Глубинная ферментация лимонной кислоты

Изм.
Лист
№ докум.
Подпись
Дата
Лист
3 ВВЕДЕНИЕ
Лимонная кислота является основным подкислителем. Ее доля составляет около 75% объема всехпроизводимых подкис лит елей. Особенно широко она используется в производствебезалкоголь­ных напитков, которым придает фруктовые и ягодные запахи и вкус.
Расширяется сфера применения лимонной кислоты втехничес­ких целях — в химической, текстильной, кожевенной,металлурги­ческой и других отраслях промышленности. Спрос на лимонную кислотунепрерывно растет, но в бывших социалистических стра­нах он удовлетворяетсякрайне слабо, поэтому в настоящее время организуются новые производственныемощности по выпуску этого ценного продукта.
Лимонную кислоту производят главным образом путеммик­робного синтеза, который является важной отраслью биотехно­логии. Настоящийотчет посвящен микроорганизмам—продуцен­там лимонной кислоты и современнымдостижениям биотехнологии в области биосинтеза органических кислот. Описанытеоретичес­кие основы микробного синтеза и механизмы регуляции метабо­лизмаорганических кислот, их связь с общей физиологией мик­робных клеток. В работеотражен многолетний опыт авторов в промышленном биосинтезе органических кислот.Описываются способы утилизации отходов производства лимонной кислоты с цельюполучения ценных кормовых продуктов.
Лимоннаякислота НООС-СН2С(ОН) -СООН-СН2-СООН яв­ляется моноокситрикарбоновой кислотой, кристаллизующейся из водныхрастворов с одной молекулой воды (моногидрат лимонной кислоты) в видебесцветных прозрачных ромбообразных кристал­лов .Моногидратнаялимонная кислота имеет молекуляр­ную массу 210, плотность 1,540 г/см3и температуру плавления 70—75 СС. Кристаллизационная вода теряетсяпри хранении и ин­тенсивно выделяется при температурах, превышающих 40—50 °С.При 100 °С вода теряется полностью.
Притемпературе кристаллизации 36,6 °С и выше выделяется безводная лимонная кислотас молекулярной массой 192 и темпе­ратурой плавления 153 °С. При нагревании до175 °С лимонная кислота разлагается.
Лимоннаякислота хорошо растворяется в воде (1460 г/л при 20 °С) и умеренно — в этаноле(620 г/л при 25 °С).
          СН2СООН
    |
НО—С—СООН
          I
          СНзСООН
Солилимонной кислоты — цитраты — имеют низкую водораство-римость.
Лимоннаякислота широко распространена в природе. Особенно много ее в незрелых фруктах иягодах (лимоны, клюква, яблоки, виноград, брусника и др.),

Изм.
Лист
№ докум.
Подпись
Дата
Лист
4 где лимонная кислота является естест­веннымконсервирующим агентом.
Продуценты лимонной кислоты
Послепервых публикаций К.Вемера о способностях микромицетов синтезировать органические кислоты, в том числелимонную, многие микробиологи стали тщательно изучать физиологию грибов и ихбиосинтетические способности. Многочисленные проверки по­казали явно выраженныйпотенциал сверхсинтеза лимонной кис­лоты у целогоряда микромицетов, дрожжевых грибов и бактерий. Взависимости от химической природы окисляемого субстрата (свекловичная,тростниковая, цитрусовая или финиковая меласса, сок сахарного тростника,гидрол, гидролизаты крахмала, багасса,сахароза, глюкоза, парафины и много других субстратов) в ка­честве продуцентовлимонной кислоты в более или менее широких масштабах используют микромицеты, принадлежащие к родам Aspergillus, Penicillium, Trichodermaи Botrytis, дрожжевыегрибы родов Candida, DelaromycesиTorulopsis, а такжебактерии родов Arthrobacterium, PseudomonasиMicrococcus.
Детальноизучены многочисленные представители аспергиллов, особенно Aspergillusawamori, A.aureus, A.clavatus, A.glaucus, A.ni­ger.
Самымшироко распространенным продуцентом лимонной кис­лоты является микромицет Aspergillusniger, физиология и меха­низм биосинтеза лимонной кислотыкоторого наиболее изучены.

Внастоящее время для биосинтеза лимонной кислоты в ка­честве основного сырьяшироко используют мелассу — отходы сахароперерабатывающейпромышленности. В зависимости от исход­ного материала различают свекловичную,тростниковую, цитрусо­вую и другие виды мелассы. На международном рынкеежегодна продается 30—35 млн. т этого сырья. В России ежегодный объемпроизводства мелассы составляет 3 млн. т. Хотя меласса в основ­ном используетсядля кормовых целей, ее широко применяют также в микробиологическойпромышленности.
Свекловичнаямеласса характеризуется высоким содержанием 'Сахаров (46—55%), из которыхпреобладает сахароза. Меласса имеет сложный и непостоянный химический состав. Онасодержит коллоиды, органические кислоты, витамины, белки и свободные.аминокислоты, сложный спектр минеральных веществ (табл. 4.8— 4.10). Изнелетучих органических кислот в мелассе могут при­сутствовать, %: лимонная —0,01—0,5; глюконовая — 0,5—1,0; яблочная — 0,1—0,5;янтарная — 0,1—0,7.
Хорошосбраживаемая меласса должна содержать не более 1% инвертного сахара и не более  1%  СаО и 0,06,% сернистого газа(добавляемого в мелассу в качествеконсервирующего агента) при общем содержании сухих веществ не менее 75% иСахаров не менее 46,%   приневысоком  содержании живыхмикроорганизмов.
Взоле свекловичной мелассы много калия, магния, железа, но относительно малофосфора.
Химическийсостав мелассы зависит от климатических и поч­венных условий

Изм.
Лист
№ докум.
Подпись
Дата
Лист
5 выращивания сахарной свеклы, применяемых ми­неральныхудобрений, времени уборки урожая (поздние сроки уборки отрицательно влияют накачество мелассы), технологичес­ких нюансов переработки сахарной свеклы,условий транспорти­ровки и хранения мелассы.
Производствомелассы связано с сезонными доставками сырья. В производстве лимонной кислотынаилучшие результаты дает зрелая, выдержанная меласса. Важное значение имеютдлитель­ность хранения мелассы и наличие герметически закрытых ем­костей — мелассохранилищ с пневматическим перемешиванием (дляпредотвращения расслоения), насосами, устройствами для подачи и забора мелассыиз разных горизонтальных хранилищ.
Впоследнее десятилетие качество мелассы ухудшается под влиянием рядадополнительных факторов, связанных с техничес­ким прогрессом. Широкоприменяемые в сельском хозяйстве ядохимикаты и минеральные удобрения могутоставлять опреде­ленные отрицательные следы в сельскохозяйственной продукции, вчастности в мелассе, где обнаружены инсектициды, например фосфорорганический инсектицидмалатилон (до 90 мг в 1 кг ме­лассы), оказывающийингибирующее влияние на биосинтез лимон­ной кислоты .
Вмелассе установлено присутствие некоторых фунгицидов (трилон,мертрилан и др.). Данные о влиянии фунгицидов набиосинтез лимонной кислоты неоднозначны. Некоторые авторы ут­верждают, что рядфунгицидов подавляет активность ферментов изоцитрат — и сукцинатдегидрогеназы и тем самым способствуетбиосинтезу лимонной кислоты, во всяком случае у дикорастующихкультур Aspergillusniger.По данным других авторов, фунги­циды отрицательно влияют на ацидогенез.
Обнаруженоугнетение синтеза белка в клетках Aspergillusnigerпод действиемртутьорганического фунгицида мертрилана. В результатеего воздействия на ферменты ЦТК (в частности на малат-,изоцитрат — и сукцинатдегидрогеназы)резко понижаются интенсивность дыхания клеток и активность терминальных оксидо-редуктаз, особенно цитохромоксидазы.Фунгицид трилан (4,5,6-трихлорбензоксазолидон) такжеотрицательно влияет на метабо­лизм микромицета Aspergillusniger, помеханизм его воздействия другой .
Всеисследованные  фунгициды  подавляют интенсивность  дыхания, тормозятсинтез белка, нарушают проницаемость цитоплазматических мембран .
    В   мелассе  нередко обнаруживается  присутствие детергентов.Ихвлияние на микроорганизмы изучено слабо. Установлено изменение проницаемостиклеточной мембраны Aspergillusnigerи как следствие   —  повышенная  гидроксилазная   активность  культуры.
Способ культивирования
    Успехи глубинной ферментации в производствеантибиотиков побудили производителей лимонной кислоты искать пути глубин­ногокультивирования ее продуцентов. В СССР первой глубинное культивированиепродуцентов лимонной кислоты освоила группа исследователей под руководством Г.И. Журавского в 50-е гг., при­меняя синтетические сахарозные среды и специально

Изм.
Лист
№ докум.
Подпись
Дата
Лист
6 селекциони­рованныйдля глубинного культивирования штамм Aspergillusni­ger{. В качестве сырья дляглубинной ферментации лимонной кислоты может быть использован широкий наборприродных суб­стратов: меласса, глюкоза, сахароза, жидкие парафины и другиеисточники углерода .
Технологияглубинного культивирования продуцентов лимонной кислоты представляет собой явновыраженный двухступенчатый процесс. Первая ступень включает выращиваниепосевного мате­риала из конидиоспор в посевной среде(на качалке и в посевном аппарате) при 32—33 °С в условиях хорошей аэрации(0,8—1,0 объ­ема воздуха на 1 объем среды в минуту) и при непрерывном пе­ремешиваниисреды. Продолжительность культивирования на ста­дии выращивания посевногоматериала — 2 сут (1 сут —на ка­чалке, 1 — на посевном аппарате).
Сказанноепринципиально не исключает непосредственного применения конидиоспорв качестве посевного материала для ос-
новнойферментации, однако это существенно удлиняет цикл фер­ментации: с 7—8 до 12—13 сут .
Основнуюферментацию в глубинных условиях осуществляют в производственном биореакторе при коэффициенте его заполнения 0,75—0,80 иколичестве посевного материала 5—8% от объема ферментируемой среды. Начальнаяконцентрация Сахаров — 10— 14%, часто применяют подкормку свежей средой,особенно в слу­чаях применения мелассных сред.Регуляции рН среды не требуется, но посколькулимонная кислота очень коррозионна и дляферментационного оборудования необходима устойчивая к кор­розии сталь, то длясмягчения коррозионное практикуют подщелачивание ферментируемого субстрата до рН 3,8—4,2.
Процессферментации имеет черты двух фаз, или стадий: фор­мирования биомассы икислотообразования.      
Дляфазы роста биомассы характерно объединение молодого мицелия в шарообразныеагломераты, формирование которых про­должается до 70—80 ч ферментации.Некоторая часть гиф остается в свободном виде.
Вовремя интенсивного роста потребность продуцента в моле­кулярном кислородесоставляет до 1 кг па каждый кубометр фер­ментируемого субстрата в час. В фазебиосинтеза лимонной кислоты потребность в кислороде в некоторой степениснижается и состав­ляет 0,5—0,6 кг 02/м3-ч. Для обеспечениямассопередачи кисло­рода в ферментируемый субстратвводится стерильный воздух в количестве 0,8—1,0 объема на 1 объем среды вминуту, одновре­менно с помощью мешалки создается циркуляция среды со ско­ростью,соответствующей 1,2—1,5 м/с вдоль стенки ферментатора.Насыщение среды кислородом в начальной фазе ферментации должно составлять20—25,% от полного насыщения, в фазе био­синтеза лимонной кислоты — 10—15,%.Для обеспечения массооб-меиа молекулярного кислороданеобходим расход электроэнергии в количестве 1,8—2,2 кВт на 1 м3среды.
Температурныережимы в ферментируемом субстрате дифферен­цированы: в фазе роста биомассы —32—33 °С, в фазе кислотообра­зования — 30—31 °С.

Изм.
Лист
№ докум.
Подпись
Дата
Лист
7 В зависимости от особенностей используемого мутанта Asper­gillusnigerприменяют разные варианты технологических режимовглубинной технологии.
1. ХАРАКТЕРИСТИКА КОНЕЧНОЙ ПРОДУКЦИИ ПРОЕКТИРУЕМОГО ПРОИЗВОДСТВА
1.Техническое наименованиепродукта – лимонная кислота (чистота 99,9%).
2. Лимонная кислота будет выпускаться в соответствии стребованиями      ГОСТ 908—79.
3.Лимонную кислоту получаютиз культуральной жидкости при глубинномкультивировании микроскопического гриба Aspergillusnigerспоследующим отделением биомассы.
Химические показатели лимонной кислоты
Нормы для сортов
Показатели
экстра
высший
первый
Массовая   доля   лимонной   кислоты   в
пересчете на моногидрат, %
не менее
99,5
99,5               99,5
не более
101,0
Не нормируется
Цвет,   единицы   показателя   цветности
4
6                    10
раствора йодной шкалы, не более
Массовая доля, %, не более
золы
0,07
0,10                0,35
свободной серной кислоты
0,01
0,01                 0,03
мышьяка
0,00007
0,00007           0,00007
Проба
на свинец, медь,   цинк,   олово  с се-
Выдерживает анализ
роводородом
на оксалаты с ацетатом кальция
То же
на барий с серной кислотой
»
на ферроцианиды с хлорным железом
Выдерживает
 »
анализ
Не нормируется
на сульфаты с хлоридом бария
Массовая  доля  сульфатной  золы,   %,
0,1
То же
не более
Проба   на   легкообугливающиеся    ве-
Выдерживает ана
лиз                 »
ществас серной кислотой
Проба на  железо  с   1,10-фенантроли-
То же
»
яом

Изм.
Лист
№ докум.
Подпись
Дата
Лист
8
Лимоннаякислота по качеству должна соответ­ствовать показателям, предусмотренным ГОСТ908—79. Это должны быть бесцветные кристаллы или белый порошок, без«комков, для кислоты Iсортадопускается желтоватый оттенок, вкус кислый, без постороннего привкуса, 2%-ныйраствор кислотыв дистиллированной воде должен не иметьзапаха, быть прозрач­ным и не содержать механических примесей, структура —сыпу­чая,сухая, наощупь не липкая, без посторонних примесей.
Зарубежом лимонную кислоту классифицируют по величине кристаллов на ситовыхаппаратах. Большое внимание обращают на легкообугливающиесявещества, дающие окраску при нагрева­нии в течение определенного времени сконцентрированной серной кислотой при температуре 90 °С. Они вызываются следамиорга­нических соединений — сахара, оксиметилфурфурола,других аль­дегидов и спиртов, за исключением цис — и трансаконитовой, изолимонной, щавелевой, янтарной иолеиновой кислот, эритрита, ксилита и сорбита [93].
Дляудаления легкообугливающихся веществ предложено многоспособов: выделение цитрата кальция в присутствии 10 % пероксидаводорода к коли­честву лимонной кислоты; нагревание до кипения растворовлимонной кислоты после отделения гипса в сочетании с обработкой пероксидом водорода; добавле­ние к раствору лимоннойкислоты перед кристаллизацией борной кислоты в количестве 0,1—0,3 % по массераствора, экстракция фреоном и др.
^Наиболееэффективным способом очистки кристаллов лимон­ной кислоты от'всехпримесей является перекристаллизация. Ли­монная кислота сорта экстра по всемпоказателям и нормам соответствует данным Британской фармакопеи 1968 г.
Лимоннаякислота выпускается только в упакованном виде: реализуемая через розничную сеть—в мелкой фасовке массой нетто 10—100 г; предназначенная для предприятийпищевой и других отраслей промышленности — в крупной фасовке массой нетто 10—40кг. При фасовке допускаются отклонения по массе нетто, не превышающие при масседо 50 г ±4 %, от 50 до ПО г +3 %. При упаковке кислоты в ящики и мешкидопускаются отклонения, не превышающие ±0,5 %.
Мелкаяфасовка должна проводиться в пакеты из «пищевой» нестабилизи-рованнойполиэтиленовой пленки марки Н, толщиной не менее 0,08 мм; из эти-кетировочной бумаги односторонней гладкости,ламинированной с внутренней стороны полиэтиленом высокого давления или пачки избумаги марки Е по ГОСТ 7247—73 с внутренним вкладышем из подпергаментамарки П-3. Паке­ты и пачки оформляют красочными рисунками и надписями (товарныйзнак или «аименование предприятия-изготовителя и егоподчиненность, наименование про­дукции и ее сорта, дата выработки, масса нетто,цена, обозначение настоящего стандарта). Пакеты и пачки с кислотой должныупаковываться в ящики из гофрированного картона № 13 массой нетто не более 10кг.


Изм.
Лист
№ докум.
Подпись
Дата
Лист
9 Крупная фасовка проводится в льно-джуто-кенафныетканевые мешки или льняные продуктовые массой нетто не более 40 кг, в ящики изгофриро­ванного картона. Внутрь мешков или ящиков должны вставляться мешки-вкла­дышииз полиэтиленовой пленки, которые после заполнения кислотой гермети­ческизакрывают путем сварки. Допускается завязка увязочнымшпагатом из лубяных волокон. Верхние швы тканевых наружных мешков зашиваютмашин­ным способом льняными нитками или вручную — увязочнымшпагатом из лубя­ных волокон.
Привнутригородских перевозках допускается упаковка кислоты в бумаж­ныенепропитанные открытые трехслойные мешки с внутренним мешком-вкла­дышем изполиэтиленовой пленки массой нетто не более 25 кг; в ящики из гоф­рированногокартона, выстланные подпергаментом марки П-3,полностью по­крывающим всю внутреннюю поверхность тары.
Транспортнуютару маркируют с нанесением манипуляционного знака «Бо­ится сырости».
Наряде заводов крупная фасовка лимонной кислоты механизирована: ус­тановлены полуавтоматическиевесы, зашивочные машины и транспортное обо­рудование.
ФирмаAmericanAssociationofCerealChemistInc. выпускаетлимонную кислоту в капсулах, которые защищают другие ингредиенты пищи откислоты. Капсулы изготовляют трех типов: из частично гидрогенизированногораститель­ного масла, мальтодекстрина и эмульгатора.Первый тип разрушается пои тем­пературе плавления оболочки, второй — прирастворении в воде, третий — при нагревании в воде.
Преимуществомтакой формы упаковки лимонной (и Других пищевых кис­лот) являетсяконтролируемая скорость освобождения кислоты из капсулы, равномерноераспределение кислоты по всему объему без образования комков Пищевые кислоты вкапсулах применяют в кулинарии — для увеличения срока хранения пудингов иначинок для пирогов, предотвращая реакцию между кис­лотой и крахмалом во времяхранения, для увеличения срока хранения теста и т. д.
Лимоннаякислота в крупной фасовке должна храниться в за­крытом помещении на деревянныхстеллажах или поддонах при относительной влажности воздуха не выше 70 %.Гарантийный срок хранения лимонной кислоты — 6 мес содня изготовления; при упаковке в ящики из гофрированного картона с внутреннимвкладышем из подпергамента — 3 мес.
Дляхранения кристаллической кислоты большое значение имеет гигроскопичность. Подгигроскопичностью понимают свой­ство веществ поглощать водяные пары из воздуханезависимо от характера связывания ими влаги.

Изм.
Лист
№ докум.
Подпись
Дата
Лист
 11 3.Аппаратурная схема производства и экспликация


Изм.
Лист
№ докум.
Подпись
Дата
Лист
12
Наименование
Количество единиц
Материал рабочей зоны, способ защиты
Техническая характеристика
1
М
ПМ
РС
ПР
СК
ВД
ТО
СП
ПА
Ф
ИВФ
СБ
БВФ
СБФ
2
Хранилищемелассы
Промежуточная емкость для мелассы
Реактор — смеситель
Промежуточная ёмкость
Стерилизационная колонка
Выдерживатель
Теплообменник
Сборник питательной среды
Посевной аппарат
Ферментёр
Индивидуальный воздушный фильтр
Сборник культуральной жидкости
Барабанный вакуум-фильтр
Сборник фильтрата
3
1
1
1
1
1
1
1
2
7
            9
             2
              1
              2
4
5
V=32 м, 31,5 об/мин,H=8300,D=3200mm.
32 м3
«Труба в трубе»
5м3, Н=3800мм, Д=2000мм,180 об/мин
50 м3, Н=10900, Д=4000мм, рубашка и змеевик.
ДК-1.4, 0.058м3/с
25м3, Н=3800; Д=3000мм
S=3м2, 2420х2550х2200
25м3, Н=3500; Д=3000м
4. Изложение технологического процессапроизводства
4.1 Характеристика сырья и материалов
1.   Меласса в коцентрации 5% по сахару – используется для ферментации ипосевной среды
2.   NH4Cl   концентрация1%  — используется для ферментации ипосевной среды
3.   КН2РО4  конц. 1% — используется для фе