Содержание
Обозначенияи сокращения
Введение
1. Литературныйобзор
1.1 Возможныепоследствия чрезвычайных ситуаций на объектах по хранению и уничтожению химическогооружия
1.2 Трансформацияфосфорорганических соединений в объектах окружающей среды
1.3Процессы самоочищения почв
1.4Микроорганизмы-деструкторы фосфорорганических соединений
2. Основная часть
2.1 Методика отбораштаммов микроорганизмов, способных растворять фосфорорганические соединения
2.2Методика культивирования микроорганизмов
2.3 Методика проведенияэксперимента по изучению возможности деструкции метилфосфоновой кислоты и еёэфиров
2.4 Методикаконтроля роста микроорганизмов
2.5Методика определения концентрации соединений с С-Р связью
3.Обсуждение результатов
3.1 Отбор штаммовмикроорганизмов, способных растворять фосфорорганические соединения
3.2 Биодеструкцияметилфосфоновой кислоты и её кислых эфиров.
3.3 Путиметаболизма органофосфонатов
Заключение
Список использованныхисточников
Обозначенияи сокращения
ЗЗМ — зона защитныхмероприятий
МФК — метилфосфоноваякислота
НИР — научно-исследовательскаяработа
ОВ — отравляющиевещества
ОДК — ориентировочнаядействующая концентрация
ОС — окружающаясреда
ПДК — предельно-допустимая концентрация
ПДУ — предельно-допустимый уровень
ТХ — токсичныйхимикат
УХО — уничтожениехимического оружия
ФОВ — фосфорорганическиеотравляющие вещества
ХО — химическоеоружие
Введение
Обеспечение безопасности людей и защита окружающей среды (ОС)являются основополагающими требованиями Конвенции о запрещении разработки,производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожении[1]. Функционирование системы безопасности при проведении работ с химическиморужием (ХО) в России регламентируется нормативными правовыми актами [2,3] ифедеральной целевой программой «Уничтожение запасов ХО в Российской Федерации»[4]. К актуальным задачам Программы [4] относятся:
— мероприятия по созданию государственной системы мер поохране ОС и обеспечению экологической безопасности при проведении работ похранению и уничтожению ХО;
— проведение работ по санации загрязненных территорий послеуничтожения ХО категории 1.
Разработка методов и средств реабилитации объектов ОС врайонах расположения объектов по хранению и уничтожению ХО являетсяприоритетным направлением исследований в области обеспечения экологической безопасности[5].
Анализтенденций развития исследований в области защиты ОС показывает, что, наряду ссовершенствованием существующих методов, большое внимание уделяетсябиотехнологии санации почв, за которыми признается несомненный приоритет попоказателям эффективности и экономичности. Такие методы экологически безопасныи выгодно отличаются по сравнению с другими отсутствием вторичных отходов, т.е.возможностью полной минерализации химических соединений, выбрасываемых вокружающую среду в качестве промышленных отходов [6]. Биологические методывосстановления загрязненных территорий по оценкам экспертов требуют затрат длясвоего применения примерно в тысячу раз меньше, чем известные небиологическиетехнологии.
Цельюработы являлась оценка возможности микробиологической деструкцииметилфосфоновой кислоты и её кислых эфиров.
Длядостижения поставленной цели необходимо решение следующих задач:
— анализ литературных данных о существующих технологиях реабилитации загрязненныхпочв;
— скрининг микроорганизмов-деструкторов фосфорорганических соединений;
— изучение возможности биодеструкции продуктов разложения фосфорорганических отравляющихвеществ.
1. Литературный обзор
1.1 Возможныепоследствия чрезвычайныхситуаций на объектах по
хранению и уничтожению химического оружия
Ключевым звеном в ликвидации ХОявляется безопасность процесса уничтожения. В п. 3 статьи VII Конвенции озапрещении ХО определено, что в ходе выполнения обязательств каждоегосударство-участник Конвенции «уделяет первостепенное внимание обеспечениюбезопасности людей и защите окружающей среды». В соответствии с Федеральнойцелевой программой «Уничтожение запасов химического оружия в РоссийскойФедерации», утвержденной постановлением ПравительстваРФ № 969 от 29 декабря 2007 г., необходимо выполнение следующихмероприятий по обеспечению безопасности хранения и уничтожения ХО:
— организация и проведение государственнойсанитарно-гигиенической и экологической экспертиз предпроектных и проектныхматериалов по строительству объектов по УХО, а также технической иэксплуатационной документации на технологическое оборудование этих объектов;
— метрологическая аттестация технологическогооборудования, используемого для мониторинга окружающей среды и контроля засостоянием здоровья граждан на объектах по хранению ХО, объектах по УХО, атакже при уничтожении объектов по его производству и разработке;
— оснащение современными автоматическими системамиохраны, сигнализации и видеонаблюдения объектов по хранению ХО и объектов поУХО;
— оснащение современными автоматизированнымисистемами управления технологическими процессами объектов по УХО;
— внедрение технологий, безопасных в промышленном,пожарном и экологическом отношении, а также экономически приемлемых для УХО,полностью исключающих или в максимальной степени снижающих негативноевоздействие на здоровье человека и окружающую среду;
— обеспечение промышленной (технологической),пожарной и экологической безопасности при проведении работ по хранению,перевозке и уничтожению ХО;
— проведение комплекса мероприятий по предотвращениювозникновения аварий и пожаров на объектах по хранению ХО и объектах по УХО;
— использование современных систем мониторингазагрязнения окружающей среды химическими соединениями, образующимися в процессеэксплуатации объектов по хранению ХО и объектов по УХО;
— обеспечение социально-гигиенического иэкологического мониторинга работ, связанных с хранением и уничтожением ХО;
— систематическая проверка технического состоянияхимических боеприпасов на объектах по хранению ХО и проведение необходимыхработ для их поддержания в безопасном состоянии;
— своевременное выявление и уничтожение аварийныххимических боеприпасов с использованием комплексов, специально предназначенныхдля этих целей, при соблюдении требований технологической и экологическойбезопасности;
— разработка комплекса мероприятий по локализации иликвидации последствий аварий и пожаров на объектах по хранению ХО и объектахпо УХО, а также при его перевозке;
— обеспечение персонала объектов по хранению ХО иобъектов по УХО, а также граждан, проживающих и работающих в зонах защитныхмероприятий, индивидуальными средствами защиты, антидотами и другиминеобходимыми медикаментозными препаратами на случай возникновения аварийныхситуаций;
— создание локальных систем оповещения привозникновении аварийных ситуаций на объектах по хранению ХО и объектах по УХО,а также в зонах защитных мероприятий.
Объектпо УХО представляет собой сложный технологический комплекс, обеспечивающийуничтожение ТХ. В процессе уничтожения ТХ возможно несанкционированноевысвобождение имеющихся на объекте факторов опасности. Субъекты, на которыедействуют факторы опасности в случае проектных и запроектных аварий:
— производственный персонал объекта;
— основные производственные фонды объекта;
— окружающая среда.
Проектнаяавария – авария, масштабы и последствия которой учитываются при проектированиии создании объекта по УХО, рассчитываются и готовятся силы и средства,необходимые для ее локализации и ликвидации последствий. Запроектная авария –авария, масштабы и последствия которой можно только предполагать, готовностьсил и средства для ликвидации последствий таких аварий на объекте можетсоставлять часть от необходимого.
Распространениевысвобождающегося при запроектной аварии ТХ зависит от состояния атмосферы. В условиях конвекции, когда почва нагрета сильнеевоздуха, восходящие потоки вызывают быстрое «размывание» облака. Напротив, приинверсии (почва холоднее воздуха) наблюдаются наибольшие глубиныраспространения облаков. При слабом ветре облако зараженного воздуха затекает влощины и обходит холмы, так как пары ТХ тяжелее воздуха и «стелются» поповерхности земли. Глубина распространениязначительно снижается при наличии лесного покрова (примерно в 1,5 раза) посравнению с распространением над равнинной местностью. При инверсии глубина распространения облака увеличивается примерно в1,7 раза по сравнению с изотермией, а при конвекции уменьшается, что являетсявполне естественным. Чем неустойчивее атмосфера, тем интенсивнее идет перемешиваниевоздуха и тем быстрее разбавляется в нем примесьТХ, следовательно, тем меньше будет глубина распространения действующихконцентраций ТХ в облаке, способных нанести ту илииную степень поражения.
При устойчивой атмосфере отсутствуют значительные вертикальные перемешивания и движения, и температурныйградиент атмосферы будет меньше, чем сухоадиабатическийвертикальный градиент. Температурный градиент атмосферы может отличаться от сухоадиабатического в обе стороны и изменяться вшироких пределах (до 20 °С/100 м) [7,8].
Одним из признаков инверсии является наличие нисходящих потоков воздуха, и, следовательно,его сжатие и нагревание, как, например, в антициклонах. Этому сопутствуют повышение давления и установление ясной погоды.Состояние атмосферы в этом случае характеризуется как очень устойчивое. В зонахатмосферных фронтов температурная инверсия может создаться в результате натекания теплоговоздухана нижерасположенный слой холодного. Другим типоминверсии являютсярадиационные инверсии, образующиеся ночью, последневного прогрева земной поверхности. Ночью поверхность земли излучает тепло ибыстро остывает. Одновременно остывает и прилегающий к ней слой воздуха –сверху он прикрывается более теплым инверсионным слоем. Радиационные инверсиисоздаются в том слое атмосферы, который содержит загрязнения, способствуя тому,что загрязняющие вещества не рассеиваются и надолго задерживаются в окружающемвоздухе. Кроме того, они образуются как раз в то время, когда маловероятнаочистка атмосферы осадками.
В качестве наиболее вероятных путей поступления фосфорорганических ТХ в атмосферу можно выделить: высокотемпературные выбросы в атмосферу, которыемогут быть кратковременными или продолжительными (взрывы,пожары); вылив больших количеств вещества на различные поверхности с последующим испарением.
Масштабы последствий аварий зависятот размеров возникшего при авариях (разрушениях) и распространяющегося в атмосфере облаказараженного воздуха. Так, результаты моделирования последствий пожара свовлечением ФОВ свидетельствуют о поднятии перегретой примеси за счет действияархимедовой силы на большую высоту со значительной скоростью ветра и развитойтурбулентностью. Это приводит к относительно быстрому формированию зонызаражения на значительном удалении от источника.
Расчетызон заражения для разных вариантов возможных аварий с ФОВ на объекте 1205 в п.Марадыковский по методике [9 — 12] дали величины максимальной глубины зонзаражения (токсодоз ОВ, равных или выше пороговых) от 0,9 до 3,8 км при аварияхна объекте по УХО и от 1,3 до 17,7 км при более серьезных авариях (разлив 20тонн зомана) на объекте по хранению ХО.
Расчетпо методике [13] при значительно меньших количествах пролитого ОВ (2 т посравнению с 20 т в примере выше) глубина распространения поражающихконцентраций зарина достигает 40 км для пороговых концентраций или ~ 7 км длявыводящих из строя концентраций ОВ. Для случая разлива зомана получены глубиныраспространения более 43 км и около 2,8 км, при которых возможно получениепороговых и выводящих из строя доз соответственно. Расчетная площадь очагапоражения в этих случаях будет составлять: 770 км2 или 22 км2для зарина и 944 км2 или 4,1 км2 для зомана.
Размерызон защитных мероприятий (ЗЗМ) утверждены Постановлениями Правительства РФ [14]и, в частности, для п. Марадыковский Кировской области площадь ЗЗМ составляет891,7 км2.
Оценкавозможного уровня токсического воздействия на население в случае реализацииконкретного аварийного события осуществляется с использованием известныхмоделей распространения ОВ в различных природных средах [15-17]. В рамках этих моделей может быть проведенрасчет размеров возможных зон для разных уровней вероятностей локальногопоражения. При прогнозировании последствий конкретной рассматриваемой аварийнойситуации в отличие от правил расчета локальных рисков не должны учитыватьсяпреимущественные направления ветров. Поскольку в момент аварии направлениеветра может быть любым, а прогноз выполняется по наиболее тяжелым возможнымпоследствиям, то и направление распространения зараженного первичного ивторичного облаков ОВ должны выбираться в сторону наиболее населенныхтерриторий вблизи объекта. В качестве модельнойаварии рассмотрим взрыв (например, установленной противотанковой мины) наскладе, содержащем РБК-500, что привело к разрушению (пролому) крыши здания.При этой ситуации произошла детонация зарядов внутренних элементов в 100изделиях РБК-500, в результате чего произошла разгерметизация корпусов РБК-500и утечка из них 2370 кг вещества Vx в виде аэрозоля. Резкоеувеличение давления внутри склада привело к выходу облака аэрозоля Vx через пролом в крышесклада в окружающую среду. Параметры модели взяты из работы [18]. В качествеусловного направления распространения ОВ взято направление на северо-восток(юго-западный ветер), способное привести к наибольшему ущербу.
Расчетные оценки локального ущерба от чрезвычайной ситуациина объекте по УХО показывают, что при наиболее неблагоприятных метеоусловиях взону смертельного поражения попадает целый ряд крупных населенных пунктов. Взависимости от направления ветра, это могут быть п. Мирный (расстояние 1-2 км,5000 жителей), сёла Юрьево и Ленинская Искра Котельничского района (13 км),куст деревень вокруг с. Истобенск (8-16 км) и др. Зона, характеризующаясявысоким показателем локального ущерба (более 50%), при восточном ветре можетдостичь г. Котельнича, а при юго-западном ветре — г. Орлов (расстояние 24 км).В последнем случае при ингаляционном воздействии доля пораженного населения вкусте деревень в районе с. Истобенск будет достигать 100 % и свыше 50 % для г. Орлов.
Попадающий взону воздействия выбросов г. Котельнич — районный центр Кировской области c населением около 28000 человек. Доля пораженного населенияг. Котельнича при ингаляционном воздействии будет достигать 100 % в восточной части города на расстоянии до 21 км от источника.
Приведенныеданные свидетельствуют о возможном обширном загрязнении территорий в районаххранения и УХО в случае запроектных аварий.
1.2 Трансформацияфосфорорганических отравляющих веществ в
объектахокружающей среды
Подтрансформацией токсичных химикатов в ОС понимают совокупность абиотических ибиотических процессов, приводящих к образованию [19]:
— либоболее токсичных продуктов, в том числе обладающих отдаленными эффектами или новымисвойствами;
— либопродуктов с более выраженными влиянием других критериев опасности;
— либопродуктов, токсичность которых близка к токсичности исходных химикатов;
— либоменее токсичных продуктов.
Основнымикомпонентами объектов ОС, в которых возможно протекание химических реакцийтрансформации ФОВ под действием различных физико-химических факторов, являютсяпочва, поверхностные и подземные воды, воздух, растительный и животный мир [20,21].Загрязнение ОПС посредством распространения ОВ в атмосфере является сложнымфизико-химическим процессом, кинетика которого определяется следующимиосновными факторами:
— физико-химическимисвойствами ОВ;
— типомисточника поступления ОВ в ОС;
— процессамираспространения ОВ в атмосфере, которые зависят от метеорологической ситуации врайоне объекта хранения ОВ на момент аварии и физического состояния, в которомОВ или продукты их фазовых и химических превращений присутствуют в атмосфере;
— процессамифазовых и химических превращений ОВ в атмосфере;
— процессамифазовых и химических превращений ОВ при их взаимодействии с почвой.
ТХ Vx, растворенный в воде, относительно стоек к гидролизу. Гидролиз протекаетнесколькими путями с образованием различных продуктов деструкции (рисунок 1).
/>
Рисунок1 — Гидролиз Vx [22]
В нейтральной и слабощелочной среде происходит разрывсвязи Р-О с образованием S-2-(N,N-диизопропиламино)этил тиоэфира МФК (II),который гидролизуется до МФК (III) идиизопропил-(2-меркаптоэтил)амина (IV). Данноесоединение может быть окислено до бис-[2-(N,N-диизопропиламино)этил]дисульфида (V).
В кислой и щелочной среде вышеизложенный путьконкурирует с гидролизом по связи Р-S с образованиемэтилового эфира МФК (VI), который далее гидролизуетсядо МФК (III). При рН £7 и реальных зимних и летних температурах воды гидролиз Vx(таблица 1) может продолжаться длительноевремя [23], что совпадает с данными [22].
Таблица 1 – Зависимость скорости гидролиза Vx от величины рН при 25 °СПоказатели
Значения рН и τ50 рН 2-3 7 9,5 10 13
τ50, ч 24000,0 8400,0 18,3 11,0 0,3
Однако, по данным [24]период полуразложения Vx при рН=7 при 25 °С составляет от 17 до 42 дней. Наряду смалотоксичными продуктами образуется около 10-20 % II,который не менее токсичен, чем исходный Vx, устойчив вОПС и, к тому же, в отличие от вещества Vx, хорошорастворим в воде. Период полуразложения II составляет57,3 часа. Следовательно, в случае серьезных аварий при попадании большихколичеств Vx в водоемы в районе объекта по УХО вода и,в особенности, придонная часть водоемов будет заражена в течение длительноговремени.
Гидролиз изомерного вещества типа Vx– О-изобутилового-S-[2-(N,N-диэтиламино)этил]тиолового эфира МФК- протекает аналогичнымобразом. В работе [25] изучен гидролизэтого вещества эквимольным количеством воды. На основании кинетических испектральных данных установлено, что гидролиз вещества типа Vxс эквимольным количеством воды протекает преимущественно с разрывом связи P-S. Как показано в таблице 2,гидролиз на 99 % вещества типа Vx достигается за 144 ч.Основными продуктами реакции являются изобутиловый эфир МФК,диэтил-(2-меркаптоэтил)амин и бис-[2-(N,N-диэтиламино)этил]дисульфид [25].
Таблица 2 – Динамика изменения концентрации веществатипа Vx при 40 °С (Со=3,715 моль/л) Показатели Динамика изменения концентрации Время, ч 24 48 120 144 Остаточное содержание вещества, моль/л 3,075 2,137 0,187 0,075
Основнымипроцессами, определяющими поведение ФОВ в почве, являются сорбция почвеннымичастицами, гидролиз, окислительно-восстановительные реакции имикробиологическая деструкция [26]. Типы почв, их свойства, присутствиепочвенной влаги и микроорганизмов, по-видимому, могут оказывать влияние наскорость деструкции. Однако эти вопросы практически не изучены.
Период,в течение которого разлагается 50 % Vx в почве (рН=5,3) составляет примерно15 суток, и основным продуктом является VI [25]. Спустя день концентрация Vx с 0,2 мг/г уменьшилась на 22 % в песчаной почве ина 2 % — в суглинке и торфе. Только 0,1 % вещества оставалось в почве спустя 3 недели. VI достаточно стабилен, но в почвевозможен его гидролиз до МФК. Период полураспада VI в почве составляет восемь суток. Приблизительно 40 % VI в почве гидролизуется в первый деньи 60 % в течение последующих 12 дней.
Установленаконстанта скорости деструкции VI вводе и почве 2,4·10-10 ч-1 и3,6·10-3 ч-1 (притемпературе 25 °С) соответственно. Данные таблицы 3 свидетельствуют оего высокой растворимости в воде и низкой летучести [25].
химический оружие микроорганизмы биодеструкция
Таблица3 – Физические свойства продуктов деструкции Vx Соединение Растворимость в воде, мг/л
lgKow
lgKoc
pKа
при 25 °С
Давление пара,
мм рт. ст. VI
1,8·105 -1,15 0,75 2,00
3,6·10-4 II неограниченно 0,96 1,90 11,05 - V 9,5 3,48 3,28 -
5,9·10-9 III неограниченно -2,28 0,15 10,08 1,8 IV 1,2 -1,15 3,81 -
2,7·10-7
Примечания:
1 lgKoc — логарифм коэффициента распределения в системе «органический углерод-вода»;
2 lgKow — логарифм коэффициента распределения в системе «октанол/вода»;
3 pKа – десятичный логарифм константы диссоциации.
Другой продукт деструкции Vx — II стабилен в воде, но, как и вещество Vx, быстро разлагается в почве. II — белое твердое вещество принормальных условиях, хорошо растворимое в воде, устойчивое к гидролизу принейтральной и щелочной рН. В 0,1 н растворегидроксида натрия вещество остаётся в неизменном виде в течение 12 дней. lg Koc=1,90 указывает на низкую возможностьадсорбции почвой; Kowуказывает на небольшую возможность к биоаккумуляции.
МФКстабильна в ОПС, так как она стойка к гидролизу и термическому разложению. Этосоединение было обнаружено спустя 10 лет после заражения сухой почвы наполигоне Дагуэй (США) [22,23, 25]. Скорость разложения МФК в ОПС определяетсяпроцессами биодеструкции и прочностью связи С-Р. Исходя из значения постояннойГенри, равной 1,22·10-11 атм·м3/мольпри 25 °С, испарение кислоты из воды невозможно. В воде МФК можетдиссоциировать.
Скоростьразложения зарина в атмосфере не установлена.Однако известно, что будут протекать реакции гидролиза, фотолиза и окисления.Зарин достаточно устойчив в атмосферном воздухе. Так, при относительнойвлажности воздуха 60-70 % начальнаяконцентрация зарина в течение 24 часов снижается в среднем на два порядка.Скорость гидролиза зарина в воде зависит от температуры, рН и состава воды.Гидролиз идет быстрее в кислой и щелочной среде. С повышением температуры накаждые 10 °С скорость гидролиза в нейтральной среде увеличивается почтивдвое. Гидролиз зарина существенно зависит от рН. Так, по данным [25] при 20 °С в обычной воде периодполуразложения изменяется с 461 ч (рН=6,5) до 46 ч (рН=7,5). При 25 °С период полуразложения уменьшается от 237 ч (рН=6,5) до 24 ч (рН=7,5).Период полуразложения, равный 8,3 часа при 0 °С и рН=6,5, указывает на некоторуюстойкость этого вещества при низких температурах. По данным [23] период полуразложения при 25 °С и рН=7 составляет 54 часа.
Гидролиззарина протекает в две стадии. На первой быстрой стадии образуетсяизопропиловый эфир МФК (VII).Вторая стадия идет медленнее с образованием МФК (III) и изопропанола (рисунок 2). Продукты гидролизазарина малотоксичны.
/>
Рисунок2 — Гидролиз зарина
Известно,что скорость трансформации зарина в почве обусловлена процессами гидролиза имикробиологической деструкции. По данным [25] более 90 % внесенного в почвузарина разлагается в течение 5 дней. Согласно [24] скорость разложения зарина впеске возрастает с увеличением влажности. Так, при 20°С и влажности песка 0,2 % разлагается38 % вещества, а при влажности 5 — 50 % вещества.
Заринболее стоек при низких температурах. В статье [24] представлена информация оскорости разложения некоторых продуктов деструкции зарина. Зарин разлагается собразованием VII. Соединение VII достаточно устойчиво в ОПС.В результате гидролиза VII образуется МФК. Хорошая растворимость МФК в водеуказывает на возможную миграцию МФК в грунтовые воды.
Зоман более устойчив к действию воды, чем зарин. Гидролиз зомана идет и вкислых, и в щелочных средах. Согласно [22] время 50 % -го гидролиза при 30 оСи величинах рН, равных 2, 4 и 7, составляет 6,4; 250 и 41 час соответственно.Согласно [26] период полуразложения при 25 оС и рН=6 составляет 60часов. Время 50 % -го гидролиза при 20 оС и рН=7 по данным [22]составляет 82,5 часа. Гидролиз протекает в две стадии. На первой стадииобразуется пинаколиловый эфир МФК (VIII), который далее медленногидролизуется до МФК. При рН>10 гидролиз VIIIосуществляется за несколько минут с образованием III. В почвезоман также разлагается за счет реакции гидролиза до соединений VIII и III. Схема реакции гидролиза зомана представлена нарисунке 3:
/>
Рисунок3 — Гидролиз зомана
Основныепродукты трансформации ФОВ, появление которых возможно в ОС в процессефункционирования объекта по УХО, представлены в таблице 4.
Таблица 4 — Основные продукты трансформации ФОВ в ОСФОВ Продукты трансформации ФОВ в ОС атмосфера вода почва Vx - II,III,IV,V,VI II,III,IV,V,VI Зарин VII III, VII III, VII Зоман - III,VIII III,VIII
Следуетотметить, что проблема трансформации ФОВ в объектах ОС исключительно сложна.Поэтому перечень продуктов трансформации ОВ, приведенный в таблице 4 наосновании обобщения литературных данных, может корректироваться по мереобнаружения в ОС новых загрязняющих веществ и отработки методик их определения.
1.3 Самоочищение почв
Процессы перераспределения загрязнителей в почвахсопровождаются самоочищением экосистем, закономерности которого до конца еще неизучены. Познание этих процессов имеет весьма важное значение для их использованияпри разработке новых способов и технологий очистки загрязненных территорий, атакже для выявления безопасных и предельно допустимых уровней (ПДУ) техногенныхвоздействий на ОС.
Под самоочищением ОС понимается совокупностьсамопроизвольных природных физических, геохимических и биологических процессов,происходящих в ее пределах и направленных на снижение в почвах, подземных иповерхностных водах и т.п. загрязнителей до уровней, безопасных для экосистем.
В основе процессов самоочищения, как известно [27], лежатпроцессыабиотического или биотического превращения химических веществ-загрязнителей:
— физические процессы массопереноса: разбавление(рассеивание, перемешивание), вынос загрязнителей за пределы экосистемы,испарение, сорбция;
— химическая трансформация: гидролиз, фотолиз,окисление и др.
— микробиологическая трансформация;
— бионакопление.
Особая роль в процессах самоочищения принадлежитавтотрофныморганизмам. Весьма существенную роль в самоочищении ОСиграют различные круговые и циклические процессы массо- и энергопереноса,включая глобальный круговорот воды, круговые процессы в биогеоценозах и т.п.Техногенное нарушение естественных круговых или циклических процессов в почвахи сопредельных средах приводит к нарушению функций «самоочищения».
К абиотическим превращениям загрязнителей вгеологической среде относятся окислительные и восстановительные процессы,гидролиз, фотохимические реакции и т.п.
К биотическим превращениям относятсяферментативная детоксикация (например, тяжелых металлов), ферментативноеокисление, разложение, восстановление и т.п. [28]. Органические токсикантыокончательно выводятся из ОС лишь в результате их минерализации, т.е.разложения до диоксида углерода, воды и других неорганических веществ(например, СО, НСl, NH3 и т.п.). Разные соединения обладают различной устойчивостью кминерализации.
Биологическая деструкция загрязнителей можетвызываться различными организмами (энзимы, грибы, микроорганизмы и т.д.). Приполной биологической деструкции образуются только вода, углекислый газ ипоявляются новые органические биотические образования. Однако чаще происходитнеполная биологическая деструкция, при которой какой-либо вид организмовосуществляет лишь определенную стадию (ступень) процесса разложения. В итоге,для полного биологического разложения какого-либо загрязнителя на конечныепродукты в большинстве случаев требуется совместная деятельность большого числаразличных организмов, объединенных в данном биогеоценозе.
По этой же причине более богатые по видовомуразнообразию биогеоценозы обладают большей устойчивостью к различнымзагрязнителям, большей способностью к самоочищению, чем бедные в видовомотношении биогеоценозы. В общем случае, чем сильнее молекулярное строение тогоили иного загрязнителя отклоняется от строения близких природных веществ, темсложнее идет процесс его биологического разложения.
Процессы самоочищения в ОС ограниченны.Самоочищение может осуществляться лишь в определенных пределах загрязнения, непревышающих некоторых границ, уровень которых лимитируется механизмамиуказанных выше процессов самоочищения. Для каждого механизма, как и для каждоговещества-загрязнителя, существует свой ПДУ, превышение которого уже непозволяет системе самопроизвольно «справиться» с данным загрязнителем вконкретных геохимических условиях. Превышение этих уровней исключаетсамопроизвольное очищение системы. В этом случае система переходит уже вкачественно иное состояние. Многообразие механизмов самоочищения в ОС, как иобилие различных веществ-загрязнителей, определяет чрезвычайную сложность этихпроцессов.
С термодинамической точки зрения, самоочищение ОСпроисходит вследствие стремления изолированной системы к равновесию (по всемтермодинамическим потенциалам, включая и химические потенциалыкомпонентов-загрязнителей, которые (за исключением энтропии) в состоянииравновесия достигают минимальных значений). При этом энтропия такой системывозрастает в соответствии со вторым началом термодинамики. Хаотическоерассеивание загрязнителей, их разбавление, растворение и т.д. сопровождаетсявозрастанием энтропии экосистемы и является самопроизвольным процессом. Этотпроцесс более вероятен, чем противоположный — самопроизвольноеконцентрирование, упорядочивание и локализация загрязнителей в каком-либо одномместе. Поэтому самоочищение ОС может осуществляться только за счет рассеиваниязагрязнителей или их деструкции.
С другой стороны, если считать, что любоетехногенное загрязнение создает определенное возмущение в пределах экосистемы,нарушающее ее равновесие, то, согласно принципу Ле Шателье-Брауна, этовоздействие вызывает в системе процессы, стремящиеся ослабить эффект данноговоздействия. Самоочищение системы идет в соответствии с принципом ЛеШателье-Брауна, который позволяет определить направление смещения равновесия.
Допустимой считается такая нагрузка на экосистему,“под воздействием которой отклонение от нормального состояния системы непревышает естественных изменений и, следовательно, не вызывает нежелательныхпоследствий у живых организмов и не ведет к ухудшению качества среды”.Практически идентичное определение дается А.П. Левичем для обозначенияэкологически допустимых уровней воздействия, которые “в отличие от предельнодопустимых концентраций (ПДК) являются не потенциальными причинамиэкологического неблагополучия, а непосредственными его симптомами”. Допустимойсчитается любая нагрузка, не превышающая предельной (т.е. нормативной),которая, в свою очередь, равна критической нагрузке, умноженной на коэффициентзапаса (в зависимости от степени «доверия» и потенциальнойвозможности кумулятивного действия этот коэффициент обычно варьируется от 0,2до 0,5) [29].
К сожалению, как слишком часто случается в нашейжизни, написать закон или дать основополагающее определение оказываетсязначительно проще, чем разработать методику измерения частных показателей,закрепленных в законе. Например, кто может решиться хотя бы на, казалось бы,несложное определение, что такое “нормальное состояние экосистемы” и каков унее “диапазон естественных изменений”? Поэтому, к настоящему времени известнылишь некоторые попытки обоснования «экологических ПДК» для растенийсуши и для сообществ водоемов рыбохозяйственного назначения.
Экологическое нормирование не является подменойсанитарно-гигиеническому нормированию, а, в определенном смысле, дополняет его,ужесточая применяемые стандарты. Например, экологическая индикация может датьсведения о степени и характере загрязнения, распределении загрязнения вводоеме, возможном состоянии водной экосистемы в сезонном масштабе. Из этогоследует, что вода, качество которой согласно экологическому контролю признанонеудовлетворительным, вряд ли может использоваться для питьевых илихозяйственных целей, но экологически доброкачественная вода не всегда можетбыть признана пригодной с точки зрения здравоохранения. В последнем случаенеобходимы специфические микробиологические, токсикологические и химическиетесты.
В мировой практике концепция критических нагрузокполучила широкое развитие как необходимое руководство по рациональномуограничению антропогенных воздействий. На рабочем совещании ООН понятие“критическая нагрузка” было определено как “количественная оценка воздействияодного или нескольких загрязняющих веществ, ниже которой не происходитсущественного вредного воздействия на специфические чувствительные элементыокружающей среды в соответствии с современными знаниями”. С учетом известныхпроблем кумуляции небольших воздействий и развитию хронических (отложенных)последствий величина критической нагрузки по В.Н. Башкину [28] может бытьохарактеризована как “максимальное поступление загрязняющих веществ, которое невызывает необратимых вредных изменений в структуре и функциях экосистем втечение длительного (50-100 лет) периода”.
Несмотря на глобальную аттрактивность концепциикритических нагрузок, количественная оценка их величин до сих пор связана сцелым рядом неопределенностей. Прежде всего это относится к самимосновополагающим понятиям: например, до сих пор не вполне ясно, где обнаружить«специфические чувствительные элементы», что считать за «необратимыевредные изменения» (за 50-100 лет таковые могут произойти не только сприродными компонентами, но и с самим человечеством) и, наконец, что есть“экологическая норма”.
Оценка критичности воздействий предполагаеткомплексное исследование изучаемого объекта и выявление двух основныхинтегральных составляющих в поведении экосистемы: фактора антропогеннойнагрузки на окружающую среду и отклика, определяющего функциональнуюустойчивость, продуктивность и разнообразие биотических элементов:
/>
Почва– биокосное тело природы. Располагаясь на границе соприкосновения литосферы,атмосферы и гидросферы, она формирует особую геосферу – педосферу, илипочвенный покров Земли. Одновременно почва является одним из главных и сложныхкомпонентов биосферы – области распространения жизни на Земле.
Любуюпочву можно рассматривать как гетерогенную, многофазную систему, состоящую изтрех фаз: твердой, жидкой и газообразной. В твердой фазе преобладаютминеральные образования (50…60 % от общего состава почвы), которые представленыпервичными (кварц, полевые шпаты) и вторичными (глинистые минералы: каолинит,монтмориллонит, гидрослюды, смешанослойные минералы; минералы оксидов железа,алюминия, марганца, кремния; минералы – соли: доломит, сода, кальцит, магнезит,трона, гипс, ангидрит, мирабилит, галит, фосфаты, нитраты, сульфиды и др.)минералами. К этой же фазе относятся различные органические вещества (до 10 %),в том числе гумус или перегной, а также почвенные коллоиды, имеющиеорганическое, минеральное или органоминеральное происхождение.
Жидкуюфазу почвы (почвенный раствор, 25…30 %) составляет вода с растворенными в нейорганическими и минеральными соединениями, а также газами.
Газовуюфазу почвы (15…25 %) составляет «почвенный воздух», включающий газы,заполняющие свободные от воды поры, а также газы, адсорбированные коллоиднымичастицами и растворенные в почвенном растворе.
Слоистаяструктура почвы возникает в результате взаимных перемещений в ней продуктоворганического и неорганического происхождения. Почва состоит из несколькихгоризонтов (слоев с одинаковыми признаками), возникающих в результате сложноговзаимодействия материнских горных пород (подпочвы), климата, растительных иживотных организмов (особенно бактерий), рельефа местности. Типичный почвенныйпрофиль показан на рисунке 4.
/>
Рисунок 4 — Типичный почвенный профиль
Органическоевещество почв – это совокупность живой биомассы (эдафон), органических остатковрастений, микроорганизмов и животных различной степени разложения, продуктов ихметаболизма и гумуса. Наземные и внутренние почвенные организмы после своегоотмирания в виде безжизненного органического вещества поступают в почву. Врезультате микробиологических и частично химических и физико-химическихпроцессов это вещество подвергается сложным биохимическим преобразованиям.
Органическиесоединения, поступающие в почву в составе остатков растительных и животныхорганизмов, либо разрушаются до простых неорганических соединений (углекислыйгаз, вода и др.), либо преобразуются в новые органические соединения. Комплексновообразованных специфических почвенных органических соединений получилназвание почвенного перегноя, или гумуса. Таким образом, гумус – совокупностьвсех органических соединений, находящихся в почве, но не входящих в составживых организмов или образований, сохраняющих анатомическое строение, неучаствующих в построении тканей растительных и животных остатков. В составгумуса входят гуминовые вещества, к которым относятся гуминовые кислоты,гумусовые кислоты, гиматомелановые кислоты, фульвокислоты, гумин, различногорода индивидуальные органические соединения биологического происхождения, атакже техногенные органические соединения, попадающие в почву при внесенииудобрений, пестицидов, обработке почвы и ее техногенном загрязнении (рисунок 5).
/>
Рисунок 5 — Номенклатура (перечень) гуминовых веществ [30]
Неорганическая часть, органическое вещество и живые организмыпринимают участие в процессах самоочищения почвы.
Классификацию почв по степени загрязнения проводят по ПДКхимических веществ и их фоновому загрязнению [31]. По степени загрязнения почвыподразделяются на: сильнозагрязненные, среднезагрязненные, слабозагрязненные.
Ксильнозагрязненным относят почвы, в которых содержание загрязняющих веществ внесколько раз превышает ПДК, имеющие низкую биологическую продуктивность,существенное изменение физико-химических, химических и биологическиххарактеристик.
Ксреднезагрязненным относят почвы, в которых установлено превышение ПДК безсущественных изменений в свойствах почв.
Кслабозагрязненным относят почвы, в которых содержание химических веществ непревышает ПДК, но выше естественного фона.
Коэффициентконцентрации загрязнения почвы НС вычисляется по формуле:
/>
где С– общее содержание загрязняющих веществ;
Сф– среднее фоновое содержание загрязняющих веществ;
Спдк– предельно-допустимое содержание загрязняющих веществ.
Степень устойчивости почвы к химическим ЗВ оценивают поотношению к конкретному токсиканту или группе веществ, которыми загрязненаисследуемая почва. По степени устойчивости к химическим загрязняющим веществами по характеру ответных реакций почвы подразделяют на: очень устойчивые;среднеустойчивые; малоустойчивые.
Степеньустойчивости почвы к химическим загрязняющим веществам характеризуетсяследующими основными показателями: гумусного состояния почв, кислотно-основнымисвойствами; окислительно-восстановительными свойствами, катионно-обменнымисвойствами, биологической активности, уровня подземных вод, доли веществ впочве, находящихся в растворимой форме.
1.4 Микроорганизмы-деструкторыфосфорорганических соединений
Способность микроорганизмов использоватьфосфорорганические соединения с С–Р связью в качестве единственного источникафосфора известна сравнительно давно [32]. Впервые доказательство биологическогорасщепления С–Р связи было получено на примере E. coli, которая в качестве единственного источника фосфораиспользовала метилфосфоновую или этилфосфоновую кислоты.
Анализопубликованных к настоящему времени работ свидетельствует о наличии в природеширокого круга микроорганизмов – деструкторов фосфонатов, среди которыхграм-положительные и грам-отрицательные бактерии, а также некоторые дрожжи игрибы [33-36]. Однако предполагается, что разлагать фосфонаты способны, скорее,только особые штаммы, но не определенные группы микроорганизмов [37]. Попыткапроверить это была предпринята в ряде исследований [33]. Так, из пяти почвенныхизолятов были выделены бактерии, способные деградировать широкую группуструктурно различных фосфонатов. Прежде всего, это различные штаммы Pseudomonas и Bacillus megaterium, разлагающие 14 из 15 исследованныхсубстратов, что сопоставимо с широкой субстратной специфичностью, выявленнойранее для Agrobacterium radiobacter. В этой работе впервые былопоказано, что грам-положительные бактерии могут осуществлять прямое разложениесвязи С–Р. Способность расти на различных природных и ксенобиотическихфосфонатах, как единственных источниках фосфора была проанализирована так же умикроорганизмов из семи экосистем и у 19 лабораторных микроорганизмов. Этоисследование показало присутствие деструкторов фосфонатов среди различныхбактериальных видов и систематических групп, выделенных как из загрязненных,так и из незагрязненных фосфонатами источников окружающей среды. Этосвидетельствует о более широком их распространении, чем предполагалось ранее [34].Было подтверждено отсутствие способности к деградации фосфонатовэукариотическими организмами. Впервые обнаружена такая способность уфотосинтетического организма Rhodobacter capsulatus.Недавно были выявлены галофильные бактерии Chromohalobacter marismortui, которые способны использовать дляроста в качестве единственного источника фосфора фосфоноацетат, 2-аминоэтил-,3-аминобутил-, метил- и этил- фосфонаты. При этом наблюдались различия в ростеклеток на разных фосфонатах и их различная утилизация в зависимости отконцентрации NaCl, что, возможно, является результатомиспользования клетками для этой цели различных транспортных систем.Термофильные бактерии Geobacillus caldoxylosilyticus T20 способны такжеиспользовать некоторые фосфонаты в качестве единственного источника фосфора дляроста при 600С. Некоторые штаммы Streptomycetes способны использовать в качествеединственного источника фосфора самые различные по структуре фосфонаты. Штамм Streptomyces morookaensis DSM 40565 способен расщеплять 2-амино-4-фосфонобутират вкачестве источника азота и фосфора способом, подобным стереоселективному. Эти результаты позволяют предположить наличие новогометаболического пути для расщепления С–Р связи.
Толькомикроорганизмы, разлагающие алкилфосфонаты с образованием алканов, можно суверенностью отнести к микроорганизмам, содержащим С–Р лиазу, хотя ихсубстратная специфичность может и не ограничиваться алкилфосфонатами. Некоторыеиз указанных микроорганизмов способны разлагать и другие фосфонаты, в том числеглифосат и 2-АЕР (таблица 5).
Большинствобактерий, для которых точно установлено разложение фосфонатов по С–Р лиазномумеханизму, относится к грам-отрицательным бактериям, однако, известны и двапредставителя грам-положительных бактерий: Arthrobacter sp. GLP-1 и B. megaterium. Среди почти сорока идентифицированныхпочвенных изолятов и коллекционных штаммов бактерий, проверенных на С–Р лиазнуюактивность, только вышеупомянутые грам-положительные бактерии обладали ею. Удругих исследованных грам-положительных бактерий С–Р лиазную активностьобнаружить не удалось. Еще одним представителембактерий, разлагающим фосфонаты по С–Р лиазному механизму, является Rhodobacter capsulatus, фототрофная грам-отрицательнаябактерия, способная разрушать С–Р связь при анаэробных условиях на свету. ПоискС–Р лиазной активности среди представителей грибов (Cladosporium herbarum, Fusarium culmorum и Trichoderma viride /33/ не дал положительных результатов.
Таблица5 — Микроорганизмы, разлагающие фосфонаты по С-Р лиазному механизмуМикроорганизм Утилизируемый фосфонат Pn 2-AEP Ф-P глифосат Agrobacterium radiobacter + + + + Kluyvera ascorbata + + + - Kluyvera cryorescens + + + - Klebsiella oxytoca + + + - Klebsiella pneumoniae + + + - Bacillus megaterium 2BLW + + + + Arthrobacter sp.GLP-1 + + + + Rhizobium sp. + + + - Pseudomonas testosteroni DSM 1622 + + - - Pseudomonas sp. 7NSK2 + + + - Pseudomonas sp. PG2982 + + + + Escherichia coli DSM1576 + + - - Alcaligenes eutrophus + + + + Rhodobacter capsulatus + + + - Klebsiella aerogenes + + + - Enterobacter aerogenes + + + слабо /> /> /> /> /> />
Таким образом, способность разлагать фосфонаты по С–Р лиазномумеханизму встречается среди грам-отрицательных бактерий гораздо чаще, чем средиграм-положительных бактерий. Это отдельные представители классов Arthrobacteriaceae, Bacillaceae, Rhodobacteriaceae, Alcaligenaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Kluyvera) и Rhizobiaceae (Rhizobium, Agrobacterium).
Нарядус вышеупомянутой классификацией бактерий, способных разлагать фосфонаты по С–Рлиазному пути, делящей все бактерии на грам-положительные и грам-отрицательные,имеет место и другая классификация. Согласно ей бактерии, способные расщеплятьС–Р связь с помощью С–Р лиазы делят на три класса [38]. Первый класс бактерийпредставляет собой Escherichia coli, способная разлагать алкил- ифенилфосфоновую кислоты, но не глифосат. Второй класс бактерий представляет Enterobacter aerogenes, способная эффективно разлагатьалкил- и фенилфосфоновую кислоты, однако глифосат разлагает слабо. Третий классбактерий представляет собой Pseudomonas-подобные организмы, способные разлагать алкил- и фенилфосфоновую кислотыи глифосат одинаково эффективно. Однако С–Р лиазную активность внеклеточныхэкстрактов как у Escherichia coli так и у Pseudomonas sp. PG2982 тестироватьне удалось [39, 40].
2. Основнаячасть
2.1Методика отбора штаммов микроорганизмов, способных
растворятьфосфорорганические соединения
Отборштаммов проводили по методике, представленной в [41].
Музейнуюкультуру, хранящуюся в холодильнике при t 4-80С на агаризованной среде, наносят на твердуюминеральную среду с добавлением раствора глюкозы и метилфосфонатов кальция,железа и алюминия и выращивают посевной материал в течение 3-4 суток при t 28-290С. Затем пообразующимся ореолам прозрачности вокруг нанесенной культуры отбирают штаммымикроорганизмов, способные улучшать растворимость метилфосфонатов.
Составпитательной среды:
Всостав среды входят следующие соли (г/л): NH4Cl –10,0; MgSO4x7H2O – 2,0; NaCl – 1,0; агар – 20г; трис(гидроксиметил)аминометан –1,0.
Источникуглерода – 40 % раствор глюкозы из расчета 1мл/л.
20 млпитательной среды переносят в пробирку и добавляют метилфосфонаты в виде взвесиконцентрацией 1 г/мл.
2.2Методика культивирования микроорганизмов
Используютстандартную методику культивирования с использованием органофосфонатов вкачестве источников фосфора.
Длякультивирования микроорганизмов используют среду MS1.
Всостав минеральной части среды входят следующие соли (г/л): NH4Cl – 2,0; MgSO4x7H2O –0,2; K2SO4 – 0,5 и микроэлементы (мг/л): FeSO4x7H2O – 2,5; CaCl2 x6H2O – 10,0; CuSO4x5H2O –2,0; H3BO3 – 0,06; ZnSO4x7H2O –20,0; MnSO4xH2O –1,0; NiCl2x6H2O – 0,05; Na2MoO4 x2H2O –0,3.
Источникуглерода – глутамат Na 10 г/л.
Источникфосфора – МФК или метилфосфонаты в концентрации 0,3 г/л. Кислые эфиры – вконцентрации 0,2 г/л.
Дляприготовления минеральной среды MS1 по 10 мл стоковых растворов 1-5последовательно вносят в 0,5 л дистиллированной воды, тщательно перемешиваяпосле добавления каждого из них, доводят рН до 6,5 20% NaOH и добавляли дистллированную воду до 1 л. Средуразливают по 100 мл в колбы для культивирования и стерилизуют автоклавированиемпри 0,5 атм 30 мин. В стерильную среду перед засевом бактерий вносят 70 млстерильного стокового раствора 1М глутамата Na, 300 мл МФК на 1 литр среды. Начальное значение рН средыдолжно составлять 7.0-7.5.
Дляприготовления твердой среды MS1добавляют к вышеописанной жидкой среде агар-агар 18 г/л, стерилизуют в подобныхусловиях. Глутамат и МФК вносят после расплавления среды перед разливом в чашкиПетри.
Музейнуюкультуру, хранящуюся в холодильнике при t 4-80С на агаризованной среде MS1 с МФК, штрихом пересевают натвердую минеральную среду MS1 стеми же источниками фосфора и выращивают посевной материал в течение 2-3 сутокпри t 28-290С.
Составстоковых растворов:
Стоковыйраствор 1. Растворить последовательно в 0,7л дистиллированной воды следующиенавески (г): NH4Cl – 200.0, MgSO4x7H2O –20.0, CaCl2 x6H2O – 1.0, довести объем до 1 л дистиллированной водой.
Стоковыйраствор 2. Растворить в 0,5 л дистиллированной воды навеску (г): K2SO4 – 50.0. Довести объем до 1 л дистиллированной водой.
Стоковыйраствор 3. Растворить в 0,5 л дистиллированной воды навеску (г): FeSO4x7H2O – 0,25. Довести рН до 4.0 20% H2SO4. Довести объем до 1 л дистиллированной водой.
Стоковыйраствор 4. Растворить последовательно в 0,5 л дистиллированной воды навески(г): CuSO4x5H2O – 0,2; ZnSO4x7H2O – 2,0; MnSO4xH2O –0,1; NiCl2x6H2O – 0,005. Довести объем до 1 лдистиллированной водой.
Стоковыйраствор 5. Растворить последовательно в 0,5 л дистиллированной воды навески(г): H3BO3 – 0,006; Na2MoO4 x2H2O – 0,03. Довести объем до 1 л дистиллированной водой.
2.3Методика проведения эксперимента по изучению возможности
деструкцииметилфосфоновой кислоты и её эфиров
Наповерхность чашки наносили 30-40 мл стерильной минеральной среды MS1 без источника углерода и фосфора,суспендируют клетки, собирают суспензию стерильной пипеткой и переносят встерильную колбу. Туда же добавляют 7 мл стерильного стокового раствора 1Мглутамата Na и инкубируют на качалке в течение1-2 суток для получения клеток голодных по фосфору. Изменение значения рН всуспензии контролируют путем нанесения капли жидкости на полоску универсальнойиндикаторной бумаги. Это значение поддерживают на уровне 7.0 — 8.0 добавлением20 % H2SO4 .
Культивированиебактерий проводят в 750 мл колбах на качалке со 180-200 об/мин при t 28-290С. Засев средыпроизводят суспензией голодных по фосфору с исходной оптической плотностью0,1-0,15 ед. Для этого определить исходную оптическую плотность суспензиибактерий и провести необходимое разбавление до плотности 0,1-0,15 ед. В колбы,содержащие 100 мл жидкой среды MS1 добавляют 7 мл стерильного стоковогораствора 1М глутамата Na иМФК или метилфосфонатов кальция, железа и алюминия из расчета 0,3 г на 1 лсмеси. Изопропилового, изобутилового и пинаколилового эфиров из расчета 0,2 гна 1 л смеси.
Отборпроб для анализов проводят через 12 часов собязательным контролем значения рН культуральной жидкости. Поддержание оптимальногодля роста значения рН 7.0-8.0 осуществляют путем внесения 20% стерильногораствора H2SO4, либо 20% стерильного раствора NaОН.
Каждыйопыт проводят минимум два раза, в опыте берут количество колб длякультивирования также минимум в двух повторностях.
2.4Методика контроля роста микроорганизмов
Росткультуры контролируют:
а) поизменению оптической плотности при длине волны 560 нм (ОП560) вкювете 1 см. на спектрофотометре. Пересчет оптической плотности на вес сухойбиомассы проводили согласно коэффициенту 0,5 (г сухих клеток/ед оптическойплотности), полученному экспериментально для бактериальных культур, выделенныхиз почвы.
б) почислу колониеобразующих единиц (КОЕ) путем высева из разведений наагаризованную среду LB.Последовательно культуральную жидкость разводят до необходимого разведения (10-6-10-8клеток/мл). Для разведения использовали стерильный физ. раствор. Из пробирки снеобходимым разведением берут 100 мкл культуральной жидкости, которую наносятна агаризованную среду LB итщательно растирают шпателем. Чашки помещают в термальную комнату (t 28-290С) на 2-3 суток.Затем подсчитывали количество колоний.
Составсреды LB: дистиллированная вода -1 литр,бакто-пептон – 10 г, дрожжевой экстракт – 5 г, NaCl –5 г, агар-агар – 18г, рН 7.0. Стерилизация:автоклавирование при 0,5 атм, 30 минут.
Длярасчета скорости роста строят кривую роста, выраженную в логарифмах. По кривойроста определяли длину лаг-фазы и логарифмическую фазу роста.
Удельнуюскорость роста рассчитывают по формуле:
m = (ln ОП2 — ln ОП1)/(t2 – t1) час-1
Экономический коэффициент мг органофосфонатов/г биомассырассчитывают по формуле:
Q = D/(A/2),
где Q — экономический коэффициент, мг органофосфонатов/г биомассы;
А — оптическая плотность в стационаре;
D — количество метаболизируемой МФК.
2.5Методика определения концентрации соединений с С-Р связью
Методопределения фосфат-иона основан на образовании окрашенного комплексногосоединения между фосфором, молибдатом аммония и малахитовым зеленым в сильнокислой среде. Количество фосфора рассчитывают по результатам измеренияпоглощения образующегося комплексного соединения при длине волны 645 нм нафотоколориметре.
Содержаниесоединений с С-Р связью определяют по разнице между количеством общего инеорганического фосфора. Концентрацию фосфора общего определяют наспектрофотометре по образованию комплекса фосфомолибдата с малахитовым зеленымпри низких значениях рН после гидролиза с персульфатом аммония, в ходе которогопроисходит разрыв С-Р связи и высвобождение фосфат-иона. Соотношениепредварительно разведенной культуральной жидкости и персульфата аммония было1:1.
Пробыкультуральной жидкости отбирали в эппендорфы для анализа, центрифугировали 10тыс. об./мин — 2 мин, супернатант хранили в замороженном виде для разрыва С-Рсвязи ГФ в стеклянных пробирках проводили гидролиз проб с персульфатом аммония.Для приготовления раствора персульфата 8 г персульфата аммония растворяли в 20мл дистиллированной Н2О. Смешивали пробу и раствор персульфата аммонияв соотношении 1:1 в стеклянных пробирках, которые закрывали фольгой изакрепляли ее резиновыми кольцами. Гидролиз проводили в течение 60 мин. при 900C на водяной бане.
Вносилив эппендорфы компоненты реакции в соотношении: 130 мкл 1н H2SO4-,130 мкл пробы, 1300 мкл раствора С. Смесьтщательно перемешивали. Через 10-15 минут измеряли ОП при длине волны 645 нм(ОП645) в кювете 1 см, в линейной области значений ОП от 0,2 до 0,5.В качестве контроля использовали образец культуральной жидкости без добавленияперсульфата аммония.
Приготовлениерастворов:
РастворА: 90 мг малахитового зеленого растворяли в 200 мл дистилированной воды приперемешивании в течение 30 мин. на магнитной мешалке;
РастворВ: 8,4 г молибдата аммония растворяли в 60 мл HСl конц в течение20 мин. при перемешивании стеклянной палочкой; после растворения молибдатааммония в HCl конц. добавляли полученный раствор к138 мл дистиллированной Н2О.
РастворС: смешивали по 200 мл растворов А и В, перемешивали в пластиковой емкости намагнитной мешалке в течение 30 мин., фильтровали полученный раствор С черезплотный бумажный фильтр в пластиковую посуду. Раствор С использовали дляанализа. Хранили в холодильнике, в течение надели. Перед каждым употреблениемфильтровали через бумажный фильтр.
3. Обсуждениерезультатов
3.1 Отборштаммов микроорганизмов-деструкторов
фосфорорганическихсоединений
Дляскрининга использовали коллекцию штаммов Pseudomonas и Alcaligenes лаборатории института биохимии ифизиологии растений и микроорганизмов РАН. В качестве субстрата использовалиМФК.
Образованиезон «просветления» на среде, содержащей МФК, представлено на рисунке 6.
/>
Рисунок6 – Образование зон «просветления» различными штаммами
1 – KR31; 2 – Sm12; 3 – Km12; 4 – 2-79; 5 – Pf-5; 6 – Q2 – 87;7 – CHAQ1;
8 – Sm11; 9 – UC 5; 10 – PCLB 91; 11 – 38а; 12 – 53a; 13 – 54; 14 – 1217;
15 –7Н; 16 – 90Н; 17 – 70А; 18 – IG1;19 – OV17; 20 – 1С7; 21 – IIД 5;
22 – VB1; 23 –OV9; 24 – 29; 25 – 19; 26 – 25р; 27 – AS15.
Каквидно из рисунка 6, наибольшей способностью к усилению растворения МФК обладаютштаммы 2-79, Pf-5, P54, 1C7,относящиеся к роду Pseudomonas fluorescens. Наилучшая способность к растворениюметилфосфонатов отмечается у штамма Sm11, относящегося к роду Alcaligenes sp.
Такимобразом, биодоступность МФК можно достичь внесением в почву штамма Sm11 бактерий рода Alcaligenes sp. Поэтому для изучения эффективности биодеструкциифосфорорганических соединений выбран именно этот штамм.
3.2 Биодеструкцияметилфосфоновой кислоты и её кислых эфиров
Излитературных данных известно, что неорганический фосфат ингибирует потреблениеорганофосфонатов в качестве источника фосфора разложение МФК [33-35]. Привыращивании посевного материала на агаризованной среде, по-видимому, возможнаэкстракция из агара и накопление в клетках более доступных, чем МФК, источниковфосфора, которые могут попадать в экспериментальную среду вместе с посевнымматериалом. Более доступный фосфор может находиться на поверхности агара,образуясь в процессе жизнедеятельности культуры из МФК при наращиваниибиомассы. Поэтому, к тому времени, как биомасса на агаризованной среде нарастетдо необходимого уровня, в клетках посевного материала могут быть запасныеисточники фосфора, за счет которых культура будет расти в среде с МФК, неразлагая его. Чтобы исключить все эти факторы необходимо иметь клетки посевногоматериала, голодные по фосфору. Для решения этой проблемы необходимо суспензиюклеток, используемую в качестве посевного материала, инкубировать в среде сглутаматом (источником углерода), но без источника фосфора в течение трехсуток. В это время можно считать клетки голодными по фосфору.
Подготовленный посевной материал использовали длязасева опытных колб с концентрацией МФК (метилфосфонатов) 0,3 г/л. Рост культурконтролировали по изменению оптической плотности и контролировали изменениесодержания органического фосфора и значение рН. По данным измерений оптическойплотности и концентрации загрязнителя строили кривые роста культур ипотребления источника фосфора (рисунок 7 и 8).
/>
ГЛУТАМАТ
контроль
80
20
60
время, ч
40
2
3
5
4
1
оптическая плотность, отн.ед. />
/>Рисунок7 – Динамика роста штамма Sm11 в среде, содержащей МФК
концентра-
ция, мг/л
время, ч />/>
Рисунок 8 – Изменение концентрации МФК
В рассматриваемых системах различают следующие фазыразмножения:
лаг-фаза – период между засевом и началомразмножения;
экспоненциальная фаза – период размножениямикроорганизмов с постоянной скоростью;
фаза гибели – период, в течение которого популяцияпогибает.
Как видно из рисунка 7, рост культуры на среде,содержащей МФК, начинался после непродолжительной лаг-фазы – не более 10 часов,затем наблюдался значительный рост микроорганизмов. Концентрация МФК уменьшаетсяв 2 раза в течение 40 -45 часов (рисунок 8). После 58 – 62 часов рост культурыи потребление МФК прекращалось, что обусловлено недостатком в питательной средеисточника углерода. При добавлении глутамата натрия рост клеток возобновлялся,и наблюдалось дальнейшее уменьшение концентрации МФК.
Для оценки возможностибиодеструкции изопропилового, изобутилового и пинаколилового эфировиспользовали отобранный ранее штамм Sm11 рода Alcaligenes sp.
Начальная концентрация кислого эфира составляла 0,2 г/л.Рост культур контролировали по изменению оптической плотности. По даннымизмерений оптической плотности и концентрации загрязнителя строили кривые ростакультур и потребления кислых эфиров.
Динамика роста культуры и потребления изопропиловогоэфира представлена на рисунке 9 и 10.
/>
ГЛУТАМАТ />/>
время, ч
оптическая плотность, отн.ед. Рисунок 9 – Динамика роста штамма Sm11 всреде, содержащей изопропиловый эфир МФК
/>
время, ч
концентра-
ция, мг/л />/>/>
Рисунок10 – Изменение концентрации изопропилового эфира МФК
Каквидно из рисунка 9, рост культуры на среде, содержащей изопропиловый эфир,начинался практически без лаг-фазы, сразу наблюдался значительный рост микроорганизмов.При этом наблюдается уменьшение концентрации изопропилового эфира в 1,6 раза втечение 42 часов (рисунок 10). После 40-50 часов рост культуры прекращался, чтообусловлено недостатком в питательной среде источника углерода. При добавленииглутамата натрия рост культуры возобновлялся.
Аналогичная тенденция выявлена и для изобутилового эфира (рисунок 11и 12).
оптическая плотность, отн.ед.
время, ч
ГЛУТАМАТ />/>/>
Рисунок 11 – Динамика роста штамма Sm11в среде, содержащей изобутиловый эфир МФК
Каквидно из рисунка 11, рост культуры среде, содержащей изобутиловый эфир МФК,начинается практически сразу, без лаг-фазы. После 80 часов рост штамма Sm11 прекращается, что обусловленоотсутствием в среде источника углерода. Затем рост культуры возобновляется.Изменение концентрации изобутилового эфира представлено на рисунке 12.
/>
/>
Рисунок12 – Изменение концентрации изобутилового эфира МФК
Как показано на рисунке 12, концентрация изобутилового эфира МФКуменьшается в 1,7 раза в течение 70 – 90 часов.
Рост штамма Sm11 рода Alcaligenes spв среде, содержащей пинаколиловый эфир, и уменьшение концентрации загрязнителяпредставлены на рисунках 13 и 14 соответственно.
оптическая плотность, отн.ед.
ГЛУТАМАТ />/>
время, ч />
Рисунок 13 – Динамика роста штамма Sm11бактерий рода Alcaligenes sp
/>
/>
·
/>
/>
Рисунок14 – Изменение концентрации пинаколилового эфира МФК
Как показано на рисунках 13 и 14, рост культуры на питательнойсреде, содержащей пинаколиловый эфир МФК, также характеризуетсянепродолжительной лаг-фазой, однако биодеструкция эфира происходит интенсивнее:концентрация пинаколилового эфира МФК уменьшается в 1,7 раза в течение 50 – 70часов.
На основании полученных данных определяли вес сухойбиомассы, удельная скорость роста, экономический коэффициент. Результатыпредставлены в таблице 6.
Таблица 6 – Основные параметры роста культуры вприсутствии метилфосфоновой кислоты и ее кислых эфиров Параметр МФК изопропило-вый эфир
изобутило-
вый эфир пинаколило-вый эфир Биомасса, г/л 2,7 0,9 0,95 1,05
Максимальная скорость роста, ч-1 0,16 0,05 0,04 0,05 Количество метаболизируемого загрязнителя, мг лаг-фаза 25 46 28 20 весь период 168 100 102 105
Экономический
коэффициент,
мг загрязнителя / г биомассы лаг-фаза 200 60,5 42,4 25,0 весь период 62 55,5 53,7 50,0
Каквидно из таблицы 6, в присутствии кислых эфиров культура Sm11 характеризуется невысокой скоростьюроста 0,04 – 0,06 ч-1. Причем рост культуры начинается практическисразу, без лаг-фазы. Рост биомассы прекращался спустя 40-50 часов вследствиеполного потребления источника углерода. Об этом свидетельствует тот факт, чтопосле добавочного внесения глутамата натрия рост возобновлялся Для культуры Sm11 отмечается и высокая величинапотребления метилфосфонатов в расчете на единицу биомассы. Следует отметить,что экономический коэффициент культуры в лаг-фазе и за весь период отличаетсянезначительно: для изопропилового эфира составляет 60,5 и 55,5 мг загрязнителя/гбиомассы соответственно. Однако для пинаколилового эфира данный показательотличается в два раза и составляет
25,5и 50,0 мг загрязнителя/г биомассы соответственно. Характерным отличием роста культурына среде, содержащий пинаколиловый эфир, является более продолжительнаялаг-фаза, на протяжении которой метабилизируется меньшее количество эфира – 20мг по сравнению с 46 мг изопропилового эфира, однако количество поглощенногопинаколилового эфира за весь период выше — 105 мг.
Порезультатам количественной оценки культур – накоплению биомассы, удельнойскорости роста и эффективности разложения соединений с С-Р связью был отобраннаиболее активный штамм Sm11рода Alcaligenes sp.
3.3 Пути метаболизмаорганофосфонатов
Процессы биодеструкциилюбых соединений не могут быть оценены без изучения путей метаболизма имеханизма их регуляции. Применительно к нашей работе проводится сравнительноеизучение механизмов деструкции соединений с С-Р связью.
Штаммы-деструкторы МФКосуществляют расщепление С-Р связи посредством ферментной системы с участиемС-Р лиазы, доказательством чему служит обнаружение метана в газовой фазе прикультивировании в среде с МФК в количествах, эквимолярных потребленномуисточнику фосфора:
С – Р лиаза />
Глифосатметаболизируется через аминометилфосфоновую кислоту (АМФК). Об этомсвидетельствует идентификация глиоксилата как продукта расщепления ГФпосредством глифосат-оксидоредуктазы. При реализации этого пути фосфат-ионотщепляется на последующих стадиях при участии фосфонатазы.
/>
МФК идругие фосфонаты выступают в роли прекурсоров фосфат-иона в процессахбиодеградации фосфорорганических соединений с участием широкого спектраприродных микроорганизмов, находящихся в условиях фосфорного голодания.
Выводы
1Проведен анализ литературных данных о существующих технологиях реабилитациизагрязненных почв. Показано, что биологические методы санации территорий, загрязненныхпродуктами деструкции фосфорорганических отравляющих веществ, наиболее экологическибезопасны, эффективны, экономичны и выгодно отличаются отсутствием вторичныхотходов.
2 Проведенскрининг микроорганизмов-деструкторов фосфорорганических соединений. Наилучшаяспособность к растворению метилфосфонатов отмечается у штамма Sm11, относящегося к роду Alcaligenes sp.
3 Изученавозможность биодеструкции продуктов разложения фосфорорганических отравляющихвеществ: метилфосфоновой кислоты и её изопропилового, изобутилового,пинаколилового эфиров. Установлено, что штамм Sm11 родаAlcaligenes spявляется активным деструктором метилфосфоновой кислоты и её кислых эфиров:наблюдается уменьшение концентрации метилфосфоновой кислоты в 2 — 2,2 раза втечение 40 -45 часов, кислых эфиров – в 1,6 — 1,7 раза в течение 50 — 70 часов.Показано, что культура характеризуется высокой удельной скоростью роста 0,04 — 0,05 ч-1 как в присутствии метилфосфоновой кислоты, так и кислыхэфиров.
Списокиспользованных источников
1. Конвенция о запрещенииразработки, производства, накопления и применения химического оружия и о егоуничтожении. ООН, Женева, 1993. — 170 с.
2. Федеральный закон РФ №76-ФЗ от 2 мая 1997 г. (с изменениями от 29 ноября 2001 г., 10 января 2003 г.)«Об уничтожении химического оружия».
3. Федеральный закон РФ №136-ФЗ от 7 ноября 2000 г. «О социальной защите граждан, занятых на работах схимическим оружием».
4. Федеральная целеваяпрограмма «Уничтожение запасов химического оружия в Российской Федерации».Постановление Правительства РФ от № 969 от 29 декабря 2007 г. – М., 2008. – 28с.
5. Холстов В.И., Тарасевич Ю.В., Григорьев С.Г. Пути решенияпроблемы безопасности объектов по уничтожению химического оружия // Ж. росс.хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. — 1995. — Т.39. — №4. – С. 65-73.
6. Скоробогатова В.И., Щербаков А.А., Мандыч В.Г. Санация загрязненныхтерриторий в районах хранения и уничтожения химического оружия. — Российскийхимический журнал им. Д.Менделеева. – 2007. – том LI – выпуск 2. – С.71-74.
7. Маршалл В. Основныеопасности химических производств. – М.: Мир, 1989. – 672 с.
8. Горский В.Г., МоткинГ.А., Петрунин В.А. и др. Научно-методические аспекты анализа аварийного риска.– М.: Экономика и информатика, 2002. – 260 с.
9. Организация иосуществление санитарно-эпидемиологического надзора на объектах по уничтожениюфосфорорганических отравляющих веществ: Методические указания (временные)//Сборник инструктивно-методических документов по проблеме уничтоженияхимического оружия: Часть II.Фосфорорганические отравляющие вещества: Том 1 / ФУМБЭП при МЗ РФ. – Москва,2001. — С. 187-243.
10. Правила безопасностиобъектов по УХО на основе ФОВ. – М.: Российское агентство по боеприпасам, 2003.- С. 66.
11. Радилов А.С., ШкаеваИ.Е., Николаев А.И. и др. Экспресс-оценка особо опасных химических соединений вобъектах окружающей среды// Научно-технические аспекты обеспечения безопасностипри уничтожении, хранении и транспортировке химического оружия. Тез. докл. научно-практическойконференции. – Москва, 2004. – С. 161-162.
12. Методика определенияплощади защитных мероприятий, устанавливаемой вокруг объектов по хранению ХО иОУХО. — М.: МО РФ, 1999. – 98с.
13. Методика расчетаконцентраций в атмосферном воздухе вредных веществ, содержащихся в выбросахпредприятий (ОНД-86). Л.: Гидрометео-издат, 1987. – 111 с.
14. ПостановлениеПравительства РФ «Об утверждении площади ЗЗМ, устанавливаемой вокруг объекта похранению химического оружия (пос. Марадыковский Кировской области) и перечнянаселенных пунктов, включаемых в указанную зону от 29.12.2004 № 867. – Москва,2004. – 5 с.
15. Методикапрогнозирования масштабов заражения сильнодейству-ющими ядовитыми веществамипри авариях (разрушениях) на химически опасных объектах и транспорте. РД52.04.253 – 90. Л.: Гидрометеоиздат, 1991. – 56 с.
16. Методика определенияплощади защитных мероприятий, устанавливаемой вокруг объектов по хранению ХО иОУХО. — М.: МО РФ, 1999. – 84 с.
1.7 Мурин А.В.Математическое моделирование на параллельных системах последствий химическихаварий. – Автореф. Дис.… канд. физ.-мат. Наук /Ижевск — ИжГТУ, 2002 — 24 с.
18. Тронин С.Я., Мещеряков Е.М., Хромов М.Н. Организация защиты населения при аварияхна объектах хранения и уничтожения химического оружия// Ж. росс.хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. – 2002. — т. 36. — № 6. - С. 112-117.
19. Сильнодействующиеядовитые вещества и защита от них. Под ред. В.А. Владимирова. – М.: Воениздат,1989. – 109 с.
20. Евстафьев И.Б.,Холстов В.И., Григорьев С.Г. Методические основы оценки аварийной опасностиобъектов по хранению и уничтожению химического оружия // Ж. росс. хим. об-ваим. Д.И. Менделеева. — 1993. — Т. 37, №3. С.5 0-59.
21. Скоробогатова В.И, Кобцов С.Н., Щербакова Л.Ф., Мандыч В.Г., Сотников Н.В, Щербаков А.А. Особенности поведенияфосфорорганических отравляющих веществ в воде и почве — Сборник №5 научныхтрудов СВИРХБЗ. – Саратов, 2005.- С.152-155.
22. Александров В.Н.,Емельянов В.И. Отравляющие вещества. – М.: Воениздат, 1990. – 271 с.
23. Ашихмина Т.Я.Научно-методологические основы системы комплексного экологического мониторингаобъектов хранения и уничтожения химического оружия. — Киров.: Вятка, 2001. –473 с.
24. Савельева Е.И.,Зенкевич И.Г., Кузнецова Т.А. и др. Исследование продуктов превращенийфосфорорганических отравляющих веществ методом газовой хроматографии –масс-спектрометрии //Ж. росс. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. — 2002. — Т. 46.- №6. – С.89-92.
25. Савельева Е.И.,Радилов А.С., Кузнецова Т.А. и др. Определение метилфосфоновой кислоты и ееэфиров как химических маркеров фосфорорганических отравляющих веществ — Журналприкладной химии. 2001, Т. 74, № 10. — 1677 с.
26. Франке З., Франс П.,Варнке В. Химия отравляющих веществ. Т. 1. — М.: Химия, 1973. – 270 с.
27. Скурлатов Ю.И., ДугаГ.Г. Введение в экологическую химию. – Учебное пособие. М.: Высш. Шк., 1994. –400с.
28. Корте Ф., Бахадир М. и др. Экологическая химия / Пер. с нем. подред.- Корте. М.: Мир, 1996. — 396 с.
29. Безопасность России:Правовые, социально-экономические и научно-технические аспекты. Региональныепроблемы России с учетом риска и возникновения природных и техногенныхкатастроф// В.И. Осипов, Ю.А. Мамаев, В.А. Королев.- М.: МГФ «Знание», 1999. –144 с.
30. Орлов Д.С. Химия иохрана почв. М.: Химия, 1996. – 175с.
31. Королёв В.А., Некрасова М.А. Экспериментальные исследованияэлектрохимической миграции ионов металлов в дисперсных породах// Геохимия. 1998. № 12. С. 1277-1283.
32. Small M.J. Compoundsformed from the chemical decontamination of HD, GB, and VX and theirenvironmental fate. Tech Rpt8304; AD A149515. Fort Detrick, MD:U.S. ArmyMedical Bioengineering Research and Development Laboratory – 1984.
33. Schowanek D. andVerstraete W. Phosphonate utilization by bacterial cultures and enrichmentsfrom environmental samples / Schowanek D. and Verstraete W.//Appl.Environ.Microbiol – 1990.-V. 56.-P. 895-903.
34. Smith J.D.Metabolism ofPhosphonates. – In: The role of phosphonates inliving systems (Hilderbrand, R.L., ed.) CRC Press, Boca Raton – 1983.-P. 31-54.
35. Selvapandiyan A. andBhatnagar Raj K. Isolation of glyphosate-metabolising Pseudomonas: detection,partial purification and localization of carbon-phosphorus lyase /Selvapandiyan A. and Bhatnagar Raj K. // Appl. Microbiol. Biotechnol – 1994.-V40.-P. 876-882.
36. ShinabargerD.L. and Braymer H.D. Glyphosate catabolism by Pseudomonas sp. strain PG2982. /Shinabarger D.L. and Braymer H.D. // J Bacteriol – 1986.-V. 168.-P. 702-703.
37. Shames S.L.Fragmentative and stereochemical isomerisation probes for homolytic carbon tophosphorus bond scission catalysed by bacterial carbon-phosphorus lyase /Shames S.L., Wackett L.P., LaBarge M.S., Kuczkowski R.L. and Walsh C.T. //Bioorg.Chem. – 1987.-V 15.-P. 366-373.
38. Матыс С.В. Деградацияметилфосфоната Е. coli:физиологические и биохимические аспекты / Матыс С.В. // Диссертация – 2003. –С. 56.
39. Нифантьев Э.Е. Химия фосфорганическихсоединений / Нифантьев Э.Е. — М.: 1971.
40. Кононова С.В. и Несмеянова М.А. Фосфонаты и их деградациямикроорганизмами / Кононова С.В. и Несмеянова М.А. // Биохимия- 2002.- Т. 67.-С. 220-233.
41.GoldsteinA.H., Liu S.T. Molecular cloning and regulation of a mineral phosphatesolubilizing gene from Erwinia herbicola – Biotechnology, 1987, v.5 — Р. 72-74.