СОДЕРЖАНИЕ: стр. Введение……………………………………………………………………...……...2 Основные виды хроматографии………………………………………….... ……3 Теоретические основы и термины хроматографии……………………. ……. 5 Сорбенты хроматографического анализа…………………………………. …. 7 Сорбенты гель-фильтрации………………………………………………. ……8 Растворители…………………………………………………………………….... 9 Препаративная жидкостная хроматография…………………………….... …11
Изменение формы пика с увеличением нагрузки………………………….... 13 Масштабирование разделения………………………………………………......14 Препаративная гель-фильтрация……………………………………………...15
Оптимизация препаративной гель-фильтрации…………………………....... 16 Клещевой энцефалит……………………………………………………………. 17 Практическая часть……………………………………………………………...19 ВВЕДЕНИЕ.
Метод хроматографического разделения возник в начале прошлого века, после опубликования работ русского учёного Цвета, который обнаружил разную сорбируемость пигментов хлорофилла на оксиде алюминия, и как следствие разную скорость продвижения по колонке, заполненной им. Изначально метод позволял анализировать только окрашенные вещества, что и дало название методу. В настоящее время этот метод используют не только для анализа веществ, имеющих окраску. Благодаря оснащению колонок специальными регистрирующими устройствами можно подвергать анализу и разделению самые разные вещества и классы соединений. Кроме того возможность разделять вещества очень близкого строения, природные соединения, белки, нуклеиновые кислоты, и даже некоторые биологические объекты -, делают этот метод очень применимым и зачастую единственным в настоящее время. Особенно это касается белков и нуклеиновых кислот–их разделение хроматографическим методом очень точно позволяет выделять и анализировать белки очень сложного строения. Выше перечисленные факты делают хроматографию очень популярной в научно—исследовательских биологических лабораториях, при получении и выделении новых белковых препаратов: - сывороток и вакцин. Современная модификация метода—высокоэффективная жидкостная хроматография , позволяет провести анализ, идентификацию и разделение очень малых количеств веществ ( ~0. 000001 г. ) за очень короткое время–15—20 минут.
Следует также сказать , что современные хроматографы оснащены компьютерами, что позволяет ускорить анализ веществ (за счет создания библиотеки веществ в памяти), сделать анализ более достоверным и точным, а также простым в выполнении Перечисленные факты делают метод хроматографического анализа одним из самых применимых в современных экспертных лабораториях, так как метод позволяет быстро и качественно разделить и проанализировать смеси близких по свойствам веществ, в частности лекарственных препаратов, веществ природного происхождения. Наша работа посвящена препаративному хроматографическому разделению веществ, но чтобы разработать наиболее выгодные условия для хроматографического разделения веществ нужно сперва подобрать оптимальные условия для мелкомасштабных , аналитических разделений, затем провести масштабирование и перейти к препаративному разделению. Вообще, препаративная хроматография возникла сравнительно недавно (1940-годы), появление её было обусловлено необходимость разделения веществ, которые нельзя было разделить обычными способами, так чтобы они сохранили свои первоначальные свойства( выделение белков, нуклеиновых кислот, различных лекарственных веществ природного происхождения). Также нужно добавить , что наряду с эффективностью и практически универсальностью разделения у препаративной хроматографии есть ещё и ряд недостатков: - прежде всего это сравнительно высокая стоимость разделения , а также ещё и то что трудно предсказать возможность разделения веществ на данной хроматографической колонке в данных условиях , то есть необходимо проводить ряд опытов в более мелких масштабах для установления условий разделения , это и есть оптимизация. ВИДЫ ХРОМАТОГОРАФИИ.
Целью нашей работы является оптимизация условий очистки вакцины против вируса клещевого энцефалита . Рассмотрим основные виды хроматографии, которые могут применяться для этих целей
Важнейшим вариантом жидкостной хроматографии является ионнообменная хроматография Этот метод позволяет проводить разделение не только в аналитических целях, но и разделять вещества в более крупных масштабах, например при промышленном разделении веществ. Особенностью метода является то, что сорбент(ионнообменник) способен ионизироваться, отдавая подвижные ионы (H, Na) в подвижную фазу, при этом сам ионнообменник приобретает заряд. В случае отрицательного заряда матрицы говорят об катионо-обменнике, в случае положительного об анионообменнике. Катионо- и анионо-обменники бывают сильными и слабыми. Сильные ионизированы во всем интервале pH , а слабые лишь в определенном интервале, зависящим от свойств конкретного ионобменника, точнее от природы ионогенных групп ионнообенника. Ионизацией слабых ионообменников можно управлять, меняя pH среды, что имеет большое значение в процессе разделения. Ионообменники представляют собой полимеры, модифицированные введением ионогенных групп. В случае катионообменников это–SO3 -, -COO--, -CH2-SO3--, с соответствующими противоинами. К анионообмееным группам относят тетраалкиламмониевые группы с положительным зарядом. Особенностью ионообменной хроматографии является то , что она позволяет отделять и разделять заряженные частицы. Разделение основано на электростатическом взаимодействии ионов подвижной фазы с неподвижными ионогенными группами ионообменника. К органическим веществам, способных образовывать ионы в растворе относят соединения четырех валентного азота, трех валентного кислорода, аминокислоты, белки, карбоновые кислоты. Из обилия перечисленных веществ видно как важен метод. Как уже было отмечено в основе разделения веществ лежит электростатическое взаимодействие ионов подвижной фазы и ионов матрицы. Однако это взаимодействие обратимо, на самом деле устанавливается равновесие между ионогенной группой, соединенной с органическим ионом и ионогенной группой, соединенной с неорганическим противоионом (H+ , Cl-, OH-, Na+). Очевидно , что чем больше неорганических ионов , тем слабее будут связаны разделяемые вещества. Поэтому растворы неорганических солей можно использовать в качестве элюентов. Важной характеристикой ионнообменника явяется его кривая титрования , она позволяет сделать вывод о силе ионообменника. Для разеления , например аминокислот также необходимо знать их кривые титрования, т. е. в какой области pH аминокислота находиться в форме аниона, а в какой в форме аниона. Сопоставляя кривые титрования аминокислот и ионообменника можно сделать вывод о возможности разделения данных аминокислот на данном ионообменнике при определенном значении pH.
Однако не только электростатическое взаимодействие влияет на разделение веществ, немаловажны и стерические факторы--такие как величина пор ионообменника, расстояние между соседними ионогенными группами. Особое значение это имеет при разделенни макромолекул, например белков, в данном случае электростатическое взаимодействие может лимитироваться стерическими факторами и диффузией макромолекул к ионогенным группам. Немаловажно в связи с этим отметить влияние структуры белка (первичная вторичная и т. д. ) очевидно, что скорость диффузии будет для них неодинакова, -молекула в виде глобулы будет легче передвигаться, чем разветвленная молекула. Особенностью макромолекул является и то , что они могут нести несколько одноименных зарядов, в этом случае возможно взаимодействие одной молекудлы с несколькими ионогенными группами(как правило двумя), интересно отметить, что прочность связи при этом увеличивается более, чем вдвое. Это объясняется тем, что одна связь как бы страхует другую. -при разрыве одной связи молекула колеблется около положения равновесия, ясно , что в этом случае ей легче возобновить вторую связь. Однако возможность такой двое связанности скорее негативно влияет на процесс разделения, так как крепко закрепившиеся молекулы очень трудно отделить от ионообменника приходиться применять концентрированные растворы солей, что может нарушить структуру белка , что ведет к его денатурации, также резко снижается разделительная способность колонки. Также следует отметить , что при подобной сорбции белковая молекула может деформироваться под структуру матрицы , что также может вести к денатурации. Таким образом применительно к очистке белковых веществ можно сказать, что метод позволит отделить некоторые незаряженные молекулы от белковых молекул, которые как правило заряжены, а также можно провести разделение и от посторонних белков, только нужно знать кривые титрования белков и кривую титрования ионообменника.
Важным видом хроматографии является гель-фильтрация. Она позволяет разделять молекулы в зависимости от их молекулярных масс. Разделение в этом методе основано на различной скорости диффузии молекул с разной молекулярной массой (различными размерами). Сорбентом в данном методе служит гель , точнее мелкие частицы, внутри пронизанные нитями (фибриллами). Диффузия внутрь этих частиц лимитируется размерами , а точнее подвижностью молекул которая зависит от их молекулярной массы. Чем меньше молекулы, тем легче они способны проникать вовнутрь гранул геля, соответственно более тяжелые частицы практически не проникают в гранулы, так как менее подвижны. Частицы попавшие внутрь гранул под действием диффузии движутся внутри и с равной вероятностью могут выйти наружу, но пространство внутри гранул геля пронизано нитями и молекулы претерпевают многочисленные столкновения с сетью фибрилл и способны надолго задерживаться внутри гранул. Таким образом мы видим , что более легкие молекулы способны надолго задерживаться внутри гранул, и их скорость продвижения будет меньше скорости движения более тяжелых молекул.
Описанный метод очень эффективен для разделения белков и других высоко-молекулярных соединений. Варьируя характеристики частиц геля , - такие как размер пор на поверхности гранул, характеристики внутреннего строения гранул , - можно добиться разделения определенных веществ, т. е. того, что вещества с определенной молекулярной массой будут проходить , остальные продвигаться с меньшей скоростью, особенно это важно при разделении белков на фракции по их молекулярным массам, а также при фракционировании полимеров по их молекулярным массам , для анализа качества образца, нахождения его молекулярно-массового распределения. Применительно к нашей теме следует сказать, что гель-фильтрация как нельзя лучше подходит для отделения белковой части вакцины от низкомолекулярных веществ, обессаливания препарата, и в некоторых случаев к концентрированию.
Одним из интереснейших методов жидкостной хроматографии является аффинная хроматография. Она позволяет разделять отдельные ферменты , белки и даже вирусы и простейшие биологические объекты . Особенностью данного вида хроматографии является то , что разделение основано на разного вида специфических взаимодействиях частиц подвижной фазы с сорбентом. Сорбентом в данном виде хроматографии служит гель типа агарозы к которому ковалентно привязаны подходящие лиганды , им может быть субстрат какого-либо фермента , Когда через такой сорбент пропускают подвижную фазу , то из нее будет сорбироваться только соответствующий фермент, он будет прочно связан с сорбентом, но его оттуда можно смыть избытком растворителя, или можно использовать закрепленный фермент, для непрерывного превращения молекул субстрата из подвижной фазы При модификации сорбента соответствующими антителами можно удерживать заданные вирусы , при модификации антигеном удерживать ген. Очевидно , что метод аффинной хроматографии очень высокоэффективен из-за селективности специфических взаимодействий и очень перспективен , так как позволяет концентрировать биологические объекты , которые важны при производстве вакцин и сывороток. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ ХРОМАТОГРАФИИ.
Основная кинетическая характеристика процесса –высота, эквивалентная теоретической тарелке (В. Э. Т. Т)-H. Она соответствует слою сорбента (высоте слоя) при прохождении через который акт сорбции-десорбции успевает совершиться в среднем один раз. H отражает качество сорбента , качество заполнения колонки и правильность выбора режима хроматографирования. Зачастую удобнее использовать не Н , а число теоретических тарелок в колонке –N=L/H, где L-длина колонки. N служит мерой эффективности колонки , ее рассчитывают как функцию времени удерживания и ширины пика на хромотограмме: N = 5. 54*(tR/W0. 5)2 = 16*(tR/WS)2 = 4*(tR/W2S)2 , где WS -- ширина пика у основания. W0. 5 –ширина пика на половине его высоты W2S – ширина пика на 0. 607 его высоты.
До сих пор мы лишь обсуждали методы хроматографии , обратимся теперь к некоторым теоретическим основам метода. Прежде всего нужно сказать , что аналитическим сигналом в хроматографическом анализехроматограмма. Она представляет собой кривую зависимости концентрации, выходящих с потоком подвижной фазы из колонки , от времени с начала разделения. Однако , следует заметить, что в детекторах , используемых в хроматографии редко измеряется непосредственно концентрация , а часто это пропорциональная ей величина(коэффициент преломления, поглощения, и т. п. ) . Хроматограмма состоит из базовой линии и пиков . Базовая линиясоответствует тем моментам времени , когда из колонки вытекает чистый растворитель; пик соответствует появлению одного из разделяемых веществ в вытекающем растворителе. В идеале форма пика стремится к кривой Гауссовского распределения. Время появления максимума пика называется временем удерживания –tR... При постоянных условиях работы и составе фаз tRявляется индивидуальным для каждого вещества. Иногда в начальной части хроматограммы появляется маленький пик , он соответствует времени удерживания несорбированного вещества t0и свободный объем системы. Своим появлением этот пик обязан кратковременному нарушению равновесия в колонке при вводе пробы .
Свободный объем системы (V0C) –объем подвижной фазы от устройства для ввода до детектора. Часть его находится внутри колонки (Vm)-свободный объем колонки. В идеале свободный объем системы не должен превышать свободный объем , в этом случае t0 в первом приближении соответствует свободному объему колонки. Также важен объем объём неподвижной фазы– VS . Отношение VS к Vm – фазовое отношение колонки. Фазовое отношение позволяет связать хроматографический процесс с термодинамическими характеристиками системы. Если F- скорость подачи подвижной фазы в колонку (в первом приближении не влияет на распределение) ; удерживаемый объем выражают как : VR=tR*F. VR- постоянная величина для данного вещества на колонке данных размеров , но на колонке с другими геометрическими характеристиками VR будет другим , однако пропорционально ему меняется и t0, и чтобы избавиться от зависимости от параметров системы вводят величину k` коэффициент емкости
k`=(tR-t0)/t0. k` является величиной связанной с термодинамическими характеристиками сорбции --DG сорбции. Так как в выражение для к` входит фазовое отношение, которое в свою очередь зависит от объема сорбента , а следовательно и от плотности упаковки , то была предпринята попытка заменить к` на индекс удерживания , однако в В. Э. Ж. Х индексы удерживания широкого применения не нашли. Однако в реальных случаях разделения приходиться иметь дело с несколькими разделяемыми компонентами, поэтому вводят такую величину какселективность --aij=(tRi-t0)/(tRj-t0). Селективность является сравнительной термодинамической характеристикой двух разделяемых соединений.
Все рассмотренные величины характеризуют термодинамические процессы в системе , однако процессы в хроматографической колонке определяются еще и кинетическими факторами, как и любой другой химический процесс . Так еслиaij=1, (термодинамическая характеристика), то вещества не разделить при любом устройстве колонки. Однако неравенство селективности единицы не гарантирует разделения веществ. Для хорошего разделения колонка должна обладать еще и достаточно высокими характеристиками кинетического характера, а именно акты сорбции-десорбции должны совершаться с большой скоростью, чтобы реализовать термодинамическую возможность разделения.
Для оценки разделения веществ всегда нужно учитывать 2 фактора –термодинамический и кинетический. В качестве численной меры , учитывающей кинетику и термодинамику используюткритерий разделения: RS=2*(tRi – tRj)/(WSi--WSj) .
RS связан с основными характеристиками системы следующим образом: RS=0. 25*((a-1)/a)*((k`/(1+k`))*N1/2 , k` -- здесь средний коэффициент удерживания .
Как уже отмечалось выше для хроматографического анализа и особенно разделения важна форма зон (пиков) на хроматограмме в идеале требуется , чтобы они были как можно более узкими и высокими и более удалены друг от друга, в этом случае легче будет провести анализ и он будет более точным. Ширина пиков (их форма) зависит от высоты теоретической тарелке, чем выше Н, тем хуже это отражается на виде хроматограммы. Н , в частности, зависит от разного рода диффузионных процессов , протекающих внутри колонки. Эти процессы , обусловлены:
вихревой диффузией, которая возникает из-за неоднородности твердой фазы- она пропорциональна размеру частиц сорбента;
продольной молекулярной диффузии в подвижной фазе появление этой диффузии связано с затрудненностью перемещения между гранулами сорбента, эта диффузия обратно пропорциональна скорости подвижной фазы;
продольной диффузии в неподвижной фазе –также обратно пропорциональна скорости потока , обычно вклад этого вида диффузии равен вкладу продольной диффузии в подвижной фазе; вклад в диффузию кинетики массопередачи в подвижной фазе, пропорционален скорости потока;
вклад неравновестности процесса внутри застойных зон в частицах насадки , также линейно зависит от скорости потока; вклад кинетики массопередачи в неподвижной фазе.
Как мы можем видеть многие составляющие диффузии (увеличивающие значение Н) линейно зависят от скорости потока, некоторые обратно пропорционально и в общем случае зависимость Н от скорости представляет собой гиперболу с некоторым минимальным значением Н и соответсвующему ему значению скорости Uопт. - Оптимальная скорость потока. При более детальном анализе каждой составляющей диффузии можно видеть , что чем меньше частицы сорбента , тем меньше диффузия. Но уменьшение размеров частиц сорбента встречает ряд трудностей , и одна из них- необходимость создание высокого давления в системе , так как при уменьшении частиц сорбента сильно возрастает сопротивление потоку, и для сохранения прежней скорости потока необходимо повышать давление : P=(r*u)/(d2*L); d-диаметр зерен ; видно , что при уменьшении диаметра зерен в 2 раза , нужно повысить давление в 4 раза для сохранения скорости разделения постоянной. На практике для увеличения скорости разделения часто используют скорости потока , превышающие Uопт. , при такой ситуации положительное влияние оказывает увеличение диффузии в подвижной фазе , и исходя из этого предпочитают брать подвижные фазы с возможно малым коэффициентом вязкости. СОРБЕНТЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА.
Сорбент является важнейшей частью хроматографической системы, именно от его характеристик и типа зависит возможность разделения веществ. Большое значение для кинетических характеристик имеют размеры частиц. В классической колоночной хроматографии используются сорбенты с размерами частиц 30-200 мкм , при высоте колонке 1 м. Однако главный недостаток крупно зернистых сорбентов–большая длина диффузии внутри зерен , в этом случае приходится применять небольшие скорости движения потока . Основной путь улучшения кинетических характеристик сорбента–уменьшение толщины активного слоя . Достичь этого можно двумя путями . Первый из них заключается в том , что на неактивное ядро (стеклянный шарик) диаметром порядка 30 мкм наносят тонкий слой сорбента 1-2 мкм–такие сорбенты получили название поверхностно-пористых сорбентов. Колонки , заполненные такими сорбентами не оказывали большого сопротивления потоку, но однако обладали и таким недостатком как малая сорбционная емкость, так как в значительной степени состояли из неактивного материала.
Второй путь улучшения качества сорбента –уменьшение диаметра частиц вплоть до 3—10 мкм. такие сорбенты называют объемно-пористыми. Такие материалы уже создают значительное сопротивление, что приводит к необходимости применять давления порядка 400 атм. Однако при увеличении однородности частиц удается снизить рабочее давление до 50—150 атм. Несомненным достоинством объемно-пористых сорбентов является их большая емкость , что позволяет их использовать не только в аналитических целях, но и для препаративного разделения веществ.
В качестве материалов сорбентов используют самые разные вещества природного происхождения и синтетические–органические и неорганические полимеры. Прежде всего это сорбенты на основе целлюлозы, агарозы, окиси алюминия, силикагели. При химической модификации сорбента , введением каких—либо функциональных групп можно получить сорбент с требуемыми свойствами, сродством к определенным классам соединений. В частности так получают ионообменники, если функциональная группа ионогенна. К важнейшим характеристикам сорбента также можно отнести развитость поверхности , размер пор на его поверхности. Одним из самых распространенных сорбентов является силикагель, или его многочисленные модификации. Это определяется тем , что силикагель можно легко модифицировать, можно легко получать частицы с заданным размером частиц, размером пор, разной удельной поверхностью и т. д. , к тому же сорбенты на основе силикагеля механически прочны и химически стойки. Силикагель чаще других сорбентов используют в нормально—фазовой хроматографии, благодаря взаимодействию сорбатов с полярными силанольными Si—OH и силоксановыми группами Si—O—Si . Модифицируют силикагели с помощью органилгалогенсиланов – R3—Si—Cl , R2—SiCl2, R—SiCl3 . Модификация происходит за счет взаимодействия ОН—групп силикагеля с галогенсиланом, в результанте чего к силикагелю присоединяется остаток силана с органическими радикалами, который и придает сорбенту необходимые специфические свойства, например анионообменник SAX: R=(CH2)3—NR3. - сильный анионообменник, используемый для разделения кислот. В настоящее время существует широкий спектр сорбентов с самыми разными модификациями , как правило выбор модифицирующего лиганда зависит от свойств и строения разделяемых веществ. Так если R обладает хиральностью, то на сорбенте возможно будет разделять оптические изомеры. Однако следует иметь в виду, что сорбционные свойства материала могут меняться в зависимости от подвижной фазы (растворителя). Сорбенты гель-фильтрации.
Поскольку практическая часть нашей работы связана с гель-фильтрацией, остановимся кратко на материалах, с помощью которых происходит процесс разделения.
В гель-фильтрации используются в качестве сорбентов как материалы природного происхождения, модифицированные и обработанные соответствующим образом (основа как правило целлюлоза или агароза), так и разнообразные синтетические материалы (гели на основе поливинилацетата, полиакриламида). Также используют вещества неорганического происхождения- пористые стёкла и пористый силикагель. По отношению к растворителю гели разделяют на гидрофильные и гидрофобные. Гидрофильные гели активно взаимодействуют с водой , впитывая её, при этом они набухают. Гидрофильность им придают гидрофильные группы , находящиеся на поверхности гранул геля (например–OH , -NH2и некоторые другие). Гидрофобные гели не взаимодействуют с водой (не набухают) , зато могут хорошо набухать в органических растворителях. Гидрофильные гели могут быть превращены в гидрофобные, для этого их нужно обработать реагентом, который реагирует с поверхностными группами, меняя их природу. Также ещё гели делят на универсальные и специального назначения. Универсальные гели отличаются широким распределением пор по размеру , разделение на них может дать первичную, но очень ценную информацию. Также гели подразделяют на мягкие, полужёсткие и жёсткие ( все либо гидрофильные либо нет). Мягкие гели как правило органические вещества , характеризуются высокой эффективностью, их фактор ёмкости (Vвн/Vсп) равен 3. Полужёсткие гели получают полимеризацией , они обладают высокой проницаемостью , средней ёмкостью, мало увеличивают свой объём при набухании. Жёсткие- это как правило неорганические вещества, не способные набухать их фактор ёмкости в среднем 0. 8-0. 9. Теперь кратко рассмотрим наиболее распространённые гели. Полидекстрановые гели.
Полидекстрановые гели типа сефадекс. Представляют собой довольно крупные молекулы пространственно разветвлённого декстрана. Хранится и перевозится в сухом виде. Окисление кислородом приводит к появлению новых карбоксильных групп, что в свою очередь становится причиной сорбции молекул вещества в неподвижной фазе. По ионообменному механизму , это недопустимо при гель–фильтрации, поэтому водные элюенты следует деаэрировать. Сильные окислители разрушают необратимо сефадексы. Данный сорбент не растворяется в органических растворителях. Остатки борной кислоты могут образовывать комплексы с декстраном , что предполагает не использовать борную кислоту и её соли при хроматографическом процессе. Во влажном состоянии при нейтральном pH сефадексы можно стерилизовать при Т = 1100С. В сухом виде выдерживает Т = 1200С. Сефадексы фирмы “Pharmacia” имеют маркировку G, номер означает пористость матрицы, то есть номер по сути своей описывает количество воды в мл. , которое связывает 10 грамм сухого геля, По размерам сферических гранул различают следующие категории: “Coarse” (100 – 300 mkm ); “Medium” (50 – 150 mkm ); “Fine” (20 – 80 mkm ); “Super fine” (10 – 40 mkm ).
В аналитическом варианте колоночной хроматографии использзуют – “Fine” и “Super fine”; “Medium” – для препаративных опытов; “Coarse” –для фракционирования свободным объемом. Аналогичные матрицы из сефадексы выпускает фирма “Reanal” (Г–10 - Г-200) и др. фирмы.
Сефакрилы представляют собой декстран, сшитый N, N –метиленбисакриламидом. Они поставляются уже набухшими, в виде густой водной суспензии. Главным её достоинством по сравнению с сефадексой–это более высокая жесткость частиц, что позволяет вести хроматографический процесс при более больших скоростях. Сефакрилы более химически стойки по сравнению с сефадексами. что даёт вести регенерацию колонок с этим сорбентом путём длительной промывки 0. 2 Н NaOH. В других свойствах данный сорбент похож на сефадексу.
Основным производителем сефакрила является фирма “Pharmacia”. Выпускают 5 её типов с маркой S ( от S-200 до S-1000 ) все категории “Super fine”. Гели агарозы
Сефароза представляет собой гель агарозы. Поставляется в виде суспензии, которую нельзя подсушивать. Гели её довольно жесткие, но менее чем у сефакрил. Гранулы сефарозы очень хрупкие и её нельзя использовать при Т выше 400С. Рабочий диапазон pH = 4 –9. Её разрушают детергенты и 6М раствор гуанидинхлорида. Стерилизацию колонок с сефарозой ведут диэтилпирокарбонатом. В присутствии солей даже умеренное подкисление приводит к сужению пор и увеличению поверхности сорбции. Сефакрилы фирмы “Pharmasia” имеют тип В с номером, показывающим процентное содержание агарозы, Гель агарозы, сшитый дибромпропанолом, имеет тип GL, Аналогичные матрицы из сефарозы выпускает фирма “Bio-Rad Labs” ( биогели серии А), фирма “LKB” ( ультрогели серии А) и др... Полиакриловые гели:
Представляют собой акриламид, прошитый N, N –метиленбисакриламидом. Хранится и перевозится в сухом виде. Пористость геля определяется концентрацией полиакриламида. Рабочий диапазон pН = 3–8. Это нейтральный, гидрофильный гель для работы с водными растворителями. При кипячении в водных растворах буферов при рН около 7 уже происходит гидролиз амидов. Химически менее стоек, чем сефадекс. Колонки на его основе “медленнее”, чем соответственные из сефадексы. Выдерживает меньшее давление, чем сефадекс. Основной производитель –фирма “Bio-Rad Labs” (биогели серии Р и категории “Fine” ). Аналогичные сорбенты выпускают фирмы “LKB” (ультрогели серии АсА ) и др. фирмы. РАСТВОРИТЕЛИ.
Как уже было сказано подвижная фаза имеет большое значение в хроматографическом процессе. Она влияет как на кинетику процесса (В. Э. Т. Т. ), так и на термодинамику процесса , например , изменяя состав подвижной фазы можно менять коэффициент удерживания в 1000-10000 раз. Однако на практике используют значения к` от 1 до 20. Влияние на кинетику и термодинамику связано с тем , что подвижная фаза играет двоякую функцию. С одной стороны подвижная фаза выполняет транспортную функцию, и здесь ее химические свойства роли не играют , имеют значения лишь физические (вязкость, летучесть и д. р. )—в этом плане растворитель влияет главным образом на кинетические характеристики разделения. С другой стороны молекулы растворителя участвуют в системе термодинамических равновесий–установлении сорбционного равновесия, они взаимодействуют с сорбатами , сорбентами , и здесь уже имеют значение химические свойства растворителя( кислотность , основность), а также его физико-химические характеристики (дип. момент) .
Получается так, что взаимодействие сорбатов с растворителем не менее важно, чем взаимодействие с сорбентом. Таким образом природа растворителя может влиять на термодинамику процесса. (к`). Необходимо помнить о том , что в ряде случаев молекулы растворителя способны к прочной сорбции , что коренным образом отражается на свойствах сорбента. Также необходимо помнить о том , что растворитель не должен содержать взвешенных примесей, оседая в колонке они могут резко нарушить пропускную способность колонки, создавая дополнительное сопротивление потоку, меняя свойства колонки, что ведёт к невоспроизводимым результатам, поэтому необходимо фильтровать растворители через фильтры с размером пор около 0. 5 мкм. Также особо важно для метода В. Э. Ж. Х. , чтобы растворитель был тщательно дегазирован, особенно это касается легко летучих растворителей, так как при перепадах давления могут возникнуть пузыри пара, что также не в лучшую сторону изменит ход процесса, и будет приводить к невоспроизводимым результатам. Образование пара заставляет применять более высококипящие жидкости (t больше 60), но они как правило более вязкие , что приводит к применению более высоких давлений. В качестве ориентира следует указать величину вязкости порядка 1, 5 сП, тогда скорость движения подвижной фазы ~0. 4 м/с, Р~200 атм. Если все—таки нужен растворитель с большей вязкостью, то можно термостатировать колонку при t~60. Необходимо также помнить о согласовании свойств растворителя и метода детектирования. Так если применяют УФ—детектор, то растворитель должен быть прозрачным для его света, это же относиться и к ИК—детекторам. Также нужно особо тщательно следить за химической чистотой растворителя. Применительно к рефрактометрическим детекторам следует нужно сказать , что лучше использовать растворитель с минимальным коэффициентом преломления, тогда разность показателей преломления будет наибольшей , что приведет к большей точности анализа
Однако , вернемся к рассмотрению свойств растворителя. Как уже было сказано растворитель участвует в установлении равновесия в колонке, константы взаимодействий с участием растворителя определяют определяют элюирующую способность данной подвижной фазы. Под элюирующей способностью понимают способность вымывания разделяемых веществ, сорбированных в колонке. Растворители с низкой элюирующей способностью не вымывают вещества из колонки , или вымывают их через длительный интервал времени, растворители с высокой элюирующей способностью вымывают компоненты почти мгновенно и не разделяя. Подбор конкретного растворителя как правило производиться методом проб и ошибок, из-за отсутсвия четкой теории растворов. Понятно также , что элюирующая способность может относиться только к какому-то конкретному веществу, растворитель хорошо вымывающий одно вещество плохо вымывает другое, или элюирует его слишком быстро. Несмотря на отсутствие четкой теории растворов , необходимый растворитель можно предсказать на основе его физико—химических констант, для этого существуют специальные таблицы, содержащие информацию о важнейших растворителях.
Как уже было сказано есть растворители, которые не вымывают веществ из колонки , такие растворители называют транспортными , если таким растворителем разбавить сильно активный растворитель, то его элюирующая способность снизиться. Последнее время все чаще используют не индивидуальные вещества , а именно смеси, особенно при хроматографировании многокомпонентных систем. Однако есть правило , согласно которому при разделении смеси из n компонентов используют смесь из n растворителей, при этом 1 из них является транспортным, а остальные n-1 активные элюенты. Использование смесей из большего числа компонентов не приводит к лучшим результатам. Зачастую к растворителям делают добавки в количестве 0. 1-2% --модификаторы, они позволяют значительно улучшить хроматографический процесс. Можно найти много путей действия модификаторов в каждом конкретном случае, например, это может быть связывание наиболее активных центров на сорбенте, и как следствие стабилизации термодинамики процесса. Модификаторы могут также использоваться для создания определенного pH среды , наиболее благоприятного для протекания разделения. В качестве модификаторов обычно используют неорганические соли, буферные добавки и т. п. , в случае гель-фильтрации вкачестве модификатора могут выступать соли (NaCl), которые подавляют ионообменную активность сорбента, которая в данном виде хроматографии является лишней, также при хроматографии белков солевые и буферные добавки создают условия для растворения белков. Особое внимание следует уделить градиентному элюированию, при котором состав подвижной фазы меняется со временем в процессе элюирования. Обычно это позволяет улучшить процесс, повысить разрешающую способность колонки, уменьшить ширину пиков, увеличить их высоту.
Как уже было сказано выбор растворителя- , задача не решаемая теоретически. Однако к настоящему времени получены некоторые практические наработки по выбору растворителя и вида хроматографии. ПРЕПАРАТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ.
Целью нашей курсовой работы является оптимизация условий очистки вакцины против вируса клещевого энцефалита от низкомолекулярных сопутствующих веществ. Очистка производится методом гель-фильтрации. Производство вакцины подразумевает большие объёмы веществ, много большие, чем те, с которыми приходится работать в лаборатории. Это накладывает на процесс определённые особенности, и обуславливает отделение препаративной хроматографии от аналитической. Одной из важных особенностей препаративной жидкостной хроматографии является работа со значительно большими количествами вещества - до 0. 1г. на 1г. насадки, и количество очищенного материала в единицу времени может достигать 100г и выше. Надо также сказать, что выделение (очистка) веществ методом жидкостной хроматографии на сегоднейший день является сравнительно дорогой операцией. Поэтому при разработке методики важно учитывать такие факторы, как эффективность разделения, время проведения разделения (включая время подготовки процесса). Часто, стараясь сэкономить на одном (уменьшить время разделения , увеличивая количество образца), можно сильно проиграть на другом - качестве разделения, тогда конечный выделенный продукт может содержать слишком большой процент примесей, что сведёт на нет все труды и затраты по разделению. Исходя из этих соображений ясно, насколько важно найти ту "золотую середину" в условиях, чтобы сохранять эффективность очистки и проводить разделение наиболее дёшево.
При препаративном разделении часто приходится сталкиваться с такими понятиями, как перегрузка колонки. Перегрузка -это такая нагрузка, которая больше не позволяет выделять продукт с требуемой чистотой или степенью извлечения. Эксперимент всё ещё является лучшим путём определения оптимальной нагрузки. Вообще величина нагрузки в большинстве случаев от параметров, которые влияют на число теоретических тарелок. Также методом проб и ошибок было установлено, что для фиксированного размера образца более сложные разделения требуют значительно большего отношения массы насадки к массе образца. Структура и свойства молекул, характер их взаимодействия с подвижной и неподвижной фазами в присутсвии других компонентов образца, геометрия колонки, структура и свойства сорбента , наряду с другими аспектами, - являются критическими для определения оптимального размера образца, при котором достигается максимальная эффективность и практичность разделения в препаративной хроматографии.
В [3] приводятся данные, рекомендуемой нагрузки (масса сорбента на 1 грамм образца) в зависимости отa: Селективность (aij) Сложность Разделения Ж. Х. -метод Масса адсорбента на 1 г. образца >2. 0 Лёгкое Открытые колонки ~15 ~20 >1. 5 Среднее Возможно на открытых колонках 50-500 До~500 >1. 3 Сложное На грани возможности Т. С. Х. До 500 500-5000 Очень сложное Только В. Э. Ж...Х. ---- ------ (для силикагелевых сорбентов)
В препаративной жидкостной хроматографии размер теоретической тарелки зависит от количества и концентрации образца, введённого в слой. Понятно, что чем ближе сродство 2-х разделяемых веществ к каждой из фаз, тем труднее их разделить , нужно больше актов сорбции-десорбции. Достигнуть требуемого разделения в таком случае можно уменьшив размер образца, либо увеличить число теоретических тарелок (собственную эффективность колонки). Есть несколько способов увеличения эффективности колонки : a. )уменьшить размер частиц в колонке тех же размеров
b. )увеличить эффективную длину колонки одним из следующих путей : заполнить более длинную колонку, соединить несколько колонок последовательно, использовать циркуляцию;
При увеличении длины колонки увеличивается время разделения и затраты растворителей, но с другой стороны можно брать большие объёмы образцов. Максимальная нагрузка сильно зависит отa , при малом a нельзя взять большую нагрузку , так как пики сильно сольются, при большом aможно значительно увеличить нагрузку , так в [3] приводятся данные о том, что при увеличенииaот 1. 05 до 1. 2 нагрузка может быть увеличена в 15 раз, либо при той же нагрузке можно уменьшить длину колонки, сократив затраты на насадку , растворитель и сэкономив время, что выгоднее нужно решать в каждом конкретном случае
Нагрузка и эффективность. При увеличении нагрузки падает эффективность (число теоретических тарелок), вначале медленно , а затем с линейной скоростью. Однако в ряде случаев скорость потери эффективности всё-же может быть меньше скорости скорости увеличения нагрузки , таким образом если коэфициент разделения достаточно высок , можно смело увеличивать нагрузку (до определённого уровня). Также следует отметить , что измеряемая эффективность для той же массы образца выше в случае более концентрированных растворов [3]. Интересно отметить, что колонки, заполненные частицами большего диаметра изначально менее эффективны , но при увеличении нагрузки она остаётся почти постояноой [3]. Таким образом при ведении трудных разделений простых смесей лучше использовать более длинные колонки с крупными частицами сорбента.
Нагрузка и время удерживания. В оптимальном случае время разделения дожно быть минимальным, однако с ростом нагрузки эффектвность разделения можно поддерживать на должном уровне только снизив скорость проведения анализа ( увеличив время ) , либо провести разделение в несколько приёмов, что также приведёт к увеличению времени. Однако в большинсве случаев условия можно оптимизировать таким образом, что селективность станет значительно высокой (>1. 3), тогда можно уменьшить время разделения, проводить процесс с большей скоростью, а если a>2 то с предельно возможной. Вообще возможности современной препаративной хроматографии позволяют проводить разделение в том же масштабе времени, что и аналитическое разделение. ИЗМЕНЕНИЕ ФОРМЫ ПИКА С УВЕЛИЧЕНИЕМ НАГРУЗКИ.
Массовый коэфициент распределения между двумя фазами в процессе разделения выражается как k'=(CS*VS)/(CM*VM) = KD*(VS/VM)
График зависимости CS oт CM в условиях достижения равновесия должен давать прямую линию, и это действительно так до определённой концентрации вещества в подвижной
фазе, после этой концентрации линия (изотерма Лэнгмюра) перестаёт быть линейной и изгибается либо кверху (размытый фронт), либо книзу (размытый тыл) (рис. 1). Первый случай имеет место , когда падает растворимость в подвижной фазе , второй когда неподвижная фаза слишком насыщена сорбируемым веществом (наиболее распространённый вариант).
В случае выпуклой изотермы при увеличении концентрации будет следующая картина: (схематический вид хроматограммы):
При малых концентрациях пик будет почти равносторонним треугольником, при росте концентрации фронт будет всё более крутым , тыл пологим , в пределе ситуация стремится к прямоугольному треугольнику. Термодинамические причины рассмотренного явления таковы: с ростом концентрации величина KDпадает т. е. молекулы будут находится больше в подвижной фазе, и сдвигаться в симметричной полосе к её левому краю (фронту), делая фронт более крутым, а тыл пологим. В случае вогнутых изотерм принципы изменений те же, но происходят они в обратном порядке . Важно сказать , что в случае нелинейной изотермы, площадь пика (а не его высота) остаётся пропорциональной концентрации образца, при условии линейности отклика детектора в этой области концентрациий (должна быть проверена линейность отклика в этой области). Понятно , что появление размытых "хвостов" у пиков ведёт к трудностям при выделении веществ, так как вероятно перекрывание с соседним пиком, возрастает разбавление, либо частью вещества придётся жертвовать (отбрасывать хвост пика). Вообще говоря, даже в случае плохой селективности (a
Нужно использовать высокую концентрацию растворённого вещества, присутствующую в резком фронте пика с размытым тылом , отбирать максимальное количество чистого вещества из этой области;
Выбрать такую разделительную систему , при которой нужный компонент элюируется первым;
Использовать циркуляцию для более полного извлечения веществ с требуемой чистотой; Степень разделения должна быть максимально оптимизирована.
Помимо названной причины отклонения пика от идеальной формы –нарушения линейности изотермы Лэнгмюра , есть ещё ряд причин , ведущих к каким-либо изменениям в форме пика. Кратко остановимся на них без детального рассмотрения.
пик имеет якобы симметричную форму , характерную для линейной адсорбции –это может быть следствием наличия малых количеств вещества , о котором ранее не подозревалось имеющего сильный отклик детектора.
пик с выраженным хвостом вблизи нулевой линии. Причина его появления –конкуренция механизмов сорбции на неподвижной фазе, либо изменения в твёрдой фазе (гидролиз)
зеркальное отражение второго случая –образование осадка в начале колонки , вследствии плохой растворимости веществ в элюенте , - ведёт к очень плохому разделению.
угловая вершина пика – неисправна колонка (пустоты, неравномерность заполнения). пик содержит места изменения наклона. Это может быть следствием неполного разделения двух веществ.
растянутый чрезмерно тыл –следствие неполного равновесия (нет разделения как такового) , либо бывает при рефрактометрическом детекторе (погрешность детектора).
Перечисленные выше причины негауссовской формы пика указывают на недостатки хроматогорафической системы, и необходимость внесения в неё изменений, потому как данные причины не являются следствием типичных (классических) процессов в колонке , и для получения устойчивых, качественных и воспроизводимых результатов необходимо избавится от этих факторов, портящих форму пика. МАСШТАБИРОВАНИЕ РАЗДЕЛЕНИЯ.
После того как разработаны наиболее благоприятные условия для разделения , подобран растворитель , сорбент , геометрия колонки , количества и концентрации вводимых веществ , можно перейти к большим объёмам , характерным для препаративной хроматографии. Переход к большим объёмам разделений без потери прежних характеристик системы–называется масштабированием. Не все характеристики и условия процесса можно менять при масштабировании, некоторые можно менять только по специальным пропорциям. Далее рассмотрим кратко масштабирование на основе аналитической жидкостной хроматографии.
Химические свойства материала насадки при масштабировании не должны изменятся , может меняться лишь размер частиц. Любые модификации поверхности должны быть идентичны для препаративной и аналитической систем, даже простое уменьшение размера частиц путём размола ведёт к изменению свойств поверхности и резко отразится на процессе разделения. Поэтому при разработке препаративного разделения для малых масштабов лучше взять насадку той же марки , которая будет использоваться для препаративного разделения. Большое значение имеет также предыстория насадки, то есть какие растворители в ней использовались. Так , например , разработав разделение на аналитической колонке с определённым сорбентом , можно при переходе к препаративному разделению обнаружить неожиданные результаты, это может быть следствием того , что например сорбент , использованный в аналитической колонке когда-то давно был обработан растворителем , содержащим определённые модификаторы , которые могли осесть на сорбенте , необратимо изменив его свойства.
Относительно геометрии колонки надо сказать , что нагрузка прямо пропорциональна площади поперечного сечения, однако надо заметить , что для полной пропорциональности необходимо , чтобы устройства систем распределения у входа и выхода были одинаковы у аналитической и препаративной колонок. По поводу концентрации следует сказать , что в отличие от аналитической хроматографиии, где концентрации составляют ~1% от , в препаративной хроматографии концентрации 1-10 % , при исследовании больших концентраций возникает проблема массовой перегрузки , т. е. высота теоретической тарелки возрастает, пики уширяются , разрешение становится неприемлемо низким. Если концентрация вводимого образца в пределе 1-10 % , но объём превышает 10-20 % мёртвого объёма , то пики слабоудерживаемых компонентов сильно размываются , возникает объёмная перегрузка. ПРЕПАРАТИВНАЯ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ.
В целом , конечно , закономерности для препаративной гель-фильтрации аналогичны остальным видам препаративной жидкостной хроматографии, но поскольку наши исследования связаны именно с гель-фильтрацией , считаем нужным остановиться подробнее именно на препаративной гель-фильтрации. Размер колонки является главным фактором , влияющем на масштаб препаративного разделения. С увеличением внутреннего диаметра колонки размер образца , объём вводимой пробы и скорость потока элюента могут быть увеличены. Для препаративных разделений обычно предпочитают работать в условиях максимальных скоростей потоков и нагрузок, это позволяет проводить разделение без заметной потери разделительной способности. До тех пор , пока поддерживается разумная скорость потока, и колонка не перегружена , эффективность (разд. способность) определяемая числом теоретических тарелок, часто увеличивается с ростом площади поперечного сечения для колонок равной длины. В общем случае как размер образца, так и объёмная скорость потока могут быть увеличены пропорционально площади поперечного сечения колонки , независимо от типа или размера частиц насадки. Из-за высокой стоимости частиц сорбента малого размера (>10мкм), чаще используют для стандартных и крупномасштабных разделений частицы большего диаметра (30-60 мкм) с широким распределением по размерам [3]. Также следует упомянуть о циклической гель-хроматографии, в этом случае фракции, получаемые на выходе из колонки могут быть подвергнуты повторному разделению на той же колонке для повышения их чистоты. Также возможен вариант при котором повторное разделени осуществляется на другой колонке. Процесс увеличения длины колонки может быть повторён до тех пор, пока образец подлежащий разделению занимает весь объём колонки. Преимущества циклического разделения : требутся меньше растворителя,
снижается противодавление колонки, что позволяет увеличить время жизни , использовать большие скорости потока.
Но есть и недостатки. Так при циклизации происходит размывание зон - главный источник которого - мёртвый объём трубопроводов и насосов. Кроме того для образцов с широким М. М. Р. при проведении первого цикла весь объём пор будет занят, и при циркуляции реализовываться лишь небольшое увеличение разрешения. Также при циркуляции концентрации фракций уменьшаются, поэтому необходимо концентрировать выделенные фракции, что ведёт к дополнительным затратам и усложняет весь процесс в целом. Также надо сказать, что сбор фракций становится более сложным для автоматизации, особенно если необходимо селективно удалять фракции на определённых стадиях процесса. В [3] имеется ссылка на то, что выделение веществ циклической хроматографией более качественное но более дорогое, хотя в ряде работ при разделении веществ с низкими молек. Массами была получена экономия растворителя и продлена жизнь колонки. ОПТИМИЗАЦИЯ ПРРЕПАРАТИВНОЙ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ.
Надо сказать, что теория и практика аналитического разделения подходит и к препаративному разделению, что конечно упрощает процесс оптимизации , учитавая то, что только эксперимент позволяет подобрать наиболее выгодные условия для разделения. Так если в лаборотории найдена оптимальная линейная скорость потока, то её же можно поддерживать и в колонках большего диаметра (препаративных). Тогда соответственно для объёмной скорости :
FP=(DP/Dа)2 * Fа , где а- аналитическая система, P- препаративная система
В [3] рассматривается влияние некоторых параметров на эффективность препаративного разделения. Так было установлено, что при увеличении скорости потока падает Rs. В [3] также есть ссылки на то, что хотя число теоретических тарелок резко уменьшается с увеличением скорости потока, при низких нагрузках, но однако скорость мало влияет на число Т. Т. при высоких нагрузках. Оптимальный вводимый объём в препаративной хроматографии (в отличие от аналитической) зависит главным образом от диаметра колонки , её длины и требуемого разрешения. Число Т. Т. по видимому менее чувствительно к увеличению объёма образца в тех случаях, когда увеличивается диаметр колонки. Увеличение длины колонки позволяет увеличить разрешение , но имеет также обратный эффект , связанный с увеличением времени разделения и уменьшением при этом производительности. В [3] также даётся ссылка на то , что лучше использовать большие объёмы проб , при этом эффективность фракционирования заметно улучшается. В [3] даётся ссылка на работу , в которой обнаружено, что оптимизировать разделение можно путём расположения насадки в виде слоёв , так чтобы средний размер пор убывал в направлении потока в колонке. Было в значительной мере уменьшено влияние концентрации , и увеличен выход образца.
Оптимальный объём фракции прямо зависит от объёма и концентрации вводимого образца, разделительной способности и размера колонки. Показано также, что уменьшение объёма фракции меньше влияет на уменьшение полидисперсности , когда Mr фракции уменьшается или увеличивается объём элюирования (т. е. низкомолекулярные вещества выходят более чистыми). В [3] также указывается на то , что образцы в гель-фильтрации можно вводить один за другим с интервалом, соответствующему примерно объёму V0 , увеличивая выход образца , экономя растворитель и уменьшая время разделения Клещевой (весенне-летний) энцефалит.
Клещевой энцефалит (синонимы: таежный энцефалит, дальневосточный менингоэнцефалит, клещевой энцефаломиелит, русский весенне-летний энцефалит, tick-borne encepalitis) - вирусное, природно-очаговое (характерное только для определенных территорий) заболевание с преимущественным поражением центральной нервной системы (ЦНС). Разносчиками инфекции являются иксодовые клещи, вирус передается при укусе больного клеща. Инфекция также поражает и животных грызунов, домашний скот, обезьян, некоторых птиц.
Возбудитель инфекции - это вирусы семейства Flaviviridae. Выделяют два принципиально важных географических, клинических и еских варианта вируса и заболевания. Дальневосточный, самый тяжелый вариант клещевого энцефалита, а также европейский вариант клещевого энцефалита. Сам вирус клещевого энцефалита был впервые выделен в 1949 г. В настоящее время инфекция регистрируется в Австрии, Германии, Польше, Чехословакии, Финляндии, прибалтийских государствах, европейской и дальневосточной части России, Италии, Швейцарии. Максимальные показатели заболеваемости отмечаются в России и Австрии. За неполный 1999 г. в России было зарегистрировано более 7000 случаев заболевания, что на 30% выше показателей 1998 г.
Наибольшему риску подвержены лица, деятельность которых связана с пребыванием в лесу - работники леспромхозов, геологоразведочных партий, строители автомобильных и железных дорог, нефте- и газопроводов, линий электропередач, топографы, охотники, туристы. В последние годы отмечается преобладание среди заболевших горожан. В числе больных до 75% составляют горожане, заразившиеся в пригородных лесах, на садовых и огородных участках. Экстренная профилактика (то есть профилактика после укуса клеща) может быть проведена с помощью иммуноглобулинов. В России доступны два отечественных препарата (из лошадиной и человеческой сыворотки) и один импортный - FSME-Bulin (пр-ва Immuno AG, Австрия). Вакцины.
Принципиально все вакцины для профилактики клещевого энцефалита представляют собой выращенные на куриных эмбрионах, инактивированные формалином вирусы, сорбированные на адъюванте (вещество для усиления
иммунного ответа) - гидроокиси алюминия. В качестве дополнительных, стабилизирующих компонентов применяют желатин или альбумин. На настоящий момент в России доступны четыре вакцины:
* культуральная вакцина (пр-во НПО Вирион , Томск). Показана для вакцинации детей с 4-х лет и взрослых до 65 лет. Курс вакцинации состоит из трех доз по схеме: 0-1-4. Альтернативная схема для быстрой защиты состоит из двух доз с интервалом 1-2 месяца, причем последняя доза вводится не позднее, чем за 2 недели до входа в природный очаг инфекции. Объем вводимой дозы для детей до 6 лет составляет 0, 5 мл, для всех остальных - 1 мл. Выпускается в ампулах по 2 мл. Вакцина обладает самым обширным списком противопоказаний, включающим острый туберкулез и ревматизм, заболевания ЦНС, сердечно-сосудистой системы, почек, печени; аллергические расстройства, эндокринные заболевания (сахарный диабет и др. ), онкологические заболевания, болезни крови, беременность.
* концентрированная культуральная вакцина (пр-во Института полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва, Россия; штамм Софьин ). От первой отличается тем, что может применяться с возраста 18 лет. Курс вакцинации состоит из двух доз с интервалом 5-7 месяцев. Первую ревакцинацию делают одной дозой вакцины через 1-2 года, вторую и последующие–через три года. Противопоказания - активный туберкулез, перенесенная в предыдущие 6 месяцев менингококковая инфекция и вирусный гепатит; наследственные и активные заболевания нервной системы, эпилепсия, пищевая аллергия, бронхиальная астма, заболевания соединительной ткани (напр. ревматизм), болезни крови, перенесенный инфаркт и инсульт, болезни эндокринной системы, злокачественные новообразования, беременность.
* "FSME-Immun-Inject" (пр-ва Immuno AG, Австрия в составе компании Baxter, США). Выпускается в виде шприц-доз, объем дозы - 0, 5 мл для всех возрастов. Очень короткий список противопоказаний - острые (или обострения хронических) заболевания, аллергия на компоненты вакцины. Беременность и лактация не являются противопоказанием. Защищает от обоих вариантов инфекции - европейского и дальневосточного. Курс вакцинации состоит из 2 доз, которые вводятся c интервалом от 2 недель до 1 месяца (после такой вакцинации защищенными являются 95% привитых); первая ревакцинация проводится через 9-13 месяцев после введения второй дозы; повторная ревакцинация проводятся через 3 года от момента введения третьей дозы. Может вводиться одновременно с иммуноглобулином. Не имеет возрастных ограничений. Из двух импортных вакцин, доступных в России, обладает большей распространенностью и более широким опытом применения. * "Энцепур" (пр-ва Chiron Behring, Германия, вирусный штамм К23). От предыдущей отличается наличием дополнительной схемы вакцинации - три дозы по схеме 0-1-3 недель. Второе отличие - несколько большее число побочных реакций в связи с присутствием в составе вакцины желатина. Все перечисленные вакцины обладают высокой иммуногенной активностью. Через две недели после введения последней дозы первичного курса вакцинации иммунитетом обладают от 90 до 97% привитых. Среди побочных реакций преобладают реакции в месте инъекции (покраснение, уплотнение, болезненность) их отмечают около 8% привитых первой дозой вакцины, с последующими дозами вакцины число побочных реакций снижается. Температурные реакции встречаются у 5% вакцинированных. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ.
При производстве вакцины против вируса клещевого энцефалита важное значение имеет очистка готового продукта на последних стадиях производства. Суть очистки в том , чтобы отделить белки вакцины от низкомолекулярных веществ, которые вводятся на разных стадиях производства вакцины с целью отделить вирус от клеточных оболочек, дезактивировать вирус. В качестве этих низкомолекулярных веществ могут выступать антибиотики (канамицин, неомицин) , а также тритон TX-100. В масштабах лабораторной практики эта задача не является сложной. Можно взять небольшой объём пробы и провести успешное отделение высокомолекулярной компоненты от низкомолекулярной. Однако, нас интересует препаративное разделение в промышленных масштабах. В этом случае необходимо учитывать и такие факторы как быстрота проведения разделения, количества, выделяемые при разделении , сложность и стоимость проведения разделения, естественно качество выделяемого образца (чистота), должно быть неизменно высоким. Очевидно, разделение будет более дешёвым, если разделять возможно большие порции вещества (проводить очистку больших доз вакцины), при наибольших скоростях , с максимальными концентрациями. Но при этом возможно размывание зон (пиков) и придётся либо отбрасывать часть вещества, либо мириться с примесями , также не следует забывать о разбавлении препарата при гель-фильтрации. Вообще как указывается в [3] , основным недостатком гель-фильтрации в препаративном разделении является низкое отношение объёма пор к общему объёму колонки, для нынешнего поколения сорбентов. В связи с этим, часто возникает необходимость применения последовательного подключения большого числа колонок с соответсвующим ростом затрат. Целью нашей работы стала оптимизация процесса очистки вакцины от низкомолекулярных веществ. Исследования проводились на модельных смесях, содержащих в качестве белковой части альбумин (1мг/мл), в качестве низкомолекулярного вещества анальгин (1мг/мл). Применение альбумина обусловлено тем, что это сравнительно лёгкий белок (~50000), и обладает способностью сорбировать на себе низкомолекулярные вещества. Таким образом добившись разделения этой смеси, можно рассчитывать на то, что разделится и реальная смесь.
Для исследования нами были приготовлены два раствора первый содержал только анальгин, второй анальгин и альбумин. Раствор готовился на основе 0. 02М фосфатного буфера (pH=7. 2), также оба раствора содержали 0. 15М NaCl для предотвращения ионообменных процессов в колонке и для улучшения растворимости белка.
Для приготовления растворов анальгин был взят из продажной таблетки, альбумин из продажного препарата (10% раствор). Для приготовления растворов сперва был приготовлен фосфатный буфер с добавкой соли. Буфер готовился смешением рассчётных количеств Na2HPO4 и NaH2PO4, также при растворении была добавлена соль. После чего раствор разделили на 2 части в одну добавили аликвоту содержащую анальгин, в другую аликвота, содержащая анальгин и альбумин.
Для приготовления растворов использовалась бидистиллированная вода, растворы перед введением в колонку фильтровали.
Сначала нами было проверено влияет ли объём вводимой пробы на местоположение пика. Для этого был взят раствор, не содержащий альбумина. В колонку гель-фильтрации вводили в первом опыте 5 мл. раствора , во втором 30 мл. раствора. Время выхода (начало появления анальгина по детектору) в обоих случаях было одинаково и составляло 14 мин. Затем нами была проведена гель-фильтрация модельных смесей, также при разных объёмах проб (5, 20, 30 мл. ) результаты в виде таблицы : Таблица 1 V пробы Мл. Tвых анальгина tвых альбумина Ширина пика альбумина Примечание. 5 14 8. 5 7 Не перекрыв. 20 14* 8. 5 11 Перекрыв. 30 15* 8. 5 13 Перекрыв. *- время минимума на хроматограмме.
Таким образом видно , что объём больше 30 мл увеличивать нельзя так как уже при этом объёме пики частично перекрываются .
Для более детального изучения разделения при объёме пробы 30 мл, было принято решение собрать и проанализировать фракции , начиная с 8. 75 минуты. Сначала была собрана фракция в интервале 8. 75-14. 0 минут (31. 5 мл), затем с 14. 0 минуты собирали фракции по 3 мл (меняли пробирки через 30 сек. ). Анализ всех фракций проводили на ионообменной колонке MONO “Q” объём пробы 100 мкл. Анализировали последовательно основную фракцию и фракции из 5-ти пробирок. При этом производили оценку относительной концентрации альбумина по высоте пика, за единицу была принята концентрация в основной фракции (8. 75-14. 00 мин). Формула для расчёта : Ci=hi/hосн , где hi- высота пика альбумина в i-пробирке hосн- высота пика в основной фракции
Анализ проводился с целью определить оптимальное время для остановки отбора фракции альбумина. Поэтому также нами рассчитывалась концентрация альбумина на текущий момент времени (т. е. если бы фракции собирались в одну пробирку), при этом также концентрация в основной пробирке была принята за 1, и общий объём фракции. Также нами было посчитано относительное количество вещества в фракции, как ni=Cотн. *Vе. Cотн. = (31. 5*1+3*еni Ci )/(31. 5+3*n) Vе = 31. 5+3*n ; где n- номер пробирки.
Тогда процент выведенного альбумина будет w=nотн/nотн5, в расчёте на то что с 5 пробиркой выходит весь альбумин ( вообще это так и есть– см. табл. ) Результаты в виде таблицы : Таблица 2. № пробирки Интервал t мин Ci % Cотн Vе мл Кол-во вещества %выд. Альбумина 0 (основн. ) 8. 75-14. 00 100 1. 000 31. 5 31. 500 84. 70 1 14-14. 5 85 0. 987 34. 5 34. 050 91. 53 2 14. 5-15 70 0. 964 37. 5 36. 150 97. 17 3 15-15. 5 26 0. 912 40. 5 36. 939 99. 29 4 15. 5-16 8 0. 854 43. 5 37. 149 99. 86 5 16-16. 5 2. 4 0. 800 46. 5 37. 200 100
Таким образом мы можем сделать вывод о том , что сбор высокомолекулярной фракции можно прекратить на 3 пробирке ( на 15. 5 минуте) , объём фракции при этом составит 40. 5 мл ( при неизменной скорости потока 6 мл/мин). Тогда потери альбумина составят 0. 71%, при этом концентрация белка в этой фракции будет 0. 735 мг/мл ((1*0. 9929*30)/40. 5), вместо исходной 1 мг/мл.
Также было проверено можно ли отделить тритон TX-100 от альбумина в данной системе. В результате оказалось , что тритон слабо удерживается на данной колонке , притом время появления тритона также не зависит от объёма вводимого образца. Разница между пиками на хроматограмме слишком мала, чтобы можно было проводить препаративное разделение. Эти результаты можно объяснить тем , что молекула тритона слишком велика, образует ассоциаты с молекулами воды, другими молекулами, что ведёт к плохому проникновению в поры сорбента, и как следствие плохому удерживанию. Возможно стоит сменить сорбент, использовать другую марку с другими характеристиками.
Подводя итог нашей работы следует сказать, что нами была разработана методика очистки вакцины от некоторых низкомолекулярных веществ, чтобы воплотить эту методику на практике нужно лишь провести масштабирование до нужных масштабов. Суть масштабирования может быть в том что будет увеличен внутренний диаметр колонки, может быть увеличена скорость , либо концентрация исходного образца, выводы по масштабированию могут быть в каждом случае свои в зависимости от возможностей. ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА.
В. Э. Ж. Х. в биохимии / под ред. Бауэр Г. , Хешиена А. и др. М. Мир 1988 Сахартова О. В. , Шатц высокоэффективная жидкостная хроматография Бидлингмейер Б. , Фрайд Б. Препаративная жидкостная хроматография М. Мир 1990 Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот Хефтман Хроматография ч1, ч2.