59

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ОЦЕНКА СТРАТЕГИЙ РАЗМНОЖЕНИЯ И ПОДДЕРЖАНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ООМИЦЕТА PHYTOPHTHORA INFESTANS В СВЯЗИ С СОВРЕМЕННЫМИ МЕТОДАМИ ЗАЩИТЫ КАРТОФЕЛЯ И ТОМАТА ОТ ФИТОФТОРОЗА

1. Общая характеристика работы

Назначение и структура работы

Актуальность работы. Фитофтороз остается одной из самых опасных болезней картофеля и томата, не смотря на многолетние разноплановые мероприятия по их защите. Прямые потери урожая картофеля и томата от фитофтороза в полевых условиях достигают до 70 и 100% соответственно. По данным Института Картофелеводства НАН Беларуси и ВНИИКХ имени А.Г. Лорха за период с 1924 по 2009 г. 41 год из 85 лет характеризовались высоким развитием фитофтороза. Прямые потери картофеля от фитофтороза достигают 4 млн. тонн (около 15% по урожаю, до 40 млн. рублей в стоимостном отношении). Потери томата от фитофтороза в Средней полосе России достигли критических величин. И ЛПХ, и хозяйства за последние годы отказываются выращивать томат из-за «побурения» плодов.

С середины 1990_ых годов наблюдается последующее усиление вредоносности фитофтороза. Это часто связывают с появлением половой стадии возбудителя. На фоне увеличивающейся встречаемости ооспор патогена наблюдают существенное увеличение агрессивности патогена и его устойчивости к применяемым системным, трансламинарным, и контактным фунгицидам. В этой связи, определение стратегий размножения и поддержания жизнеспособности популяций патогена, чему и посвящена настоящая работа, сейчас приобретает принципиальное значение.

Цель работы - оценить жизнеспособность полевых популяций возбудителя фитофтороза, направленная на получение оперативных характеристик патосистемы картофель - томат - P. infestans для оптимизации защитных мероприятий на этих культурах против фитофтороза.

Задачи работы

для разработки системы оценки жизнеспособности и агрессивности полевых популяций P. infestans

1. Изучить потенциал бесполого размножения и агрессивность изолятов P. infestans из России и одного из основных центров происхождения заболевания - Мексики.

2. Изучить встречаемость структур полового размножения - ооспор в полевых популяциях P. infestans из различных регионов России на картофеле и томате.

3. Оценить морфологические особенности, жизнеспособность, способность к прорастанию, и инфекционное значение ооспор P. infestans с учетом их различного происхождения - гибридного, партеногенетического и от самооплодотворения.

4. На основе традиционных подходов к учетам возбудителя фитофтороза и полученных нами данных разработать новую комплексную методологию, позволяющую оценивать репродуктивные характеристики и агрессивность полевых популяций патогена.

по использованию разработанной системы оценки для решения

научно-теоретических проблем, связанных с изучением био-экологических особенностей современных популяций P. infestans

5. Использовать разработанную систему оценки для получения первичных характеристик полевых популяций P. infestans в пространстве и времени.

6. Оценить роль томата в связи с возможными сценариями развития эпифитотии фитофтороза на картофеле.

по использованию разработанной системы оценки для решения

практических проблем, связанных с совершенствованием подходов

защиты картофеля и томата от фитофтороза

7. Определить уровень устойчивости и наличие адаптивной устойчивости в современных полевых популяциях P. infestans к фунгицидам.

8. Использовать разработанную систему оценки для определения сравнительной эффективности химического и селекционно-семеноводческого методов защиты картофеля от фитофтороза.

Научная новизна работы. Проведена оценка различных характеристик ооспор P. infestans - их встречаемость в природных популяциях патогена, морфология, образование в результате перекрестного оплодотворения, самооплодотворения и партеногенеза, сохранение жизнеспособности, способность к прорастанию и эпидемиологическое значение.

Разработана система оценки, позволяющая определять стратегии размножения и поддержания жизнеспособности полевых популяций P. infestans. Она может быть очень полезна как при проведении популяционных исследований патогена, так и при полевых обследованиях посадок картофеля и томата, пораженных фитофторозом. Полученные данные характеризуют накопление структур первичной и вторичной инфекции патогена и, таким образом, могут быть использованы для прогнозирования развития заболевания.

На основе изучения патосистемы картофель - томат - P. infestans pазработана модель развития эпифитотии на местном успешно адаптированном виде при условии последовательного внедрения родственного восприимчивого неприспособленного вида-интродуцента.

Практическая значимость работы. Разработана новая система оценки, позволяющая определять полевую устойчивость сортов картофеля и томата к фитофторозу, а также эффективность защитных мероприятий в условиях конкретного агроценоза.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Новая научно-обоснованная система оценки развития фитофтороза в полевых условиях, сочетающая в себе подходы, применяемые в полевых учетах и лабораторных исследованиях.

2. Мультивариантность образования и дальнейшего развития ооспор P. infestans при различных природных и производственных условиях.

3. Наличие на томате штаммов P. infestans, высокоагрессивных по отношению к сортам картофеля со значительным уровнем полевой устойчивости.

4. Отсутствие ожидаемой отрицательной взаимосвязи между устойчивостью как к системным, так и к контактным фунгицидам, и агрессивностью по отношению к растениям-хозяевам у отдельных штаммов P. infestans.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 19 конференциях: конференции «Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии», Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова (1998); Х Московском совещании по филогении растений. Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова (1999); молодежной конференции ботаников в Ботаническом институте, Санкт-Петербург (2000); научных конференциях в РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (2000, 2002, 2007, 2009 г.); научной конференции «Памяти Грегора Менделя», Москва, ИОГен (2001); международном симпозиуме «Проблемы изучения и сохранения биоразнообразия европейских природных сообществ, Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова (2001); 7_м международном микологическом конгрессе, Осло (2002); первой и второй всероссийских конференциях «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам», Санкт-Петербург (2002, 2008); всероссийской научно-практической конференции «Ставропольский государственный аграрный университет - 75 лет» (2004); юбилейной конференции, посвящённой 85_летию кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В. Ломоносова (2004); втором всероссийском съезде по защите растений в Санкт-Петербурге (2005), конференции «Грибы и водоросли в биоценозах», Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова (2006); международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент отечественного и мирового сельского хозяйства», РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (2007); 60_м международном симпозиуме по защите растений, Бельгия, Гентский университет (2008); третьей научной конференции «Микология, микотоксикология и микозы», Сербия, Нови Сад (2009).

Публикации. Основные результаты исследований представлены в 49 публикациях, 16 из них - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 427 страницах. Содержит вводную (3 главы), информационно-аналитическую (1 глава), экспериментальную (6 глав), и заключительную (3 главы) части; а также 2 приложения (4 страницы). Содержит 90 таблиц и 65 рисунков. Список литературы включает 1324 наименования, в том числе 956 иностранных.

Участие в работе. Работа выполнена непосредственно соискателем и представляет собой завершенный научный труд. В выполнении экспериментальной части работы принимали участие аспиранты и студенты кафедры фитопатологии РГАУ-МСХА. Большую помощь оказал С.А. Кузнецов. Автор признателен зав. кафедрой фитопатологии РГАУ-МСХА профессору В.А. Шкаликову за создание условий для проведения работы, своему учителю заведующему кафедрой микологии и альгологии МГУ имени М.В. Ломоносова профессору Ю.Т. Дьякову, профессору ВНИИ карантина растений С.С. Ижевскому и профессору ВНИИ овощеводства К.Л. Алексеевой за консультации.

Введение

В этой главе детально разбирается актуальность тематики работы. Отмечается, что P. infestans привлекает свое внимание как модельный объект. Полученные данные применимы и для других паразитов растений. В работе исследуется комплекс взаимосвязанных вопросов, имеющих как научно-теоретическое, так и практическое значение. В связи с преодолением полевой устойчивости сортов картофеля и томата это изучение агрессивности патогена, в связи с массовым применением против фитофтороза фунгицидов - уточнение уровня устойчивости к ним P. infestans. Усиление агрессивности и устойчивости к фунгицидам может в ряде случаев определяться влиянием половой стадии возбудителя фитофтороза. На основе ее изучения создана и применена на практике комплексная методика, позволяющая оценивать стратегии размножения и поддержания жизнеспособности патогена. Наконец, детально проанализированы причины острой фитосанитарной ситуации, сложившейся в ряде регионов России на томате из-за поражения фитофторозом.

Характеристики патосистемы картофель-томат - P. infestans

Рассмотрены ботанические характеристики растений-хозяев. Охарактеризованы основные направления селекции картофеля (Симаков и др., 2005) и томата (Гавриш, 2005). Приводятся основные этапы изучения P. infestans и фитофтороза. Анализируются достижения мировых школ по изучению P. infestans. Далее в работе рассматриваются бесполая фаза и cистема скрещивания P. infestans. Анализируются работы о регуляции полового процесса, осуществляемой посредством «веществ совместимости» и половых гормонов (Leal et al., 1964; Ко, 1978; Elliott, 1983; Brasier, 1992; Kemmit, 1992). В настоящее время жизнеспособные ооспоры P. infestans встречаются во многих странах.

Разбираются вопросы, связанные с популяционной биологией P. infestans и миграционной теорией. Анализируются достоинства и недостатки последней. Также приводится анализ различий между популяциями P. infestans на картофеле и томате.

Проанализированы методы защиты картофеля и томата от фитофтороза.

Исследования прорастания зооспорангиев и агрессивности P. infestans из России и Мексики

Бесполое спороношение P. infestans играет основную роль во вторичном инфицировании картофеля и томата (Попкова, 1972). Поэтому изучение прорастания зооспорангиев и агрессивности популяций имеет большое значение в научном и в практическом аспектах.

Материалы и методы. В исследовании использовали 13 изолятов P. infestans с разными типами спаривания, выделенных с картофеля и томата в 2004 на Валдае и в Лаборатории защиты растений РГАУ-МСХА. Также в исследовании использовали 25 штаммов P. infestans из коллекции 1997 г. исследовательского центра Pictipapa при Минсельхозе Мексики (долина Толука, г. Метепек). Они охарактеризованы по типам спаривания, а также по изоферментным локусам Gpi и Pep_1. Для определения агрессивности мексиканских изолятов использовали сегменты листьев восприимчивого сорта картофеля Альфа, российских изолятов - диски клубней восприимчивого сорта Сантэ и устойчивого сорта Луговской (Филиппов, 2005). Подробнее методика описана в работах А.Н. Смирнова (Смирнов, 2008). Статистический анализ проводили посредством сравнения распределения рангов в изучаемых выборках на основе определения ?² (Глотов и др., 1982).

Результаты. Российские изоляты. При 7^о С прорастание зооспорангиев было непрямым (зооспорами), при 20 и 25^о С - прямым (ростковыми трубками).

При 20^о С зооспорангии изолятов P. infestans (особенно А2) прорастали в среднем на 28% эффективнее, чем при 25^о С. Различий по прорастанию зооспорангиев изолятов, выделенных с картофеля и томата, не выявили.

Изоляты P. infestans продемонстрировали довольно разный диапазон показателей агрессивности на клубневых дисках сорта Сантэ. По всем показателям выявили высоко агрессивные, умеренно агрессивные и мало агрессивные изоляты. Клубневые диски сорта Луговской поразились довольно слабо всеми исследуемыми изолятами P. infestans. Исключением были изоляты Д2 (с томата), а также К2.8 и С5.1 (с картофеля). Изолят Д2 поразил клубневые диски сорта Луговской даже лучше, чем Сантэ.

Достоверных различий по агрессивности между изолятами с типами спаривания А1 и А2 не было обнаружено. В целом, изоляты, выделенные с картофеля, были несколько агрессивнее к клубневым дискам сорта Сантэ, чем изоляты, выделенные с томата. На клубневых дисках сорта Луговской показатели агрессивности были на низком уровне для обеих групп изолятов, и различий между ними не обнаружили.

Определяющий вклад в итоговый индекс агрессивности (ИИА) вносят такие компоненты как интенсивность спороношения, размер некрозов и латентный период (табл. 1). Напротив, такие компоненты как частота инфекции и инкубационный период не влияли на ИИА.

Таблица 1. Коэффициенты корреляции между компонентами агрессивности на клубневых дисках сортов Сантэ (слева от диагонали) и Луговской (справа от диагонали)

Примечание: ЧИ - частота инфекции; РН - размер некрозов; ИС - интенсивность спороношения; ИП - инкубационный период; ЛП - латентный период;

ИИА - итоговый индекс агрессивности.

Корреляционный анализ не выявил достоверных взаимосвязей между прорастанием зооспорангиев при разных температурах и компонентами агрессивности. Исключением была лишь довольно хорошая корреляция между прорастанием зооспорангиев при 25^о С и интенсивностью спороношения на клубневых дисках сорта Луговской.

Мексиканские штаммы. При 7^о С у большинства штаммов было зарегистрировано только непрямое прорастание зооспорангиев с образованием зооспор, с разной интенсивностью. При 20^о С наблюдалось прямое прорастание 5 - 10% зооспорангиев штаммов. При 25^о С у всех штаммов отмечалось только прямое прорастание до 10% зооспорангиев.

Прорастание зооспорангиев у большинства изученных штаммов при 25^о С было в среднем на 19% эффективнее, чем при 20^о С.

У штаммов с типами спаривания А1 и А2 не выявлено различий в прорастании зооспорангиев при 7^о С. Однако при 20^о и 25^о С штаммы с наиболее высокой интенсивностью прорастания зооспорангиев относились к типу спаривания А1. Прорастание зооспорангиев у штаммов, собранных в начале и в конце вегетации, было на одинаковом уровне. В прорастании зооспорангиев при исследуемых температурах существенных различий между штаммами с аллелями Gpi 86, штаммами с аллелем Pep_1 92 и штаммами без этих аллелей выявлено не было. Лишь штаммы с аллелем Pep_1 92 (генотип 92/100) уступали штаммам без этого аллеля (генотип 100/100) при 7^о С.

Из 25 проверенных штаммов 5 были высоко агрессивны, 11 умеренно агрессивны, 9 мало агрессивны, 2 неагрессивны. Штаммы P. infestans А1 и А2 типов спаривания были сходными по большинству компонентов. Лишь по ИС штаммы А1 превосходили штаммы А2 (табл. 2).

Таблица 2. Сравнение средних значений и распределений (рангов с низкими, средними и высокими значениями) по компонентам агрессивности для штаммов P. infestans типов спаривания А1 и А2, собранных в начале и конце вегетации, по критерию ?²

Примечания: см. табл. 1. При P=0,05 и 6 степенях свободы предельное значение ?² 12,6.

Существенных различий по компонентам агрессивности между штаммами с аллелем Gpi 86, и штаммами без этого аллеля выявлено не было. Напротив, по большинству компонентов агрессивности штаммы, имеющие аллель Pep_1 92 достоверно уступали штаммам, не имеющим этого аллеля.

Достоверная корреляция (r=0,62±0,13) была выявлена только между прорастанием зооспорангиев при температурах 20^о и 25^о С. Между прорастанием зооспорангиев при 7^оС и других температурах корреляции выявлено не было. Проведенный корреляционный анализ показал, что компоненты РН, ИС и ИИА хорошо коррелировали между собой.

Корреляции выявили только между прорастанием зооспорангиев при 7^о С и компонентами агрессивности, исключая инкубационный и латентный периоды. Достоверную корреляцию установили, однако, только для размера некрозов (r=0,64±0,12). Между прорастанием зооспорангиев при температурах 20^о С или 25^о С и компонентами агрессивности корреляции выявлено не было.

По всем компонентам агрессивность штаммов P. infestans была значительно (в 1,5-17 раз) выше при 20^о С, чем при 12^о С. При 12^о С штамм «старого типа» значительно уступал почти по всем компонентам агрессивности самому себе при 20^о С. Если при понижении температуры штаммы с эндемичными и рекомбинантными генотипами теряли агрессивность в 6-17 раз, то штамм «старого типа» - в 9 раз.

Обсуждение результатов. У многих мексиканских штаммов P. infestans прорастание зооспорангиев было выше при 25^о С по сравнению с 20^о С. Напротив, у большинства российских изолятов P. infestans прорастание зооспорангиев было выше при 20^о С. Это можно объяснить климатическими различиями подмосковного региона и долины Толука.

В целом, не выявлено существенной связи между компонентами агрессивности, измеренной при температуре 20-21^о С и прорастанием зооспорангиев. Показано, что агрессивность P. infestans связана с интенсивностью образования зооспор лишь в некоторой степени.

Ни предшествующие, ни наши результаты не свидетельствуют о полном вытеснении штаммов «старого типа» (с типом спаривания А1 и генотипом 86/100 по изоферментному локусу глюкозо_6 фосфат изомераза или Gpi_1) другими штаммами (с типом спаривания А1 или А2 без аллеля 86 по Gpi_1) за счет различий по компонентам агрессивности. Есть основания полагать, что на замещение генотипов по Gpi повлиял внешний фактор - применение против фитофтороза металаксил-содержащих фунгицидов (Gisi, Cohen, 1996; Иванюк и др., 2005; Смирнов, 2007b; 2007c).

Чувствительность российских изолятов P. infestans к фунгицидам, часто применяемым против фитофтороза картофеля и томата

Для оомицетов первые свидетельства адаптивной устойчивости к фунгицидам из фениламидной группы были получены в начале 1980_ых годов (Bruin, Edgington, 1981). Также с середины 1990_ых годов против фитофтороза начали использовать Ширлан, Амистар (Квадрис), Акробат и Браво (Cook et al., 1995; 1999; www.syngenta.com; Kuhn et al., 1991; Albert et al., 1991; 2002). Эти препараты важны для совершенствования стратегий антирезистентности, активно применяемых на практике.

Диффузное развитие мицелия P. infestans в растении (в стебле) может продлиться до 1-2 месяцев (Keay, 1953; 1954a; Kable, MacKenzie, 1980; Harrison, 1992; Lapwood, 1977). Замедление развития мицелия может быть связано с периодами засушливых погодных условий. В случае применения фунгицидов, это может быть связано и с тем, что концентрация современных фунгицидов после обработок может быть существенно ниже в стебле, чем в ботве (Hamm et al., 2006) и мицелий в стебле будет сохранять свою жизнеспособность (Kapsa, 2000). В этой связи представляет интерес, изменится ли чувствительность мицелия к фунгицидам в зависимости от его возраста.

Материалы и методы. Для анализа чувствительности к Ридомилу (д. в. металаксил), Ширлану (д. в. флуазинам), Амистару (д. в. азоксистробин), Акробату (д. в. диметоморф), и Браво (д. в. хлороталонил) использовали 182 изолята P. infestans из различных регионов России (Москва, Московская область, Новгородская область, регионы Кавказа), выделенных с 1998 по 2004 г. Часть изолятов была из коллекций С.Н. Еланского (МГУ имени М.В. Ломоносова), другую часть - из коллекции РГАУ-МСХА. В экспериментах по изучению изменения чувствительности к фунгицидам использовали 5 изолятов P. infestans из ЛЗР РГАУ-МСХА (Д3.2, Д13, и ДТП10.1) и Новгородской области (Валдай; ВалС13, ВалС15). Эти изоляты представляют полевые популяции патогена, против которых на протяжении многих лет использовали различные фунгициды. Более подробно методы рассмотрены в работе А.Н. Смирнова и Ю.С. Троицкой (Смирнов, Троицкая, 2008). Для каждого изолята по отношению к каждому из исследуемых фунгицидов определяли: 1) минимальную [порядковую] подавляющую концентрацию, 2) минимальную [порядковую] сдерживающую концентрацию.

Чувствительность к фунгициду определяли как (1 - (д_ф/д_к))·100%, где д_ф и д_к - диаметры колоний на среде с фунгицидом и в контроле соответственно. Отрицательные показатели означали, что изолят на среде с фунгицидом рос лучше, чем в контроле. Формула взята из работы В. Умэруса (Umaerus, 1984) и адаптирована для определения чувствительности к фунгицидам изолятов P. infestans

Результаты. Наименьшей минимальной порядковой концентрацией (10^-4%), подавляющей большое количество (не менее 25%) изолятов P. infestans, характеризовался фунгицид Акробат. Далее располагались фунгициды Амистар (10^-4, 10^-3%), Ридомил (10^-3%), Браво (10^-2, 10^-1%) и Ширлан (10^0%).

Кластерный анализ порядковых концентраций 5 фунгицидов, подавляющих рост различных изолятов P. infestans, выявил умеренное сходство между эффективностью системного фунгицида Ридомил и ограниченно системного трансламинарного фунгицида Амистар. Остальные фунгициды кластеризовались независимо (рис. 1).

Наименьшей минимальной порядковой концентрацией (10^-5%), сдерживающей большое количество (не менее 25%) изолятов P. infestans, характеризовался фунгицид Ридомил. Далее в порядке возрастания располагались фунгициды Акробат (10^-5, 10^-4%), Амистар (10^-4%), Браво (10^-3, 10^-2%) и Ширлан (10^-2%).

Кластерный анализ порядковых концентраций 5 фунгицидов, сдерживающих рост различных изолятов P. infestans выявил довольно высокое сходство по эффективности ограниченно системных фунгицидов Акробат и Амистар, а также контактных фунгицидов Браво и Ширлан (рис. 2).

Изменения чувствительности к сублетальным концентрациям фунгицидов Ширлан и Амистар у исследуемых изолятов была различной. У изолятов Д2 и Д13.2 наблюдали как уменьшение, так и увеличение чувствительности. У изолята ДТП10.1 чувствительность в основном возрастала, у изолятов ВалС13 и ВалС15 - не изменялась (табл. 3).

Рисунок 1. Дендрограмма сравнения фунгицидов по концентрациям, подавляющим изоляты P. infestans

Рисунок 2. Дендрограмма сравнения фунгицидов по концентрациям, сдерживающим изоляты P. infestans

Таблица 3. Возраст исходных культур (в сутках) изолятов P. infestans, для которых отмечена наименьшая чувствительность к фунгицидам

¹ возраст культур с наименьшей чувствительностью установлен достоверно, P>0,99;

² возраст культур с наименьшей чувствительностью установлен на уровне тенденции, P>0,65;

³ возраст, при котором отмечена наименьшая чувствительностью культур, не установлен, P<0,65.

При последовательном пассировании на средах с Ширланом при втором пассаже рост был крайне ограничен, с развитием прижатого мицелия, на третьем пассаже способность к росту терялась у всех изолятов P. infestans. На средах с Амистаром такой результат наблюдали для изолятов ДТП10.1 и ВалС13. У изолята Д13 происходило существенное повышение чувствительности. Напротив, у изолята ВалС15 чувствительность к Амистару значительно не изменялась. На средах с Ридомилом выявили разные направления изменения чувствительности.

При перекрестном пассировании наблюдали резкое повышение чувствительности, если использовали среды с Ширланом (для всех изолятов) или Амистаром (для всех изолятов, кроме ВалС15). Если при первом и / или втором пассаже использовали среды с Ридомилом, то во многих случаях наблюдалось понижение чувствительности. Наименее эффективными последовательностями фунгицидов оказались: РидомилРидомилАмистар, РидомилАмистарРидомил. Однако было выявлено несколько исключений. Так, изолят ВалС15 резко понизил чувствительность к Ширлану после двух пассажей на среде с Амистаром. Изоляты ВалС13 и ВалС15 понизили чувствительность к Амистару после двух пассажей на среде с Ридомилом. Изоляты Д13 и ВалС15 понизили чувствительность к Амистару после пассажей на средах с Ридомилом и Ширланом.

Обсуждение результатов. Наше исследование четко показало, что популяции P. infestans включают группы штаммов с разной устойчивостью к фунгицидам. Наличие штаммов с повышенной устойчивостью к одному или двум фунгицидам (в том чиле и контактным) - это потенциальная опасность для стратегий антирезистентности. Также важно отсутствие обратных корреляционных взаимосвязей между агрессивностью и устойчивостью к различным фунгицидам.

По мере инкубации изолятов P. infestans определенной тенденции изменения чувствительности к фунгицидам выявлено не было. В полевых условиях преимущество могут получить изоляты, способные не уменьшать определенный уровень толерантности к фунгицидам до начала обработок.

Ооспоры P. infestans

Изучая ооспоры P. infestans, мы стремились изучать их в природе, в растениях-хозяевах, инфицированных естественным путем, и учитывали, что ооспоры могут иметь гибридное и негибридное происхождение.

Материалы и методы. 90 популяций P. infestans (групп природных образцов растений-хозяев, пораженных фитофторозом, собранных в одном месте в течение одного вегетационного сезона) исследовали на встречаемость в них ооспор. Популяции образцов собирали в 14 регионах России: Москве, Московской, Ленинградской, Новгородской, Ярославской, Тульской, Брянской, Калужской, Тамбовской, Рязанской и Томской областях, Мордовии, Северном Кавказе, Ставропольском крае в 1997-2008 г. Количество собираемых образцов (листьев картофеля, листьев томата или плодов томата) зависело от размера изучаемой популяции: от 4 (из несколько растений-хозяев) до 80-100 (из довольно крупных массивов. Методы работы с ооспорами рассмотрены в работах А.Н. Смирнова и С.А. Кузнецова (Смирнов, Кузнецов, 2006).

Результаты. Ооспоры обнаружили как в листьях картофеля, так в листьях и в плодах томата. Их встречаемость была неодинаковой (?² = 398,0 при 6 степенях свободы; критическое значение ?² =12,6). Количество образцов листьев картофеля с ооспорами было низким, листьев томата - выше. Самым большим было количество образцов плодов томата с ооспорами (табл. 4).

Таблица 4. Встречаемость образцов с ооспорами P. infestans

Редкая встречаемость - не более 25 ооспор, умеренная - 26-250 ооспор, частая - более 250 ооспор в 50 полях зрения микроскопа (1 мм²).

По четырем исследуемым признакам (диаметр, толщина стенки, наличие антеридия и форма оогония) в образцах 1999 г. выявили 40 морфологических типов ооспор. Среди них выявлено две большие группы. Первая представлена ооспорами типичной морфологии. Их диаметр (21 - 40 мкм) и форма (тяготеющая к шаровидной) были близки к типовым показателям (рис. 3). Вторая представлена ооспорами нетипичной морфологии (рис. 4). Их размер (15 - 20 мкм или 41 - 55 мкм) или форма (уклоняющаяся от шаровидной) отличались от характеристик ооспор типичной морфологии.

Анализы морфологии обнаруженных ооспор и соотношения типов спаривания мицелиев, их образующих, показали, что около 61% (от 31% до 83%) всех обнаруженных ооспор в 1999 г. имели негибридное происхождение. Доля гибридных ооспор составила лишь 2% (от 0% до 7%). Происхождение остальных ооспор было спорным. Совместное присутствие А1 и А2 в образцах не всегда приводило к образованию в них ооспор.

Добавление фунгицида Ридомил в среду оказывало сильный угнетающий эффект на образование гибридных ооспор.

Определение жизнеспособности ооспор P. infestans до и после перезимовки показало, что после перезимовки большинство ооспор (от 50% и выше) сохранили свою жизнеспособность (табл. 5).

Таблица 5. Количество жизнеспособных ооспор от скрещивания изолятов А1 и А2 на ржано-томатном агаре и в плодах томата, определенная на основе плазмолизного теста, до и после перезимовки

Изучение прорастания ооспор дало следующие результаты.

За месяц инкубации скрещенных изолятов с примесью триходермы в районе скрещивания образовалось много нетипичных ооспор, до 80% которых прорастало короткой ростковой трубкой. Типичные ооспоры почти не прорастали.

Ооспоры от скрещиваний А1 и А2 на ржано-томатной среде и после перезимовки прорастали ростковой трубкой с частотой от 20 до 35%. Природные ооспоры из плодов томата прорастали с частотой, не превышающей 3%.

Дополнительный тест показал, что наибольшее влияние на прорастание типичных ооспор оказала обработка суспензией из мицелия и спор триходермы. Действие отрицательной температуры также усиливало прорастание ооспор.

Инокуляция суспензией ооспор ломтиков картофеля во влажных камерах не привело к их заражению. Нанесение ооспор на прорастающие клубни не привело к заражению выросших растений.

При заражении проростков томата установили, что они могут поражаться фитофторозом через почву, в которой содержатся ооспоры (или зооспорангии) P. infestans в условиях, ослабляющих иммунитет растения. Однако более вероятно, что при этом проростки поражаются комплексом болезней по типу корневых гнилей, поражающих зародышевый корешок и гипокотиль. Фитофтороз входит в этот комплекс.

В полевом эксперименте, при нанесении суспензии ооспор на семенные клубни, массового поражения растений не обнаруживали. Исключением был очаг на сорте Дельфин (Лаборатория защиты растений РГАУ-МСХА, 2006 г.).

Обсуждение результатов. Максимальное количество ооспор мы наблюдали в плодах томата. Справедливо утверждение, впервые сформулированное С.А. Кузнецовым, что в условиях Московской области плоды томата - это своеобразная «маленькая Мексика» (Смирнов, Кузнецов, 2005; Smirnov et al., 2008; Smirnov, Kuznetsov, 2009).

Мы полагаем, что в большинстве современных полевых популяций P. infestans могут образовываться ооспоры всех трех типов по происхождению. Тип образуемых ооспор может в значительной степени регулироваться внешними факторами и условиями существования полевых популяций патогена (Turkensteen et al., 2000). Инфекционный цикл P. infestans включает в себя несколько стратегий (Дьяков, 1992; 1998). Зооспоры и зооспорангии соответствуют r_стратегии (размножение, низкая сопротивляемость), гибридные ооспоры - К-стратегии (жизнеспособность, высокая сопротивляемость) (Дьяков, 1992). Ооспоры от самооплодотворения и партеногенетические ооспоры соответствуют промежуточным стратегиям. Первые ближе к К-стратегии, вторые находятся между r- и К-стратегиями (Смирнов, 2003а).

Проведенные нами лабораторные и полевые эксперименты стали еще одним косвенным подтверждением того, что гибридные ооспоры могут иметь значительное инфекционное значение, которое, однако, может реализовываться не сразу, а в последующих вегетационных сезонах. Прямое исчерпывающее доказательство этого с использованием молекулярно-генетических маркеров RFLP получено в Голландии в начале 1990_ых годов (Drenth et al., 1994).

Образование гибридных ооспор возможно только у жизнеспособных полевых популяций патогена. Самооплодотворение в бесполых полевых популяциях может быть этапом к гибридизации и со временем привести к кардинальным изменениям в генетической структуре полевых популяциях патогена. Вклад партеногенетических ооспор, на наш взгляд, в последние годы недооценивается. В определенных условиях (нежестких) именно партеногенетические ооспоры могут иметь существенное эпидемиологическое значение - вызывать ранние эпифитотии. Особенно это может быть актуально для томата, если такие ооспоры попадут как примесь на поверхность семенной кожуры семян.

Стратегии размножения и поддержания жизнеспособности полевых популяций P. infestans

Соотношение бесполого и полового размножения имеет принципиальное значение в эволюции жизненных стратегий у грибов и псевдогрибов. Функцию размножения и распространения они осуществляют в бесполой фазе.

В этой связи, у P. infestans целесообразно определять и исследовать компоненты долгосрочной и краткосрочной жизнеспособности (рис. 5). Долгосрочная жизнеспособность в природных условиях напрямую определяется половой стадией патогена, краткосрочная - в основном его агрессивностью. Агрессивность увеличивает общий потенциал патогена, но ослабляют его K_потенции (Дьяков, 1992). При проявлении агрессивности на определенных сортах в последние годы выявлена некоторая специфичность (Маторина, личное сообщение; Flier et al., 2002; Макаров и др., 2003; Филиппов и др., 2004).

В основе нашего метода лежит единовременное определение встречаемости ооспор и зооспорангиев в тканях картофеля и томата.

Каждая популяция, каждый штамм P. infestans может характеризоваться определенной агрессивностью. Однако в природе проявление агрессивности специфично корректируется рядом факторов - устойчивостью сортов и климатическими условиями (Young et al., 2004). На восприимчивых сортах при благоприятных для фитофтороза условиях проявление агрессивности P. infestans будет максимальным. На сортах с полевой устойчивостью проявление агрессивности будет сдерживаться (Carlisle et al., 2002; Pillet, 2003; Montarry et al., 2006; Flier et al., 2007).

Наконец, мы исходили из того, что все показатели должны выражаться в баллах, соответствующих определенному рангу. Согласно закону Вебера-Фехнера, ранговая оценка показателей болезни позволит избежать субъективных ошибок (Forbes, Korva, 1994).

Материалы и методы. Использованы те же материалы, как в гл. 6. Обесцвечивание листьев и плодов томата проводили по методике А.Н. Смирнова и С.А. Кузнецова (Смирнов, Кузнецов, 2006). Обесцвеченные в 96% кипящем растворе этанола и 10% водного растворе хлорсодержащего средства образцы микроскопируют. При малом увеличении (около х150) проверяют 50 случайных полей зрения, каждое - примерно 1 мм². При поиске ооспор просматривают 50 полей зрения в тканях образца. При поиске зооспорангиев просматривают 25 полей зрения в тканях образца и 25 полей зрения - в свободном растворе. Если число обнаруженных ооспор или зооспорангиев не превышает 25, находится в интервале от 26 до 250, или превышает 250, то их встречаемость оценивают как редкую, умеренную или частую соответственно.

Далее подсчитывают индексы встречаемости зооспорангиев (ИЗ) и ооспор (ИО) в полевой популяции по формулам: ИЗ = 0,05·РС + 0,5·УС + ЧС, ИО = 0,05·РО + 0,5·УО + ЧO, где: РС - частота встречаемости образцов с редкими зооспорангиями, УС - частота встречаемости образцов с умеренными зооспорангиями, ЧС - частота встречаемости образцов с частыми зооспорангиями, РО - частота встречаемости образцов с редкими ооспорами, УО - частота встречаемости образцов с умеренными ооспорами, ЧО - частота встречаемости образцов с частыми ооспорами, %.

На основе предшествующего кластерного анализа (Смирнов, Кузнецов, 2001) распределения индексов можно выделить 4 основных стратегии размножения (рис. 6, 7): С - слабая, Б - бесполая, П - половая, и Д - двойная.

Распространенность болезни (Р) и индекс развития болезни (И) определяются по стандартным формулам (Попкова, Быченкова, 1969, с изменениями) (Практикум…, 1976): Р = n·100% / N; И = (a_i·b_i) 100% / 5N, где n - число больных растений, a_ib_i - сумма произведений числа больных растений (a_i) на соответствующий им балл интенсивности поражения (b_i): [наименьший балл - 0 (отсутствие поражения), 1 - 0,1-10% растения поражено, 2 - 11-25% поражено, 3 - 26-50% поражено, 4 - 51-89% поражено, 5 (наибольший) - 90-100% растения поражено], N - общее число больных и здоровых растений.

Индекс агрессивности (ИА) полевой популяции P. infestans можно подсчитать так: ИА = (Р · И · ИЗ) / 10 000. ИА аналогичен показателю CFI (Composite Fitness Index) (Tooley et al., 1986; Kadish, Cohen, 1988).

Индекс ИО характеризует способность полевой популяции формировать потенциал первичной инфекции непосредственно in situ, который следует отслеживать для предотвращения раннего развития фитофтороза (Evenhuis et al., 2007). Наибольшую интенсивность образования ооспор следует ожидать при промежуточном развитии заболевания, когда достаточно живой питающей ткани, достигаются высокие жизнеспособность мицелиев и вероятность контакта между А1 и А2. Наименьшую интенсивность образования

Рисунок 6. Стратегии размножения полевых популяций P. infestans.

Рисунок 7. Подстратегии размножения полевых популяций P. infestans.

Рисунок 8. Стратегии поддержания жизнеспособности полевых популяций P. infestans

Рисунок 9. Подстратегии поддержания жизнеспособности полевых популяций P. infestans

Ооспор следует ожидать при ограниченном развитии заболевания или наоборот при жестком развитии болезни (Romero-Montes et al., 2008).

На основе распределения этих индексов можно выделить 4 стратегии поддержания жизнеспособности: (рис. 8, 9): Н - нет агрессивности и образования ооспор; популяция слабо агрессивна, образование ооспор ограничено; А - агрессивная; популяция агрессивна, образование ооспор ограничено; Ж - жизнеспособная долгосрочно, популяция слабо агрессивна, имеется регулярное образование ооспор; и О - есть оба свойства, популяция агрессивна, имеется регулярное образование ооспор.

Мелкоделяночные эксперименты с проведением обработок фунгицидами Хлорокись меди (Гринбелт, норма расхода 6,5 кг/га), Ридомил голд (Сингента, норма расхода 2,5 кг/га), Ширлан (Сингента, норма расхода 0,4 л/га), Амистар [Квадрис] (Сингента, норма расхода 0,6 л/га) и Бактерицид (НПО «Каустик», норма расхода 10 л/га) 21.08 и 29.08. проводили в 2000, 2003 и 2004 годах на территории Лаборатории защиты растений РГАУ-МСХА.

При исследовании устойчивости сортов к фитофторозу для массива растений каждого сорта определяли индекс полевой устойчивости сорта - ИПУС = (1/ИА) • 100. ИПУС <10,0% - сорт в основном восприимчив; 10,1-25,0% - сорт малоустойчив; 25,1-50,0% - сорт среднеустойчив; 50,1-100,0% - сорт устойчив; > 100,0% - сорт гиперустойчив, возможен существенный вклад и вертикальной устойчивости. 5_бальная шкала полевой устойчивости сортов картофеля обоснована в предшествующих исследованиях (Попкова, Быченкова, 1969; Макаров и др., 2003). В соответствии с латвийской методикой В.А. Гауера (Гауер, 1965), биологическую эффективность применения сорта с полевой устойчивостью по показателю ИР (БИ_Ир) определяли по формуле: БИ_ир=((ИР_s-ИР_пу)/ ИР_s)М100, где ИР_s и ИР_пу - индексы развития болезни на восприимчивом и устойчивом сортах. Определение БИ_ИЗ и БИ_ИА аналогично.

Результаты. И на картофеле, и на томате преобладали бесполые популяции P. infestans со стратегией размножения Б (рис. 10).

Популяции с регулярным бесполым и половым размножением встречались только на томате. Распределения стратегий размножения в популяциях с листьев картофеля, листьев томата и плодов томата различались друг от друга (?² = 18,4 при 6 степенях свободы; критическое значение ?² 12,6).

В листьях картофеля и томата преобладали популяции с подстратегиями Б4, Б1, Б2, Б7 и С2, в плодах томата - Б3 (табл. 6).

Для 89 популяций P. infestans провели корреляционный анализ между распределениями индексов встречаемости зооспорангиев (ИЗ) и ооспор (ИО). В целом, между образованием зооспорангиев существует очень слабо выраженная тенденция к обратной взаимосвязи. Более выраженная тенденция к обратной взаимосвязи (r=-0,41) прослеживается только для плодов томата.

Далее приводятся флуктуации значении ИЗ и ИО для вегетационных периодов различных лет, отличающихся по погодным условиям (табл. 7).

Рисунок 10. Число популяций P. infestans с определенной стратегией размножения (С, Б, П и Д) на картофеле и томате в 1997-2006 г.

Таблица 6. Число популяций P. infestans с определенной подстратегией размножения в листьях картофеля, а также листьях и плодах томата

Таблица 7. Характеристика развития P. infestans на картофеле в Московской области в различные годы

ИЗ имел высокие значения в первой половине сезона, далее нередко наблюдали его уменьшение. ИО изменялся по-разному (рис. 11).

Рисунок 11. Изменение индексов ИЗ, ИО и стратегий размножения полевых популяций P. infestans на картофеле в течение вегетационного сезона.

Значения ИЗ были выше в 1999 г., значения ИО - несколько выше в 1999 г. и 1997 г. Однако различия в ИО определялись вкладом отдельных популяций, в целом, различий по ИО мы не выявили.

Изучение влияния применения фунгицидов Ридомил голд, Ширлан, Амистар, Оксихом и Бактерицид на изменение стратегий размножения и поддержания жизнеспособности полевых популяций P. infestans в тесте 2003 г. показало следующие результаты.

Изменение стратегий размножения (табл. 8). В контроле на восприимчивом сорте Сантэ наблюдалось увеличение индекса ИЗ (лишь к концу сезона он несколько уменьшался) и изменение подстратегии поддержания жизнеспособности от С1 к Б4. Напротив, на устойчивом сорте Луговской ИА оставался на одинаковом умеренном уровне, но потом снижался. В течение всего сезона подстратегия размножения изменялась от Б1 к С1.

Во всех вариантах на сорте Сантэ, кроме варианта с Ширланом, индекс ИЗ в общих чертах изменялся как в контроле. После обработки Ридомилом голд ИЗ достиг максимального значения - 100.

На сорте Луговской после обработки фунгицидами в ряде вариантов (Бактерицид, Хлорокись меди, Ридомил голд) значения ИЗ были высокими (особенно в варианте с Бактерицидом - близко к максимальному) и превышающими показатели в контроле. Стратегии размножения после обработки у этих вариантов были Б7 (Бактерицид) или Б4. Напротив, в вариантах с Ширланом и Амистаром наблюдали кардинальное уменьшение ИЗ, стратегия размножения после обработки была С1.

Изменение стратегий поддержания жизнеспособности (табл. 8). В контроле на сорте Сантэ наблюдалось увеличение индекса ИА и изменение подстратегии поддержания жизнеспособности от Н1 к А1. Напротив, на сорте Луговской в течение всего сезона подстратегия поддержания жизнеспособности оставалась Н1.

В вариантах с обработкой Бактерицидом, Хлорокисью меди и Амистаром на сорте Сантэ наблюдали повышение ИА и измнение подстратегии поддрежания жизнеспособности как в контроле. Но после обработки Ширланом и Ридомилом голд наблюдали снижение ИА. В отличие от контроля, стратегия была Н1 в течение всего сезона.

Во всех вариантах на сорте Луговской наблюдали снижение ИА. Стратегия была Н1 на протяжение всего сезона, за исключением варианта с Ридомилом голд (до обработки - А1, после - Н1).

Полученное распределение свидетельствует о том, что с одной стороны - стандартный общепринятый показатель индекс развития болезни (ИР) и с другой стороны - предложенные нами показатели индекс образования зооспорангиев (ИЗ) и общий показатель индекс агрессивности (ИА) - самодостаточные и независимые друг от друга показатели, способные дополнять друг-друга и характеризующие полевые популяции P. infestans в разных ситуациях.

Таблица 8. Изменение индексов и стратегий полевой популяции P. infestans на сортах картофеля Сантэ и Луговской после обработки фунгицидом; тест 2003 г.

* Сантэ - восприимчивый в условиях Московской области сорт; Луг. (Луговской) - устойчивый сорт.

Сравнение мицелиев, чувствительных и устойчивых к металаксилу, из природных пораженных фитофторозом образцов по интенсивности образования зооспорангиев дало следующие результаты. Из образцов картофеля и томата 2000, 2003 и 2004 г. выделяли изоляты, для которых определяли устойчивость к металаксилу и типы спаривания. Также в образцах определяли встречаемость зооспорангиев. Результаты анализа на основе критерия ?² свидетельствуют о том, что, в целом, чувствительные и устойчивые к металаксилу изоляты P. infestans (без значительной зависимости от их типов спаривания) в естественных условиях на листьях картофеля отличаются по интенсивности образования зооспорангиев. Среди устойчивых изолятов мы почти не выявили высокой интенсивности образования зооспорангиев. Устойчивые изоляты А1 и А2 по интенсивности образования зооспорангиев между собой не отличались.

Исследования полевой устойчивости сортов картофеля к фитофторозу проводили в 2000 и 2003-2008 г. Данные в довольно засушливые 2005 и 2007 г. не включены, так как в силу депрессивных условий они не могут показывать реальные показатели агрессивности P. infestans, а следовательно и полевой устойчивости изучаемых сортов картофеля.

Протестированные сорта картофеля можно поделить на три группы.

Первая группа сортов (табл. 9) характеризуется восприимчивостью или практически полным отсутствием полевой устойчивости к фитофторозу. По нашим данным, в нее входит большинство голландских сортов, а также многие российские сорта: Лина, Ресурс, Утенок, Русский сувенир, Чародей.

Трудно объективно охарактеризовать устойчивость голландского сорта Сатурна (2007 г.), показавшего значительную устойчивость на фоне засушливого вегетационного сезона и жестких обработок фунгицидами. Он все же поразился фитофторозом, когда другие обследованные сорта совсем не поразились фитофторозом и при отсутствии обработок. Исследование этого сорта целесообразно повторить.

Другой особый случай - шотландский сорт Джура (Isle of Jura). Данные получили в середине вегетационного сезона 2006 г. после нескольких обработок фунгицидами. Поэтому говорить об устойчивости (хотя бы незначительной; не смотря на значение индекса ИПУС) этого сорта не приходится. Напротив, можно полагать что развитие фитофтороза на этом сорте было частично и временно сдержано фунгицидными обработками.

Вторая группа сортов (табл. 9) характеризуется наличием полевой устойчивости к фитофторозу. Однако эта полевая устойчивость либо не работает к концу вегетационного сезона, либо не воспроизводится во всех проведенных испытаниях. По нашим данным, в эту группу входят российские сорта Невский, Жуковский ранний, Никулинский, Удача.

Третья группа сортов (табл. 9) характеризуется наличием стабильной полевой устойчивости к фитофторозу. По нашим данным, в нее входят украинский сорт Луговской, российские сорта Водолей и Герань, белорусский сорт Ветразь, и голландский сорт Гранола.

Таблица 9. Характеристики полевой устойчивости к фитофторозу сортов картофеля, выведенных в четырех странах, с учетом подстратегий размножения и поддержания жизнеспособности полевых популяций P. infestans в местах проведения испытаний