/>/>/>Министерствосельского хозяйства РФ/>/>/>ФГОУ ВПО/>/>/>«Оренбургскийгосударственный аграрный университет»/>КУРСОВАЯ РАБОТА/>/>/>по биохимии натему:/>/>/>Ингибированиеферментативной активности
Оренбург – 2010
Содержание
1.Ингибиторы ферментов. Типы ингибирования активности ферментов
1.1Обратимое ингибирование
1.1.1Конкурентное ингибирование
1.1.2Неконкурентное ингибирование
1.1.3Бесконкурентное ингибирование
1.2Необратимое ингибирование
1.3Аллостерическое ингибирование
2.Новый вид ингибирования ферментативной активности
3.Применение ингибиторов ферментов
ЗАКЛЮЧЕНИЕСписокиспользованной литературы
1. Ингибиторыферментов. Типы ингибирования активности ферментов
Известно,что активность ферментов сравнительно легко может быть уменьшена с помощьюразнообразных воздействий. Такое снижение скорости ферментативных реакцийпринято называть торможением активности, или ингибированием ферментов.
/>
Рис1. Схема активирования и ингибирования действия фермента (по Ю. Б.Филипповичу): а. – аллостерический центр фермента; К — каталитический центр; с- субстратный центр
Ферментыявляются белками, соответственно их активностьможно снизить или полностью ликвидировать путем воздействий, приводящих кденатурации белков (нагревание, действие концентрированных кислот, щелочей,солей тяжелых металлов и т.п.) Это неспецифическое подавление активностиферментов, имеющее значение при изучении ферментативных реакций, непредставляет особого интереса для исследования их механизма. Гораздо большеезначение имеет исследование ингибирования с помощью веществ, специфически иобычно в небольших количествах взаимодействующих с ферментами – ингибиторовферментов. Расшифровка механизмов многих биологических процессов, таких какгликолиз, цикл Кребса и других, стала возможной лишь в результате примененияспецифических ингибиторов различных ферментов (Н.Е. Кучеренко, Ю.Д. Бабенюк идр., 1988).
Некоторыеингибиторы ферментов являются для организма животных и человека эффективнымилекарственными веществами, другие — смертельными ядами (В.П. Комов, В.Н.Шведова, 2004).
Ингибиторывзаимодействуют с активными центрами молекулы фермента, инактивируяфункциональные группы белков. Они могут взаимодействовать с металлами, входящимив состав молекул ферментов и фермент-субстратных комплексов, инактивируя их.Высокие концентрации ингибиторов разрушают четвертичную, третичную и вторичнуюструктуры молекулы фермента, вызывая его денатурацию (А.И. Кононский, 1992).
Недавно открыты антиферменты (антиэнзимы, или антизимы), представляющиесобой белки, действующие как ингибиторы ферментов. К подобным веществамотносятся, например, ингибитор трипсина, обнаруженный в соевых бобах, исывороточный антитрипсин. Недавно открыт в печени животных антиферменторнитиндекарбоксилазы. Антизимы, вероятнее всего, образуют труднодиссоциируемыекомплексы с соответствующими ферментами, выключая их из химических реакций.Иногда ингибитор является составным компонентом предшественника фермента, иливходит в состав сложных комплексов ферментов. Однако до сих пор не выяснено,являются ли подобные антиферменты истинными ингибиторами или регуляторнымисубъединицами.
Еслиингибитор вызывает стойкие изменения пространственной третичной структурымолекулы фермента или модификацию функциональных групп фермента, то такой типингибирования называется необратимым. Чаще, однако, имеет место обратимоеингибирование, поддающееся количественному изучению на основе уравненияМихаэлиса-Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют наконкурентное и неконкурентное
Напрактике многие ингибиторы не проявляют тех свойств, которые характерны длячисто конкурентного или чисто неконкурентного ингибирования. Другой способклассификации ингибиторов основывается на характере места их связывания. Однииз них связываются с ферментом в том же месте, что и субстрат (в каталитическомцентре), а другие — на значительном расстоянии от активного центра (валлостерическом центре) (Р. Марри, Д. Греннер и др., 1993).1.1 Обратимое ингибирование Различают три типа обратимогоингибирования ферментов: конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное, взависимости от того, удается или не удается преодолеть торможениеферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.1.1.1 Конкурентное ингибирование
Конкурентныйингибитор конкурирует с субстратом за связывание с активным центром, но вотличие от субстрата связанный с ферментом конкурентный ингибитор неподвергается ферментативному превращению. Отличительнаяособенность конкурентного ингибирования состоит в том, что его можно устранитьили ослабить, просто повысив концентрацию субстрата. Например, если призаданных концентрациях субстрата и конкурентного ингибитора активность ферментаподавлена на 50 %, то мы можем уменьшить степень ингибирования, повысивконцентрацию субстрата.
Посвоей трехмерной структуре конкурентные ингибиторы обычно напоминают субстратданного фермента. Благодаря такому сходству конкурентному ингибитору удается «обмануть»фермент и связаться с ним. Конкурентное ингибирование можно количественноизучать на основе теории Михаэлиса-Ментен. Конкурентный ингибитор Iпросто обратимо присоединяется к ферменту Е, образуя с ним комплекс
Е+ I =EI.
Конкурентноеингибирование проще всего можно распознать экспериментальным путем, определиввлияние концентрации ингибитора на зависимость начальной скорости реакции отконцентрации субстрата. Для выяснения вопроса о том, по какому типу — конкурентномуили неконкурентному — происходит обратимое ингибирование фермента, используютметод двойных обратных величин. Из графиков, построенных в двойных обратныхкоординатах, можно определить также значение константы диссоциации комплексафермент ингибитор (см. рис. 1) (А. Ленинджер, 1985)
Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющимиструктуру, похожую на структуру субстрата, но несколько отличающуюся отструктуры истинного субстрата. Такое ингибирование основано на связыванииингибитора с субстратсвязывающим (активным) центром (см. рис. 2).
/>
Рис. 2. Общийпринцип конкурентного ингибирования (схема по В.Л. Кретовичу). Е — фермент; S — субстрат; Р1 и Р2 — продукты реакции; I — ингибитор.
В качестве примера можно привести действие малоновой кислоты на реакцию,которая катализируется сукцинатдегидрогеназой и связана с превращением янтарнойкислоты в фумаровую. Добавление малоновой кислоты к реакционной смеси снижаетили полностью останавливает ферментативную реакцию, так как она являетсяконкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы. Сходства малоновой кислоты сянтарной достаточно для образования комплекса с ферментом, однако распад этогокомплекса не происходит. При увеличении концентрации янтарной кислоты онавытесняет малоновую кислоту из комплекса, в результате активностьсукцинатдегидрогеназы восстанавливается.
/>
Рис. 3. Конкурентное ингибирование реакции превращения янтарной кислоты в фумаровуюпод действием малоновой кислоты.
Структуры субстрата (сукцинат) и ингибитора (малонат) все же несколькоразличаются. Поэтому они конкурируют за связывание с активным центром, истепень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната исукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Таким образом, ингибиторможет обратимо связываться с ферментом, образуя фермент-ингибиторный комплекс.Этот тип ингибирования иногда называют ингибированием по типу метаболическогоантагонизма (см. рис. 3).
В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может бытьпредставлена следующим уравнением:
/>
Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комплексом ЕI, вотличие от фермент-субстратного комплекса ES не распадается с образованиемпродуктов реакции.
Многие лекарственные вещества ингибируют ферменты человека и животных поконкурентному типу. Например, что для лечения некоторых инфекционныхзаболеваний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты.Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойнойкислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты,являющейся составной частью ферментов бактерий. Благодаря этому структурномусходству сульфаниламид блокирует действие фермента путем вытесненияпарааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевуюкислоту, что ведет к торможению роста бактерий.
/>
Вструктуру пептидогликана клеточной стенки бактерий включен D-аланин,отсутствующий в организме животных и человека. Для синтеза клеточной стенкибактерии при помощи фермента аланин-рацемазы превращают L-аланинживотных в D-форму. Аланин-рацемазахарактерна для бактерий и не обнаружена у млекопитающих. Следовательно, онапредставляет хорошую мишень для ингибирования лекарственными препаратами.Замещение одного из протонов метильной группы на фтор дает фтораланин, скоторым связывается аланин-рацемаза, что приводит к ее ингибированию.
Некоторые аналоги витамина В6 и фолиевой кислоты, в частностидезоксипиридоксин и аминоптерин, действуют как конкурентные, так называемыекоферментные, ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие интенсивнопротекающие при патологии биологические процессы в организме. Применениеподобных аналогов в медицинской практике (в частности, в дерматологии ионкологии) основано на конкурентном вытеснении коферментов изсубстратсвязывающих центров ключевых ферментов обмена (Т.Т Березов, Б.Ф.Коровкин, 1990).
Такимобразом, можно конструировать лекарственные вещества, ингибирующие ферменты поконкурентному типу. Чтобы быть эффективным, ингибитор должен иметь высокоесродство к ферменту. В противном случае необходимо назначать большие дозылекарственных препаратов, чтобы активно конкурировать с эндогенным субстратомза активный центр фермента (В.П. Комов, В.Н. Шведова, 2004).1.1.2 Неконкурентное ингибирование
Неконкурентноеингибирование тоже обратимо, но не может быть ослаблено или устраненоповышением концентрации субстрата
Вслучае неконкурентного ингибирования ингибитор присоединяется к ферменту не вактивном центре, где связывается субстрат, а совсем в другом месте. При этомконформация молекулы фермента изменяется таким образом, что происходитобратимая инактивация его каталитического центра. Неконкурентные ингибиторысвязываются обратимо как со свободным ферментом, так и с комплексом ES,образуя неактивные комплексы EIи ESI.
Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурногосходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другомместе молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяетсяпродолжительностью действия ингибитора на фермент. При данном типеингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент частоподвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым(Н.З. Хазипов, А.Н. Аскарова, 2001).
Использованиеграфиков, построенных в двойных обратных координатах для анализа данных,полученных при исследовании ингибирования ферментативных реакций, позволяетлегко отличать конкурентные ингибиторы от неконкурентных.
Наиболееважные неконкурентные ингибиторы представляют собой образующиеся в живыхорганизмах промежуточные продукты метаболизма, способные обратимо связыватьсясо специфическими участками на поверхности некоторых регуляторных ферментов иизменять при этом активность их каталитических центров. Примером может служитьингибирование L-треониндегидратазы L-изолейцином(А. Ленинджер, 1985).
Примеромнеобратимого ингибирования является действие йодацетата, ДФФ, а такжедиэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты. Это действие заключаетсяв связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов и молекулефермента.
Следует указать, что неконкурентное ингибирование также может быть обратимыми необратимым, поскольку отсутствует конкуренция между субстратом и ингибиторомза активный центр. Примеры необратимого ингибирования приведены ранее. Приобратимом неконкурентном ингибировании субстрат S и ингибитор I связываются сразными центрами, поэтому появляется возможность образования как комплекса EI,так и тройного комплекса EIS; последний может распадаться с освобождениемпродукта, но с меньшей скоростью, чем комплекс ES.
/>
Этот тип неконкурентного ингибирования чаще всего наблюдается у ферментов,катализирующих превращения более одного субстрата, когда связывание ингибиторане блокирует связывание субстрата с активным центром. Ингибитор при этомсоединяется как со свободным ферментом, так и с ES-комплексом (Т.Т. Березов,Б.Ф. Коровкин, 1990). 1.1.3 Бесконкурентноеингибирование
Вредких случаях степень торможения активности фермента может увеличиваться сповышением концентрации субстрата. Для этого типа торможения был предложентермин «бесконкурентное ингибирование».
Бесконкурентноеингибированиеимеет место, когда ингибитор взаимодействует с ферментом только в составефермент-субстратного комплекса, препятствуя его распаду (Уэбб Л., 1966).
Примеромнеобратимого действия ингибиторов на ферменты могут служить фосфорорганическиевещества, применяемые в качестве инсектицидов.
Известно, кроме того, так называемое бесконкурентное ингибирование, когдаингибитор связывается с ферментом также в некаталитическом центре, однако не сосвободным ферментом, а только с ES-комплексом в виде тройного комплекса ESI (Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин,1990).
/>
При бесконкурентном ингибировании ингибитор связывается только сфермент-субстратным комплексом, но не со свободным ферментом. Субстрат, связываясьс ферментом, изменяет его конформацию, что делает возможным связывание сингибитором. Ингибитор, в свою очередь, так меняет конформацию фермента, чтокатализ становится невозможным
Один из механизмов такого торможения обусловлен возможностью соединенияингибитора с комплексом ES с образованием неактивного или медленно реагирующеготройного комплекса EIS (Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин, 1990).
Ингибирование субстратом — частный случай бесконкурентного ингибирования,когда две молекулы субстрата связываются с ферментом, что препятствуетобразованию продукта
Активностьмногих ферментов тормозится избытком субстрата, причем имеется несколькомеханизмов этого процесса.
1) Еслив образовании фермент-субстратного комплекса участвует несколько функциональныхгрупп фермента, то возможно одновременное присоединение к активному центру двухили более субстратов, что однозначно приведет к образованию неактивногокомплекса.
2) Вслучае избытка субстрата возможно его присоединение не только к активномуцентру, но и к другим химическим группировкам, функционально связанным сактивным центром. Такого рода взаимодействие может помешать ферментативнойреакции.
3) Увеличениеконцентрации субстрата может повысить ионную силу реакционной среды и, какследствие, затормозить скорость ферментативной реакции.Торможение продуктами реакции связано с тем, что они могут связыватьсяс ферментом или с каким-либо другим компонентом системы таким образом, чтоскорость прямой реакции снижается.
1.2 Необратимоеингибирование/>/> Необратимые ингибиторы связывают илиразрушают функциональную группу молекулы фермента, необходимую для проявленияего каталитической активности. Происходит формирование стабильного комплексаингибитора с ферментом, ведущее к его необратимой инактивации. Случайнеобратимого ингибирования можно обнаружить по тому признаку, что приразбавлении раствора не происходит повышения удельной активности фермента, какв случае обратимого ингибирования.
Примеромнеобратимого ингибитора может служить соединение диизопропилфторфосфат (ДФФ),которое ингибирует фермент ацетилхолинэстеразу, играющий важную роль в передаченервных импульсов. Ацетилхолинэстераза катализирует гидролиз ацетилхолина, функционирующегов качестве нейромедиатора в определенных отделах нервной системы. Ацетилхолинвыделяется стимулированной нервной клеткой в синапс, т.е. место соединенияодного нейрона с другим. В синапсе ацетилхолин связывается с рецепторамиследующего нейрона, вынуждая его проводить нервный импульс. Однако прежде чемвторой импульс будет передан через синапс следующему нейрону, ацетилхолин,выделившийся после первого импульса, должен быть гидролизованацетилхолинэстеразой в месте соединения нервных клеток. Продукты его распада — ацетат и холин — не способны действовать как нейромедиаторы. Необратимыйингибитор ДФФ, обладающий высокой реакционной способностью, присоединяется кгидроксильной группе остатка серина в активном центре ацетилхолинэстеразы, чтоприводит к образованию каталитически неактивного производного. В результатефермент перестает функционировать. ДФФ, одно из первых отравляющих веществ нервнопаралитическогодействия, в опытах на животных вызывает нарушение некоторых функций вследствиетого, что пораженные нейроны утрачивают способность проводить нервные импульсы.Однако ДФФ обладает и полезными свойствами. На его основе был создан рядотносительно нетоксичных для людей и животных инсектицидов, например малатион. Сампо себе малатион неактивен и в организме высших животных разлагается напродукты, которые считаются безвредными. В организме же насекомых малатионпревращается под действием ферментов в активный ингибитор их собственнойацетилхолинэстеразы.
Выяснилось,что ДФФ ингибирует целый класс ферментов, многие из которых способныкатализировать гидролиз пептидов или эфирных связей. К этим ферментам относитсяне только ацетилхолинэстераза, но и трипсин, химотрипсин, эластаза,фосфоглюкомутаза и коконаза (фермент, выделяемый личинкой тутового шелкопряда ииспользуемый ею для гидролиза шелковых нитей и освобождения из кокона).Характерная особенность всех ферментов, ингибируемых ДФФ, состоит в том, чтоони содержат в активном центре остаток серина, принимающий участие вкаталитическом акте
Другойнеобратимый ингибитор некоторых ферментов, иодацетамид может взаимодействоватьс сульфгидрильными (—SH)группами остатков цистеина или с имидазольными группами остатков гистидина,содержащихся в активных центрах этих ферментов. С помощью таких ингибиторовбыло установлено, что гидроксильная группа серина, тиоловая группа цистеина иимидазольная группа гистидина участвуют в каталитической активности ферментов,принадлежащих к разным классам.1.3 Аллостерическое ингибирование
Аллостерическиеингибиторы связываются с отдельными участками фермента вне активного центра.Такое связывание влечет за собой конформационные изменения в молекуле фермента,которые приводят к уменьшению его активности. Аллостерические эффектывстречаются практически только в случае олигомерных ферментов. Кинетику такихсистем нельзя описать с помощью простой модели Михаэлиса-Ментен.
Так, йодацетат IСН2—СООН, его амид и этиловый эфир,пара-хлормеркурибензоат ClHg—С6Н4—СООН и другие реагентысравнительно легко вступают в химическую связь с некоторыми SH-группамиферментов. Если такие группы имеют существенное значение для акта катализа, тодобавление подобных ингибиторов приводит к полной потере активности фермента:
R-SH + IСН2—СООН —> НI +R—S—CH2—COOH
Действие ряда других ферментов (холинэстераза, трипсин и химотрипсин) сильнотормозится некоторыми фосфорорганическими соединениями, например ДФФ,вследствие блокирования ключевой гидроксильной группы серина в активном центре(Северин Е.С., 2004).
2. Новыйвид ингибирования ферментативной активности
В новом исследовании напримере селективного ингибирования образования β-амилоидного белка открытновый, ранее не встречавшийся тип ингибирования. Принципиально новый типингибирования ферментативных реакций открывает новые возможности по созданиюлекарств. Каждое лекарственное средство имеет свои мишени внутри организма.Чаще всего таких мишеней несколько, а точнее — много прямых и намного больше —непрямых. Это часто не позволяет спрогнозировать побочные эффекты новыхлекарственных препаратов. Однако часто неизвестны и прямые мишени, на которыедействует то или иное лекарство,— несмотря на то, что применение медикамента науровне организма устраняет болезнь. Просто известно, что препарат Х снимаетопределенные симптомы заболевания, а каким образом — остаётся загадкой.Разгадывание подобного ребуса и привело к открытию нового типа действиямедикаментов. «Обычные» ингибиторы связываются с ферментом — егоактивным центром в случае конкурентных ингибиторов или с любой другой егообластью в случае аллостерических ингибиторов. В результате такого связыванияфермент — навсегда или временно — теряет свою активность и не можеткатализировать уже никакие реакции, если, например, он специфичен более чем кодному субстрату. Ингибиторы же нового типа связываются уже не с ферментом, а ссубстратом. В результате такого «маскирования» ингибируется лишь однареакция, другие же метаболические пути, за которые отвечает данный фермент,остаются незатронутыми.
При изученииингибиторов одной из протеаз — класса ферментов, обеспечивающего расщеплениебелков в клетке, — был обнаружен новый вид ингибирования каталитическойактивности. Как описывалось выше, существует два типа ингибиторов:
1)ингибиторы Iтипа специфично связываются с активными центрами ферментов и блокируют ихдальнейшую работу.
2)ингибиторы IIтипа — вещества, которые специфически связываются с любой другой частьюфермента и меняют его конформацию на неактивную.
В статье Т. Кукара(Kukar) и соавторов описан третий, абсолютно неожиданный тип ингибирования.Обычно, в большинстве случаев, каждый фермент реагирует со строго специфическойобластью субстрата. В их случае было обнаружено, что молекула ингибиторасвязывалась именно с такой областью на субстрате, не давая ферменту произвестигидролиз белка. Т.е. ингибитор действовал не на фермент — последний оставалсяактивным, — а маскировал от него сам субстрат. Важность данной работы можнообъяснить двумя обстоятельствами. Первое — в исследовании в качестве ферментавыступала γ-секретаза, а субстрата — предшественник амилоидного белка APP(amyloid precursor protein). Именно сбои этой системы приводят к одной из самыхпечально известных болезней нашего времени — болезни Альцгеймера. И возможностьпредотвратить сбои путём ингибирования расщепления амилоидного белка являетсяодним из перспективных и реальных путей лечения и получения нового поколениялекарственных препаратов. Действительно, все существующие на сегоднямедикаменты на основе ингибиторов направлены на «выключение»ферментов.
Однако ферменты, какправило, катализируют превращения многих субстратов на разных уровнях.Ингибирование ферментов блокирует не только нежелательные процессы, но и целыйряд других, некоторые из которых могут быть жизненно важными. В результатетакого лечения часто развиваются нежелательные побочные эффекты, которыенеобходимо дополнительно корректировать. Новый способ уникален тем, что онпозволит отключать не сам фермент, а выводить из метаболизма только один из егосубстратов. Это дает в руки исследователей и медиков поистине ювелирныйинструмент, точность которого ещё будет оценена по достоинству (Томас Л. Кукар,Томас Б. Лэдд, Альфред Т. Велзел и др., 2008).
Применение ингибиторов ферментов
Изучение ингибиторов ферментов – это важная отрасль знания, имеющаяфундаментальное значение для фармакологии и токсикологии.
В медицинской практике при лечении многих заболеваний, связанных снарушениями работы различных ферментов, широко применяются лекарственныепрепараты, содержащие очень малые дозы ингибиторов соответствующих ферментов.Также широко используются при лечении инфекционных заболеваний сульфаниламидныепрепараты, обладающие антимикробным действием. Ингибиторыангиотензинпревращающего фермента широко вошли в клиническую практику ссередины 80-х годов, в первую очередь, как препараты с выраженнымантигипертензивным действием, применяемые в лечении сердечно-сосудистыхзаболеваний (Бочков В.Н., А.Б. Добровольский, 2005).
Оно находит непосредственное практическое применение, в том числе в военномделе: «нервные газы» (например зоман, зарин и др.), представляютсобой по существу специфические ингибиторы ферментов.
Использование некоторых ингибиторов ферментов в качестве инсектицидовпослужило основой для создания крупной развивающейся отрасли промышленности, ишироко применяются в различных областях сельского хозяйства, а также в бытовыхусловиях.
Ингибиторы нашли широкое применение в энзимологии при исследовании природымножественных форм ферментов и изоферментов.
Изучение действия токсических веществ in vitro, представленных ингибиторамиферментов, оказывается полезным при разработке противоядий (антидотов) к этимядовитым веществам (Диксон М., Уэбб Э., 1982).
Списокиспользованной литературы
1. МарриР., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: в 2-х томах, т.1., пер.с англ. – М.: Мир, 1993. – 384 с., ил.
2. КучеренкоН.Е., и др. Биохимия. – Киев: Высшая школа, 1988
3. ДиксонМ., Уэбб Э. Ферменты: Пер. с англ. – М.: Мир, 1982.-515 с.
4. УэббЛ. Ингибиторы ферментов и метаболизма. Общие принципы торможения. Пер. с англ.-М.: Мир, 1966
5. СеверинЕ.С. Биохимия, 2-е изд., испр.- М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. – 784с
6. БочковВ.Н., А.Б. Добровольский и др., Клиническая биохимия – 2-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-МЕД, 2005 – 512 с.