап - приготовление мазка.
Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки. Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в виде окружности диаметром 1-2 см. и кладут стекло на стол. Прокаленной петлёй наносят в середину кружка небольшую каплю стерильного изотонического раствора хлорида натрия (ИХН). Затем в эту каплю вносят небольшое количество культуры бактерий, тщательно эмульгируют и распределяют тонким слоем в пределах кружка. Мазки из бульонных культур готовят без предварительного нанесения ИХН.
2 этап - высушивание.
Стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги.
3 этап - фиксация.
Фиксацию проводят для того, чтобы убить микробы, прикрепить их к стеклу, повысить их восприимчивость к красителям. Для фиксации предметное стекло (мазком вверх) трижды накладывают на пламя горелки на 2-3 секунды с интервалом 4-6 секунд. Мазки из гноя, крови, мокроты, отечной жидкости фиксируют погружением в фиксирующие жидкости (ацетон, смесь Никифорова). Такая фиксация позволяет избежать грубых деформаций объекта исследования.
4 этап - окраска.
Различают простые и сложные (дифференцирующие) способы окраски. Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации и взаимном расположении клеток. Сложные способы позволяют установить структуру микробов и часто их неодинаковое отношение к красителям. Примером простых способов может служить окраска фуксином (1-2 минуты), метиленовым синим или кристалл-виолетом (3-5 минут), а сложных -окраска по Граму, Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену.
Дифференцирующий метод Грама.
После окраски этим методом одни бактерии, окрашиваются в темно-фиолетовый цвет (грамположительные, Гр+), другие - в бордово-красный (грамотрицательные, Гр-). Сущность этого способа окраски состоит в том, что Гр+ бактерии прочно фиксируют комплекс из генцианвиолета и йода, не обесцвечиваясь этанолом. Гр- бактерии после обесцвечивания докрашивают фуксином.
Гр+ бактерии кокки
Гр- бактерии кокки
стафилококки, стрептококки; палочки (спорообразующие): бациллы, клостридии; палочки (неспорообразующие): коринебактерии, микобактерии, актиномицеты
нейссерии, вейллонеллы; палочки (неспорообразующие): энтеробактерии, вибрионы;
извитые:
спириллы, спирохеты, кампилобактерии.
Схема окраски бактерий по Граму:
Гр+бактерии
Гр-бактерии
1. фиолетовый цвет
1. фиолетовый цвет
1.Генцианвиолет (2 минуты)
2. фиолетовый цвет
2. фиолетовый цвет
2.Р-р Люголя (1 мин.); закрепляет окраску.
3. фиолетовый цвет
3. обесцвечивание
3.Этанол+йод (30 сек.); избирательное обесцвечивание Гр-бактерий.
промывание водой
4. фиолетовый цвет
4. бордовый цвет
4.Фуксин (1 мин.); докрашивание Гр-бактерий.
промывание водой
После высушивания мазки готовы для микроскопии.
Основные формы бактерий
Шаровидные
Палочковидные
Извитые
микрококки (одиночные)
диплококки (пары)
стрептококки (цепочки)
тетракокки (4 клетки)
сарцины (тюки, пакеты)
стафилококки (гроздья)
собственно бактерии
спорообразующие
(бациллы, клостридии)
изогнутые палочки (вибрионы)
спириллы
спирохеты
кампилобактеры