Микроклональное размножение Ириса Низкого путем изолирования зародыша как способ сохранения вида

Муниципальное образовательное учреждение

Средняя общеобразовательная школа № 4

г. Калача - на - Дону

Волгоградской области

Муниципальное образовательное учреждение

средняя общеобразовательная школа № 4

г. Калача-на-Дону

Волгоградской области

МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ

ИРИСА НИЗКОГО

ПУТЕМ ИЗОЛИРОВАНИЯ ЗАРОДЫША

КАК СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ВИДА

Автор:

ученица 8 «Б» класса

Куприянова Юлия

Руководители:

учитель биологии: Бородина Т.А.

учитель географии: Матюшенко С.В.

Научный консультант:

Научный сотрудник

ГУ «Волгоградский региональный

ботанический сад»: Утц Ю.Б.

2007г.

Оглавление.

Введение

Глоссарий

Основная часть

1. Обзор литературы

1.1 Методы биотехнологии для сохранения генофонда растений

1.2 Микроклональное размножение как способ сохранения редких и исчезающих видов растений

1.3 Биология вида Ириса Низкого

2. Место и время проведения исследования

3. Методика проведения исследования

4. Оборудование

5. Личный вклад

6. Результаты исследования и обсуждение

7. Выводы

Список литературы

Приложения

Введение

Проблема охраны видов растений в настоящее время становиться актуальной вследствие нерационального использования природных ресурсов, расширения воздействия человека на окружающую среду, ухудшения экологической обстановки. Для многих видов из-за сокращения их численности и распространения, возникла реальная угроза исчезновения.

В Волгоградской области разработана и действует программа по сохранению редких видов флоры, в рамках ведения региональной Красной книги. В Красной книге Волгоградской области[7] представлен список видов растений, которые на сегодняшний день находятся под угрозой исчезновения. К таким видам относится Ирис Низкий (Iris pumila 2(V) D.) Особо охраняемые природные территории обеспечивают наилучшее условия для длительного выживания растений, но не везде они есть. Для некоторых редких видов растений сохранение их культивированием в ботанических садах менее успешно, но может быть единственным средством выживания.

В последние годы в мире стало широко использоваться размножение редких и исчезающих видов растений в стерильной культуре, т.к. семенное размножение не всегда эффективно, из-за быстрой потери всхожести семян.

Наиболее эффективным способом культивирования является клональное микроразмножение.

К основным преимуществам этого приема относятся: получение генетически однородных копий природных особей, ценного селекционного материала в больших количествах в течение года, сокращение сроков получения укорененных растений, подготовка растений в условиях теплицы к началу вегетации в открытом грунте.

В лаборатории биотехнологии растений ГУ «Волгоградский региональный ботанический сад» ведется работа по разработке технологий микроразмножения многих видов растений. Одним из объектов исследования является Ирис Низкий.

Проблема исследования

состоит в том, чтобы отработать технологию введения Ириса Низкого в культуру in vitro, подобрать оптимальные питательные среды и условия культивирования эксплантов, изучить их рост и развитие.

Объект исследования - Ирис Низкий.Предмет исследования - оптимальные питательные среды и условия культивирования Ириса низкого.

Цель исследования: разработка технологии клонального микроразмножения Ириса Низкого.

Задачи:

1. Отработать технологию введения Ириса низкого в культуру in vitro.

2. Подобрать оптимальные питательные среды и условия культивирования эксплантов.

3. Изучить особенности роста и развития Ириса Низкого на этапе микроразмножения.

Гипотеза: если подобрать оптимальные условия введения, размножения и содержания в культуре in vitro Ириса Низкого, то это позволит сохранить его как вид.

Глоссарий.

In vitro - выращивание растительных объектов «в стекле» (пробирке, колбе, биореакторе) на искусственных питательных средах в асептических условиях.

In vivo - выращивание живого материала в естественных условиях.

Эксплант - фрагмент ткани или органа, инкубируемый на питательной среде самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса.

Культура эксплантов - инкубация в стерильных условиях на питательных средах, вызывающих или не вызывающих пролиферацию фрагментов, изолированных из разных органов растений.

Клональное микроразмножение - получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному.

Пролиферация - новообразование клеток и тканей путем размножения.

Каллус - ткань, возникшая in vitro или in vivo путем неорганизованной пролиферации клеток растений и эксплантов.

Дедифференциация - переход специализированных клеток к пролиферации и неорганизованному каллусному росту.

Клонирование - получение генетически идентичных клеток, органов, популяций.

Морфогенез - процесс формирования органов (органогенез), тканей (гистогенез) и клеток (цитогенез или клеточная дифференциация).

Органогенез - процесс возникновения в неорганизованно растущей массе каллусных клеток зачатков органов (корней, листовых зачатков, побегов).

Основная часть

1. Обзор литературы

1.1 Методы биотехнологии для сохранения генофонда растений

Сохранение генофонда - одна из важнейших задач в деле сохранения природы, которой уделяют большое внимание во всем мире. Связано это с ограниченностью необходимых для существования человека биологических ресурсов и угрозой их истощения, вызванной мощным техногенным воздействием цивилизации на окружающую среду, от которого иногда страдают растения. Многие виды еще недостаточно хорошо изучены, однако все они являются генетическими ресурсами, которые человек может использовать. Поэтому потеря любого из них - невосполнимая утрата. Так, по данным Международного института генетических ресурсов растений (Рим), с начала ХХ века потеряно около 75% генетического разнообразия растений.

В настоящее время очень актуальна проблема сохранения генофонда, как культурных видов, так и дикорастущих растений, представляющих собой ценный селекционный материал. Существующие традиционные подходы сохранения генофонда базируются, во-первых, на создании разнообразных коллекций, а так же банков семян (хранение ex situ); во-вторых, на организации заповедников и заказников(in situ).

Создание коллекций растений невозможно без их первичного интродукционного изучения, когда они оцениваются на перспективность интродукции и поэтому критерию разделяются на три основные группы: очень перспективные, перспективные и малоперспективные. Для растений, входящих в две первые группы, чаще всего не возникает особых сложностей в формировании коллекции, тогда как для третьей группы обычные методы хранения живой ткани в вегетативной форме лимитируются трудностями создания оптимальных условий для выращивания.

Однако семена группы растений, относящихся к малоперспективным для интродукции, как правило, очень быстро теряют всхожесть при хранении. Представлены эти растения в основном видами, находящимися под угрозой исчезновения. Утрата таких растений в скором будущем может стать невосполнимой [4].

Применяемые традиционные методы сохранения генофонда трудоемки, а иногда и очень дорогостоящи, неприемлемы для ряда видов растений. Ценность сохраняемых растений часто лимитируется возможными болезнями и прихотливостью растений к новым средам обитания. Необходимы новые подходы, позволяющие преодолеть названные трудности и расширить список растений, сохраняемых в живых коллекциях.

Одним из альтернативных подходов к проблеме сохранения генофонда может стать использование методов биотехнологии растений. Но эти методы могут быть применимы только к таким видам, для которых разработаны методы регенерации и микроразмножения in vitro.Системы in vitrо, из которых невозможно получить растения-регенеранты, не представляют большого интереса для генетического сохранения [11]. Использование методов биотехнологии для сохранения генофонда имеет преимущества перед традиционными методами, заключающимися в том, что отпадает необходимость в большой площади земли и регулярном уходе за посадками, а также исключается возможность потери растений из-за заболеваний. Методические приемы, существующие в настоящее время, можно разделить на две группы. Одна группа методов базируется на хранении без нарушения процессов роста растений и, в дополнение к сказанному, именно эта группа методов имеет все те преимущества, которые с практической точки зрения дает использование методов культуры in vitro в размножении растений. Другие методы основаны на хранении при полной остановке роста либо при его замедлении [4].

В литературе не описываются приемы биотехнологии по выращиванию Ириса Низкого. И я считаю необходимым отработать технологию введения этого вида в культуру для его сохранения и размножения.

1.2 Микроклональное размножение как способ сохранения редких и исчезающих видов растений

Культура клеток растений - область биологии, тесно связанная с практикой. Почти каждый открытый здесь научный факт находит свое отражение в прикладных исследованиях. В отличие от клеток животных практически любая растительная клетка способна в определенных условиях и на соответствующих питательных средах регенерировать полноценные растения (свойство тотипотентности растительных клеток) Решающую роль во вторичном образовании органов (корней или почек) из недифференцированных тканей in vitro играет соотношение фитогормонов (ауксинов и цитокининов) и их концентраций в питательной среде. Изучение процесса экспериментального морфогенеза на всех уровнях организации, от отдельной клетки до верхушки побега, привело к созданию технологии клонального микроразмножения растений, которая уже в большинстве стран перешла на коммерческий уровень. Метод микроклонального размножения играет важную роль для ускоренного клонирования плодовых, ягодных, клубнеплодных, декоративных видов растений и древесных пород. Впервые этот метод применил французский исследователь Ж.Морель в 1960 г. для размножения орхидей. Из исходного экспланта ему удалось в течение года получить около четырёх миллионов новых растений, свободных от вирусной инфекции.

По своей сути микроклональное размножение аналогично вегетативному типу размножения растений с той лишь разницей, что оно протекает в пробирке в условиях in vitro, где из клеток изолированных тканей в итоге можно получить достаточно большое количество новых растнеий. Обязательным условием микроклонального размножения является идентичность полученного материала исходному материнскому растению [15]. Еще недавно этот способ рассматривали как возможность ускоренного клонирования вегетативно размножающихся видов растений, а так же как вспомогательный метод освобождения растений от вирусов. Однако результаты некоторых исследований показали, что значение этого метода существенно возрастает для клоновой селекции растений (экспериментальный мутагенез и расхимеривание), криосохранение ценного исходного материала, а так же ряда других [4]. Способность к образованию больших количеств (несколько миллионов и более) соматических зародышей в условиях in vitro используется для разработки технологии массового и непрерывного получения «искусственных» семян. Более того, метод клонального микроразмножения может быть с успехом использован для создания синтетических сортов. К настоящему времени число видов, которые можно клонировать «в пробирке», уже составляет около одной тысячи.

Преимуществами данного метода по сравнению с традиционными являются:

· значительно более высокие коэффициенты размножения (можно получить до 100.000- 1.000.000 мериклонов в год, тогда как при обычном размножении - 5-100 растений за тот же срок;

· миниатюризация процесса, приводящая к экономии площадей, занятыми маточными и размножающимися растениями;

· оздоровление растений от грибных и бактериальных патогенов, вирусов, микоплазменных, вироидных и нематодных инфекций;

· возможность размножения и ускорения растений, размножение которых затруднено обычными способами.

Хотя метод микроклонального размножения растений является довольно трудоёмким и затратным, в ряде случаев на его основе уже стало возможным создавать экономически рентабельные технологии [5].

1.3 Культура изолированных зародышей

Метод выращивания изолированных зародышей на искусственной питательной среде успешно развивается, начиная с работ Ханнинга, проведенных еще в 1904г. Различают выращивание на искусственной питательной среде зародышей из зрелых семян и зародышей из незрелых семян, изолированных на ранних фазах развития.

В первом случае зародыши чаще всего полностью дифференцированы.Изолирование их и выращивание на искусственных средах служит целям изучения потребностей их в элементах питания. Особенно интересно для ученых выяснить роль в питании зародыша веществ, поступающих из других частей семени - или усваиваемых им прямо из питательного субстрата. Это физиологическое направление в выращивании изолированных зародышей можно дополнить изучением состояния покоя зародыша может быть непродолжительным, а может требовать применение специальных приемов обработки семян, таких, как стратификация (воздействие пониженных- 2-5? - температур) в течение продолжительного времени. Выращивание в стерильных условиях на искусственной питательной среде дает в этом случае возможность применить различные вещества для преодоления состояния состояние покоя и стимулирования роста зародыша. Изучение потребности растений в низких температурах для их дальнейшего развития также можно провести на изолированных зародышах. Практическое значение культуры изолированных зародышей из зрелых семян заключается в ускорении получения растений из трудно прорастающих семян. Семена ирисов имеют длительный период покоя и прорастают в течение 2-3 лет. Выращивание изолированных зародышей без эндосперма и покровов семени, которые и вызывают задержку прорастания семян, позволяет ускорить развитие растений. Для вычленения зародышей обычно используют набухшие семена. Их стерилизуют, иногда дополнительно обжигают в пламени спиртовки, а затем в стерильных условиях препарируют и выделяют зародыш.

Работа с изолированными зародышами из зрелых семян относительно проста и может быть организованна в любой лаборатории селекционной станции. Труднее работать с зародышами, изолированными на ранних стадиях развития из незрелых семян. Значительно меньшие размеры самого зародыша и органов из которых он вычленяется, создают технические трудности. Но наиболее сложным в этом случае является подбор питательных сред, которые должны обеспечить развитие зародыша до состояния, которое он имеет в зрелом семени, его прорастание и рост.

Требование к веществам высокой физиологической активности, которые вносят в питательную среду, неодинаковы на разных стадиях зародыша. В зависимости от природы растения, питательные среды могут значительно отличаться по составу, но почти во всех случаях, кроме минерально-сахарной основы, в их состав включают эндоспермы из незрелых семян разных растений, набор аминокислот, витамины и гормоны- ауксины, цитокинины (кинетин, 6-бензиламинопурин) и гиббереллины.

1.4 Биология вида Ириса Низкого 2(V) D

1.4.1 Систематика

Отдел: Покрытосеменные, или Цветковые растения

(Angiospermae, Anthophyta, или Magnoliophyta)

Порядок:

Семейство: Ирисовые или Касатиковые(Iridaceae, или )

Род: Ирис(Iris )

Вид: Ирис низкий (Iris pumila 2(V) D .)

1.4.2 Описание вида Iris pumila 2(V) D -

Касатик низкий

Невысокий (8-15см) травянистый короткокорневищный многолетник, степной геофит. Листья мечевидные, сизовато-зеленые. Цветки одиночные, на коротких цветоносах, желтые, фиолетовые, синие. Компонент типчаково-ковыльных степей. Трубка околоцветника тонкая, далеко выступающая над прицветниками, в 3-5 раз длиннее завязи, наружные доли околоцветника сверху у основания с бородкой, вниз отогнутые, продолговато-эллиптические, уже и несколько короче внутренних долей, обратнояйцевидных, внезапно суженных в ноготок; надрезы у верхней губы острые. Плод - трехгранная заостренная коробочка. От касатика безлистного (L. aphyllci L.) отличается тем, что у последнего стебель превышает мечевидные листья, цветков от 1 до 3, один верхушечный, доли околоцветника почти равные, с округленной верхушкой, нити тычинок почти равные пыльникам, завязь на ножке, равной ей по длине, 3-гранная. На территории обширного ареала распадается на несколько трудно распознаваемых по морфологическим признакам рас, возможно, подвидов. В Красной книге РФ.

1.4.3 Из истории

Ирис имеет плоские, как лезвие ножа листья. По этой причине немцы прозвали его «меч-лилия». Русское название ириса звучит очень ласково: «касатик». В переводе с латинского «ирис» означает «радуга». Последнее название обусловлено очень разнообразной окраской цветков. Они могут быть темно-фиолетовыми, светло-фиолетовыми, белыми, розовыми, желтыми, карминными, огненно-красными. Насчитывают около 300 оттенков цветков ирисов. Так, что вовсе не случайно эти растения олицетворяют радугу. По преданию, Меркурий и очаровательная Ирис провожают души усопших по семицветной радуге в страну вечного мира, жилище блаженных, украшенное вечнозеленым кипарисом. По этой причине, по-видимому, ирис считался символом мира и спокойствия. А вот в Древнем Египте он воспринимался как символ красноречия. Известно очень большое количество (более 30 тыс.) сортов культурного ириса, которые разводятся как прекрасные декоративные растения. Разнообразия окраски цветков ириса, их очень приятный нежный аромат, напоминающий запах цветков орхидей, декоративная зелень листьев, сохраняющихся до глубокой осени, - все это способствует широкой популярности растений. Существуют общества любителей ирисов и специальные журналы, посвященные культивированию этих высокодекоративных растений. Наиболее красивые и ароматные ирисы выращивались во Флоренции. Герб этого города несет изображение любимого цветка флорентинцев. Интересно отношения к ирису в Японии. 5 мая в Японии - день мальчиков, в этот день наряду с ветками дуба всюду можно встретить изображение ирисов, поскольку оба растения считаются олицетворением мужественности. Во время массового цветения, обычно в июне, по всей Японии совершается «ханами» - ритуальное созерцания цветов. Основная цель этого ритуала - вызвать в душе человека чувство радости, восхищения перед красотой жизни. Ирисы ценятся не только за красоту. При медленной сушке корневища некоторых видов (германского, бледного и флорентийского) приобретают аромат фиалки, так содержат душистое вещество «ирон» с запахом фиалки. По этой причине в народе их называют фиалковым корнем, который нередко используется при изготовлении зубных порошков, духов, одеколонов. Им ароматизируют кулинарные изделия, ликеры, вермуты, уксус. В Японии, Пакистане и США из волокнистых листьев некоторых ирисов вяжут веревки, делают щетки и грубые ткани. Из корневищ многих ирисов можно получить крахмал, а из цветков - зеленые чернила и так называемую ирисовую зелень - краску для живописи по слоновой кости.

1.4.4

2. Место и время проведения исследований

2.1 Место проведения исследований

Работа проводилась поэтапно

1) Материал для лабораторных исследований отобран на территории Волгоградской области, западной части Калачевского района, на правом

берегу реки Дон, к югу от моста через реку, в балке Красной.

2)На базе лаборатории биотехнологии растений ГУ «Волгоградский региональный ботанический сад». Эта лаборатория единственная в Волгоградской области, которая занимается проблемами микроклонального размножения растений. На базе лаборатории ведутся работы по созданию семенного банка, банка культур in vitro всего Южного Федерального округа.

2.2 Время проведения исследований

Май - июнь 2007 года - полевые сборы.

Август - октябрь 2007 года - лабораторные исследования.

Октябрь 2007 года - анализ и оформление работы.

2.3 Методика проведения исследований

В качестве исходного материала были использованы изолированные зародыши. Использовать в качестве первичных эксплантов побеги или листья-неудобно. Методика исследований базировалась на общепринятых классических приемах с культурами изолированных тканей и органов растений Зародыши высаживали на безгормональную питательную среду с минеральной основой по прописи Мурасиге-Скуга , на которой образовывались проростки. Далее их делили на фрагменты и пересаживали на модифицированные питательные среды для получения пролиферирующей культуры.

В условиях in vitro растения культивировали в чашках Петри и биологических пробирках при освещении с интенсивностью 3-5 клк, при 16-часовом фотопериоде, температуре 24 С и относительной влажности воздуха 70%.

Статистическая обработка данных проводилась по методике Б.А. Доспехова .

2.4 Оборудование

· Аналитические весы

· Пробирки

· Скальпели

· Пинцеты

· Линейка

· Песочные часы

· Чашки Петри

· Спиртовка

· Автоклав

· Штатив

· Фильтровальная бумага

2.5 Личный вклад

Автор работы принял личное участие в сборе полевого материала и лабораторных исследованиях под руководством научного сотрудника ГУ « Волгоградский региональный ботанический сад» Ю.Б. Утц и благодарит за предоставленную возможность проведения исследований директора ГУ «Волгоградский региональный ботанический сад» О.И. Короткова.

2.6 Результаты исследований и обсуждение

В качестве первичного материала для введения в культуру in vitro нами были использованы изолированные зародыши.Предварительно обрабатывали их 95%-ным этиловым спиртом в течение 50-60 секунд. В качестве стерилизатора использовали 3%-ый «Лизоформин» (действующие вещества: глутаровый альдегид, глиоксаль и дидецилдиметиламмоний хлорид). «Лизоформин» применяется для дезинфекции медицинских изделий и обладает не только бактерицидными, фунгицидными и спороцидными, но и вирулицидными свойствами, что является важным моментом для получения стерильных эксплантов.

О О

С-СН₂-СН₂-СН₂-С

Н Н

Глутаровый альдегид С-С Сl^-

Н Н С₁₀Н₄ + СН₃

Глиоксаль N

С₁₀Н₄ СН₃

дидецилдиметиламмоний хлорид

Схема 1. Молекулярная структура действующих веществ Лизоформина.

Оптимальное время стерилизации 7-10 мин. Поверхностно простерилизованные и промытые семена высаживали в чашки Петри на агаризованную питательную среду Мурасиге - Скуга без добавления фитогормонов. Основная часть семян прорастала на 7 - 10-е сутки, остальные на 13 - 15 сутки с момента помещения их на питательную среду. Полученные проростки в асептических условиях расчленяли на фрагменты и переносили для роста и размножения на питательную среду Мурасиге - Скуга с добавлением 0.5 мг/л 6-БАП.

Для оптимизации состава среды на этапе микроразмножения к питательной среде, содержащей минеральные соли по Мурасиге и Скугу, добавляли в различных концентрациях 6-БАП (0.1; 0.5; 1.0 мг/л), зеатин (0.1; 0.5; 1.0 мг/л), кинетин (1.0; 2.0; 5.0 мг/л) и для вытягивания побегов гибберелловую кислоту (0.2 и 0.4 мг/л). При этом снимались следующие показатели:

1. Коэффициент размножения - количество растений, развившихся из одного экспланта;

2. Количество аномальных (витрифицированных) растений;

3. Количество листьев;

4. Высота растения.

Таблица №1. Влияние гормона зеатина на регенерацию и рост побегов Майкарагана волжского.

1-ая повторность

2-ая повторность