1 Открытиевитамина с и установление его структуры
1.1 Выделение
Годы после окончанияпервой мировой войны были ознаменованы бурным развитием работ, направленных на выделениенеуловимого витамина. И в США, и в Европе развернулась настоящая гонка, в финалекоторой победителя ожидали огромный научный престиж и солидная финансовая поддержка.Соломон Цильва и его группа в Листеровском институте лихорадочно пытались выделитьвитамин С из концентрированных цитрусовых соков. И хотя полученный ими препаратобладал сильнейшим антискорбутным действием, все попытки получить чистое кристаллическоевещество оставались тщетными. Крушение надежд испытала также и ведущая американскаягруппа под руководством Чарльза Кинга из Питсбургского университета. Основным камнемпреткновения было то, что витамин С, будучи углеводоподобным веществом, очень трудноподдавался очистке от других углеводов, присутствующих в концентрированных фруктовыхсоках. И тут, несмотря на кропотливую и самоотверженную работу названных групп,по иронии судьбы на сцене появился никому не известный венгерский ученый АльбертСент-Дьёрдьи.
Абсолютно безденег, но обогащенный ценным опытом, в 1922 г. Сент-Дьёрдьи очутился в датском университетскомгороде Гронинген, где получил должность ассистента профессора физиологии X. Дж.Хамбергера. Благодаря своему острому чутью он буквально почувствовал казавшуюсяневероятной связь между пигментацией кожи пациентов, страдающих болезнью Аддисона(вызванной нарушением функции надпочечников), и потемнением свежего среза картофеля,яблока и груши. Было известно, что такое потемнение вызвано нарушением окислительно-восстановительногопроцесса. Апельсины и лимоны не темнеют на срезе, и в их соке, а позже в соке капустыСент-Дьёрдьи обнаружил сильный восстановитель. Присутствие аналогичного веществабыло обнаружено им и в экстракте коры надпочечников коровы. Далее Сент-Дьёрдьи решилвыделить это соединение, которое, как он полагал, могло оказаться новым гормономнадпочечников.
После непродолжительнойи безуспешной попытки выделения, предпринятой в Лондонской лаборатории сэра ГенриДейла в начале 1925 г., он вернулся в Гронинген. Не найдя общего языка с новым руководством,Сент-Дьёрдьи отослал семью обратно в Будапешт, а сам отказался от должности и прошелчерез период глубокой депрессии. Вскоре, однако, ему улыбнулась удача. На конференциив Стокгольме он встретился с ныне всемирно известным биохимиком профессором ФредерикомХопкинсом, которому понравилась одна из его статей. Результатом этой встречи сталоприглашение работать в Кембридже. Сент-Дьёрдьи выписал семью и целиком погрузилсяв работу, сделавшую впоследствии ему имя. После многих разочарований наконец удалосьнакопить менее грамма беловатого кристаллического вещества из коры надпочечниковкрупного рогатого скота, где оно содержалось в весьма незначительных количествах(около 300 мг/кг исходного материала), а позже из апельсинового и капустного соков.Процесс выделения „восстанавливающего фактора" заключался в следующем:
1. Замороженныенадпочечники измельчали и экстрагировали метанолом, пропуская углекислый газ дляпредотвращения контакта с кислородом воздуха.
2. Восстанавливающийфактор высаживали из профильтрованного экстракта добавлением раствора ацетата свинца.
3. Осадок суспендировалив воде и добавляли серную кислоту..
При этом выпадалосадок сульфата свинца, а восстанавливающий фактор оставался в растворе.
4. Фильтрат упаривалипод вакуумом.
5. Сухой остатокснова экстрагировали метанолом и повторялистадии 2, 3 и 4.
6. Сухой остатокрастворяли в ацетоне, и при добавлении избытка петролейного эфира постепенно выпадаликристаллы восстанавливающего фактора.
Как типичный восстановитель,полученное вещество обесцвечивало йод, и исходя из суммарной массы продуктов реакции,был сделан вывод, что относительная молекулярная масса соединения равна 88,2 иликратна этому значению. Молекулярная масса, найденная методом понижения давленияпаров воды, составила около 180, что соответствовало точному значению 176,4. И,наконец, элементный анализ дал 40,7% углерода, 4,7% водорода и 54,6% кислорода,что позволило окончательно вывести формулу С6Н8О6.
Хопкинс настаивална публикации этой работы, полагая, что Сент-Дьёрдьи выделил и охарактеризовал новыйгормон углеводной природы с кислотными свойствами. Однако при сдаче статьи в печатьвозникли осложнения. Дело в том, что Сент-Дьёрдьи из озорства назвал новое соединение„ignose" (nose — нос), что, по его замыслу, должно было означать вещество углеводнойприроды с неизвестной структурой. Это название было отвергнуто редакцией, тогдаСент-Дьёрдьи представил новый вариант „Godnose" (в буквальном переводе Божийнос). И только когда рассерженный редактор пригрозил, что статья не будет опубликованадо тех пор, пока не будет выбрано подходящее название, Сент-Дьёрдьи сдался и принялпредложение редакции присвоить новому соединению название „гексуроновая кислота".Итак, в 1928 г. в Biochemical Journal эта основополагающая работа увидела свет.Несомненно, что этот забавный анекдот неоднократно всплывал в послеобеденных беседах.Интересно отметить, что в статье Сент-Дьёрдьи высказывал предположение о том, чтовосстанавливающие свойства фруктовых соков могут быть также обусловлены присутствиемгексуроновой кислоты. Еще немного — и истина была бы установлена, тем не менее идеяо том, что во всех случаях мы имеем дело с одним и тем же вездесущим веществом,уже носилась в воздухе.
В следующем годуСент-Дьёрдьи посетил США, где провел некоторое время в клинике Мэйо в Рочестере,шт. Миннесота. Многочисленные скотобойни в окрестностях Рочестера поставляли в изобилиисвежие надпочечники, и ему удалось наработать 25 г гексуроновой кислоты, что составлялонесметное богатство. Половина этого количества была немедленно отправлена в Англиюв
Бирмингем профессоруНорману Хеуорсу для структурных исследований. К сожалению, этого количества оказалосьнедостаточно для установления структуры, которая так и осталась в тот раз тайной.
Казалось, чтона протяжении всей жизни Сент-Дьёрдьи сопутствовала удача быть в нужном месте внужное время. Так оказалось и на этот раз. Последовавшее приглашение министра образованияВенгрии дало ему возможность с триумфом вернуться на родину, и летом 1930 г. Сент-Дьёрдьивступил в должность профессора медицинской химии в Сегеде, расположенном в ста миляхюжнее Будапешта. Он быстро приобрел репутацию неортодоксального и доступного руководителя,одинаково любимого и коллегами, и студентами. Годом позже ведущий сотрудник группыпрофессора Кинга из Питсбурга Джо Свирбли вернулся на родину и тоже начал работатьв Сегеде. Мысль о том, что его беловатые кристаллы могут оказаться витамином С,все больше и больше овладевала Сент-Дьёрдьи, но витамины не входили в круг его научныхинтересов, и, кроме того, он ненавидел клинические испытания. Приезд Свирбли позволилвсесторонне проверить эту идею, и к весне 1932 г. была установлена полная идентичностьгексуроновой кислоты и витамина С.
1.2 Установлениеструктуры
На этот раз бирмингемскаягруппа имела в своем распоряжении достаточное количество кристаллов. Были известнымолекулярная формула соединения (С6H8O6), точка плавления (191°С)и угол оптического вращения (+23° в воде). Тем не менее расшифровка структуры потребовалаувлекательной, почти детективной работы, так характерной для органической химиив те легендарные годы. Ответственность за работу была возложена на Эдмунда Херста,который работал под руководством Хеуорса еще в Дареме.
При кипячениив соляной кислоте кристаллы давали фурфурол с количественным выходом, что свидетельствовалоо том, что по крайней мере пять из шести атомов углерода образуют неразветвленнуюцепь. Дальнейшие опыты показали, что аскорбиновая кислота является слабой одноосновнойкислотой и сильным восстановителем. Первая стадия окисления, которая легко обратима,может быть проведена с помощью водного раствора иода, подкисленного бензохиноном,или молекулярного кислорода в присутствии солей меди при рН 5. Продукт окисления,которое приводило к отщеплению двух атомов водорода, был назван дегидроаскорбиновойкислотой (С6Н6Об)- Обратимое окисление иодом протекало аналогично известной реакциис 2,3-дигидроксималеиновой кислотой:
НООСС(ОН) = С(ОН)СООН+ I2 →НООССО — СОСООН +2HI
что позволялопредположить наличие ендиольной группировки С(ОН) = С(ОН). Сходство в спектрах поглощенияаскорбиновой
/>
Рис. 1. Реакцииендиольной группировки.
и дегидроксималеиновойкислот с единственной интенсивной полосой при 245 нм подтвердило это предположение.В дальнейшем присутствие ендиольной группировки было доказано следующим образом:1) при обработке диазометаном получалась диметиласкорбиновая кислота; 2) взаимодействиес фенилгидразином после первоначального окисления приводило к образованию озазона(рис. 3.1). Первоначально кислотные свойства аскорбиновой кислоты приписывалисьналичию карбоксильной группы. Однако было показано, что дегидроаскорбиновая кислота— это нейтральный лактон, который медленно гидролизуется, высвобождая карбоксильнуюгруппу. Легкость взаимных превращений дегидроаскорбиновой и аскорбиновой кислотуказывала на то, что
/>
/>
последняя такжеявляется лактоном. Эта точка зрения подкреплялась и тем фактом, что диметиласкорбиноваякислота, будучи нейтральным соединением, при обработке гидроксидом натрия дает натриевуюсоль без отщепления метильной группы, т. е. происходит раскрытие лактонного кольца(рис. 3.2).
Кроме того, былоизвестно, что в молекуле присутствуют еще две спиртовые ОН-группы, которые при обработкеацетоном образуют производное изопропилидена, также содержащее два енольных гидроксила.Дальнейшее окисление дегидроаскорбиновой кислоты гипоиодитом натрия в щелочной средеприводит к образованию щавелевой и L-треониновой кислот, причем последняя была идентифицированапо ее последовательным превращениям в известные со соединения — L-диметоксисукцинамиди три-О-метил-ь-треонамид. Описанные превращения помогли установить стереохимическоеродство природной L-аскорбиновой кислоты и углеводов L-ряда, а также выяснить, чтокарбонильная группа лактона соседствует непосредственно с ендиольной группировкой(рис. 3.3). Теперь необходимо было выяснить размер лактонного кольца, и это удалосьсделать в результате еще одного простого эксперимента. Было известно, что при обработкедиазометаном L-аскорбиновая кислота превращается в ди-О-метильное производное. Дальнейшееметилирование иодметаном в присутствии оксида серебра приводит к образованию тетра-О-метилированногосоединения, озонолиз которого дает единственный продукт — нейтральный эфир. Поддействием аммиака в метаноле эфир деградирует с образованием амида щавелевой кислотыи 3,4-ди-О-метил-Ь-треонамида; последний был идентифицирован по характерной для2-гидроксиамидов реакции Веермана. Так было показано, что лактонное кольцо замыкаетсяпо положению С-2 треонамида, эквиэквивалентного положению С-4 тетра-О-метиласкорбиновойкислоты (рис. 3.4). Таким образом было установлено, что аскорбиновая кислота является7-лактоном, который изображен на рис. 3.5.
Надо отметить,что в растворе в небольших количествах могут присутствовать и другие таутомерныеформы. Асимметрический центр при С-5 имеет L- конфигурацию (или S-конфигурацию согласносистеме Кана — Ингольда — Прелога). Кислотные свойства раствора аскорбиновой кислотыобусловлены ионизацией ендиольного гидроксила при С-3 (рКа 4,25), что приводит кделокализации отрицательного заряда в образующемся анионе.
/>
/>
/>
1.3 Уточнениеструктуры с помощью инструментальных методов
Развитие и совершенствованиеспектроскопических методов, последовавшее в годы после успешного установления структурыL-аскорбиновой кислоты, позволило более глубоко проникнуть в структуру молекулы.
1.3.1 Дифракциярентгеновского излучения
Впервые рентгеноструктурныйанализ L-аскорбиновой кислоты был выполнен еще в начале 30-х гг. с целью помочьструктурным исследованиям, проводимым в Бирмингеме, и фактически подтвердил выводыбирмингемской группы. В 60-е гг. в работе Хвослефа из Осло, выполненной с помощьюметодов рентгеновской и нейтронной дифракции, было обнаружено, что кристаллы аскорбиновойкислоты относятся к моноклинной пространственной группе с четырьмя молекулами вэлементарной ячейке. В кристалле существует два типа молекул (А и В) с восемью межмолекулярнымиводородными связями (рис. 3.7).
/>
Конформации молекулА и В фактически идентичны в том смысле, что в обоих случаях С-5—ОН расположенаантиперипланарно относительно С-4—Н и С-6-ОН (рис. 3.8). Соли L-аскорбиновой кислотысодержат резонансно-стабилизированный аскорбатный анион, образующийся при депротонировании
С-3—ОН. Рентгеноструктурныеданные подтверждают ожидаемое изменение длины связей в конъюгированной системе анионаО—С-3=С-2-С-1=О по сравнению с нейтральной молекулой (табл. 3.2).
/>
Во многих соляхаскорбиновой кислоты суммарный эффект координированного иона металла и водородногосвязывания приводит к тому, что С-6—ОН находится в синклинальной (или гош)
ориентации относительноС-5—ОН.
1.3.2 Ультрафиолетоваяспектроскопия
УФ-спектр L-аскорбиновойкислоты при рН 2 имеет максимум поглощения при 243 нм (е = 10 000 моль~1дм3см~1),который при рН 7,0 сдвигается в красную область к 265 нм (е = 16 500моль_дм3см~1)за счет депротонирования С-3—ОН группы.
Эти изменениясоответствуют π → π* электронному переходу в сопряженной двойнойуглерод-углеродной связи пятичленного лактонного кольца.
1.3.3 Инфракраснаяспектроскопия
В ИК-спектре L-аскорбиновойкислоты имеется ряд интересных
максимумов поглощения.(рис.3.9)
/>
/>
Особенный интереспредставляет область валентных колебаний
О—Н от 4000 до2000 см -1 (рис.3.10).
Так как длиныводородных связей (и соответственно прочность) в кристалле известны, можно провестикорреляцию этих максимумов поглощения и характеристических валентных колебаний ОН-групп,участвующих в образовании водородных связей. Очевидно, что четыре отчетливых пикав высокочастотном крыле спектра соответствуют спиртовым ОН-группам при С-5 и С-6боковой цепи (табл. 3.3).
/>
Енольные гидроксилыпри С-2 и С-3 участвуют в образовании более прочных водородных связей с укороченнымрасстоянием О-О (0,261-0,267 нм), что выражается в виде сложной серии уширенныхполос в области 3100-2200см -1, соответствующих молекулам А и В. Несомненно,пик с максимумом поглощения 2915 см -1 вблизи высокочастотного крыласпектра является следствием наложения сигналов валентных колебаний С-Н. Что касаетсянизкочастотных сигналов, сильное поглощение при 1754 см -1 было отнесеноза счет валентных колебаний группы С=О пятичленного лактонного кольца, а интенсивныйдублет при 1675 и 1660 см -1 — за счет валентных колебаний группы С=С(на которые накладываются колебания вдоль всей сопряженной системы). Сигнал при1460 см -1 приписан ножничным колебаниям группы СН2 .
Несмотря на сложностьобласти характеристических колебаний, были сделаны попытки провести их корреляции,например:
полоса при 1320см -1 приписана деформации С-2-ОН, полоса при 1275 см -1 —колебаниям С-2—О, полоса при 1140 см -1 — колебаниям С-5—О и полосы при1025/990 см -1 — деформации лактонного кольца.
1.3.4 Спектроскопияядерного магнитного резонанса
В спектре 13СЯМР L-аскорбиновой кислоты при полном подавлении спин-спинового взаимодействия спротонами, как и ожидалось, появились сигналов, которые были соотнесены сконкретными атомами молекулы (рис. 3.11).
/>
Неполное подавлениеспин-спинового взаимодействия с протонами приводит к ожидаемому расщеплению сигналов,т. е. С-1, С-2 и С-3 (синглеты), С-4 и С-5 (дуплеты) и С-6 (триплет). Сигналы С-4и С-5 удалось дифференцировать после того, как был получен спектр при полном подавленииспин-спинового взаимодействия с протонами производного, дейтерированного по положению4, где сигнал при 77δ м. д. стал триплетом вследствие спин-спинового взаимодействияс дейтерием. Сигнал С-3 был идентифицирован благодаря его большому (19δ м.д.) слабопольному сдвигу при изменении рН от 2 до 7, что приводит к депротонированиюС-3—ОН. Особенно интересен спектр 1Н ЯМР L-аскорбиновой кислоты, таккак его тщательный анализ позволяет определить конформацию молекулы в водном растворе.При снятии спектра в D2O четыре протона ОН-групп замещаются на дейтерий и не проявляютсяв виде сигналов. Остальные четыре протона (Н-6, Н-6', Н-5 и Н-4) образуют системуАВМХ, причем протоны при С-6 неэквивалентны из-за хиральности атома С-5.
Тонкая структураэтих сигналов не проявляется в низких магмагнитных полях (60 или 100 МГц), но выше300 МГц обнаруживается спин-спиновое взаимодействие, не являющееся взаимодействиемпервого порядка. Это расщепление особенно заметно в спектре 1Н ЯМР аскорбатанатрия (рис. 3.12).
Значения константспин-спинового взаимодействия J, полученные из таких спектров, позволяют определитьпреимущественную конформацию L-аскорбиновой кислоты в водном растворе. Например,найдено, что Jh4,H5 составляет 1,8 Гц. Это соответствует предсказанномузначению для конформации, изображенной на рис. 3.13. Таким образом, преимущественнаяконформация вокруг связи С-4—С-5 в водном растворе такая же, как и в кристалле (рис.3.8).
В равной степениинформативна корреляция констант спин-спинового взаимодействия с конформацией вокругсвязи С-5—С-6.
/>
/>
/>
Возможные стабильныеконформеры представлены на рис. 3.14. Предположив, что наблюдаемые константы спин-спиновоговзаимодействия являются весовым усреднением теоретических величин для трех конформеров,можно вычислить их населенность (табл. 3.4). И снова предпочтительная конформациявокруг связи С-5—С-6 в растворе идентична обнаруженной в кристалле. Сходство преимущественныхконформации боковых цепей в кристаллической решетке и в растворе объясняется, возможно,отсутствием в обоих случаях внутримолекулярных водородных связей. Но, конечно, прочныемежмолекулярные водородные связи образуются между соседними молекулами аскорбиновойкислоты в кристалле и с молекулами воды в водном окружении.
1.3.5Масс-спектрометрия
В масс-спектреL-аскорбиновой кислоты, зафиксированном при ионизации молекулы под действием электронногоудара, имеется интенсивный пик с m/е 116 наряду с пиком молекулярного иона (m/е 176) (рис. 3.15).Было высказано предположение, что фрагментация происходит за счет отщепления боковойцепи с последующим разрушением кольца, что соответствует наличию наиболее интенсивныхсигналов (рис. 3.16).
/>
/>
/>
2Химические свойства l-аскорбиновой кислоты
Некоторые превращенияL-аскорбиновой кислоты уже упоминались в разделе, посвященном установлению структурымолекулы.
Эти и другие реакциибудут подробно рассмотрены в последующих разделах.
2.1 Алкилированиеи ацилирование
Как и у многихуглеводов, первичный гидроксил при С-6 L-аскорбиновой кислоты легко подвергаетсятрифенилметилированию (тритилированию) под действием трифенилхлорметана в пиридине(рис. 4.8).
/>
МетилированиеL-аскорбиновой кислоты диазометаном проливает свет на таутомерную природу витамина.Повышенная кислотность гидроксила при С-3 позволяет оттитровать его диазометаномв эфире; при этом образуется
3-О-метиласкорбиноваякислота. Реакция сопровождается образованием небольших количеств 1-метил-ψ-L-аскорбиновой кислоты вследствиеприсутствия минорных количеств таутомера. Оба соединения подвергаются дальнейшемуетилированию диазометаном, давая 2,3-ди-О-метил-L-аскорбиновую и 1,2-ди-O-метил-ψ-L-аскорбиновую кислоту соответственно(рис. 4.9)
/>
Под действиемщелочи с последующим подкислением 2,3-ди-О-метильное производное претерпевает интереснуюцепь превращений. Образуется не простой моноциклический лактон, а бициклическоепроизводное с единственным свободным гидроксилом — 2,3-изодиметил-L-аскорбиновая кислота. Кислотныйгидролиз этого продукта приводит к 3-О-метил-L-аскорбиновой кислоте, котораятакже получается при стоянии на холоду водного раствора 1,2-ди- O-метил-ψ-L- аскорбиновой кислоты, чтосопровождается потерей лабильного метильного остатка при С-1. Как и следовало ожидать,3-O-метил-L-аскорбиновая кислота легкометилируется под действием диазометана в эфире, образуя 2,3-ди-О-метилированноепроизводное. Описанные превращения суммированы на рис. .10.
/>
2,3-Ди-О-метил-L-аскорбиновая кислота можетбыть подвергнута дальнейшему метилированию иодметаном в присутствии оксида серебрас образованием 2,3,5,6-тетра-О-метилированного продукта, а также тритилированиюпервичной спиртовой группы при С-6. Метилирование с последующим снятием тритильнойзащитной группировки в кислой среде приводит к 2,3,5-три-О-метильному производному(рис. 4.11), которое, как было показано, участвует в цепи превращений, идентичныхприведенным на рис. 4.10, и превращается в бициклическое 2,3,5-изотриметильное производное.
/>
Катализируемаякислотами этерификация аскорбиновой кислоты, например ацетилирование, первоначальноприводит к образованию О-6-ацильного производного, а в более жестких условиях —к 5,6-диэфиру. Кристаллический 5,6-диацетат хорошо известен; получение 2,3,4,6-тетраацетататребует еще более жестких условий.
В щелочных условияхэлектрофильная атака алкилирующих и ацилирующих агентов зависит от кислотности истерической доступности гидроксильных групп при С-2, С-3, С-5 и С-6. Наиболее кислымявляется атом водорода гидроксила при С-3 (рКа = 4,25), но делокализация отрицательногозаряда в соответствующем анионе снижает его реакционную способность и приводит квозникновению двойственной природы, которая выражается в том, что алкилироватьсяможет не только положение О-3, но и положение С-2. В результате селективная модификацияположения О-3 затруднена, и добиться ее можно только с помощью таких сильных алкилирующихи ацилирующих агентов, как диазометан и хлорангидриды.
Потеря второгопротона гидроксилом при С-2 (рКа = 11,79) приводит к образованию дианиона, которыйселективно алкилируется и ацилируется по тому положению (рис. 4.12).
/>
Подобный подходможно использовать при синтезе 2-О-неорганических эфиров, например 2-О-сульфата.Если защищены оба гидроксила при С-2 и С-3, то в присутствии основания модифицируетсяболее доступная стерически первичная спиртовая группа при С-6 и последнюю очередь— при С-5 (рис. 4.13).
/>
2.2 Образованиеацеталей и кеталей
Катализируемоекислотами образование ацеталей и кеталей аскорбиновой кислоты применяется для специфическойзащиты одновременно двух гидроксильных групп в процессе структурной модификации.Такие 5,6-О-производные, как изопропилиденкеталь и бензилиденацеталь, хорошо известны,а недавно появилась возможность селективно защищать гидроксильные группы при
С-2 и С-3 с помощьюреакционноспособных альдегидов (рис. 4.14).
/>
Эти новые реакцииоткрыли путь к селективному модифицированию как первичных, так и вторичных спиртовыхгрупп молекулы аскорбиновой кислоты.
2.3 Окисление
L-Аскорбиноваякислота является сильным восстановителем в водном растворе, однако в безводной средеэто не так очевидно. Первая стадия окисления легко обратима и приводит к образованиюдегидроаскорбиновой кислоты, структура и свойства которой будут рассмотрены в следующемразделе. Дегидроаскорбиновая кислота также способна быть восстановителем особеннов щелочных условиях и при окислении гипоиодит-ионом или молекулярным
кислородом распадаетсяна L-треонин и щавелевую кислоту. Эта реакция фрагментации оказалась очень полезнойпри установлении структуры витамина С. Аналогичная фрагментация происходит такжепри обработке пероксидом водорода в щелочной среде или перманганатом калия в кислойили щелочной среде, причем кроме вышеназванных продуктов детектируется еще и ряддругих.
Скорость аэробногоокисления аскорбиновой кислоты зависит от рН раствора, достигал максимума при рН5 и 11,5. Однако наиболее быстро и полно фрагментация протекает в щелочной среде.Окислительное расщепление происходит и в анаэробных условиях, хотя и медленнее.
Ультрафиолетовое,рентгеновское и гамма-излучение инициируют фотохимическое окисление аскорбиновойкислоты в водных растворах по свободнорадикальному механизму как в аэробных, таки в анаэробных условиях.
Окисление первичнойи вторичной спиртовых групп аскорбиновой кислоты при С-5 и С-6 может теоретическиприводить к образованию ряда побочных продуктов. Получение таких производных непосредственноиз L-аскорбиновой кислоты требует селективной защиты гидроксилов при С-2 и С-3.На рис. 4.15 приведены примеры соединений такого типа, которые удалось выделить.
/>
2.4Дезоксисоединения
Производные L-аскорбиновойкислоты, у которых один или более гидроксилов при С-2, С-3, С-5 или С-6 замещенына атом водорода, известны как дезоксисоединения. Нестабильность витамина С подогреваетинтерес к его более стабильным аналогам при условии сохранения ими антискорбутногодействия.
Известно, что6-дезокси-L-аскорбиноваяи L-рамноаскорбиновая кислоты (рис. 4.16) сохраняют соответственно 30 и 20% антискорбутнойактивности витамина С. В последние годы были синтезированы еще некоторые соединениятакого типа (рис. 4.17). Обнадеживает, что 6-хлор-6-дезоксипроизводное обладаетповышенной термической стабильностью по сравнению с витамином С и в то же времяобладает заметной антицинготной активностью.
/>
3.Биохимия витамина с
Эффективностьвитамина в заживлении ран и способность ускорять рост связаны с его участием в синтезеволокнистых соединительных тканей, особенно в ускорении посттрансляционного гидроксилированияостатков пролина и лизина коллагена — наиболее распространенного белка животногомира. Этот процесс, все еще далекий от того, чтобы быть полностью понятным, в ходекоторого, как это ни парадоксально, восстановительные свойства аскорбиновой кислотынеобходимы для окисления пролина и лизина, будет главной темой настоящего раздела.Хотя, конечно, этим роль аскорбиновой кислоты отнюдь не ограничивается. Начинаяс первых лет становления биохимии витамина С, ознаменовавшихся спорами вокруг егооткрытия, а также вокруг роли в метаболизме аминокислот, сфера влияния этого соединениявсе более расширялась, охватывая различные аспекты иммунологии, онкологии, процессовпищеварения и всасывания, эндокринологии, нейрологии, детоксикации и профилактикикатаракты.
Среди высших организмовлишь очень немногие не способны к биосинтезу витамина С. К ним относится и Homosapiens, поэтому неудивительно, что большая часть из того, что известно о биохимииL-аскорбиновой кислоты, имеет отношение к млекопитающим.
/>
3.1 Биосинтез
Большинство живыхорганизмов могут превращать D-глюкозу в L-аскорбиновую кислоту. Важно ясно понимать,что это превращение происходит не через эпимеризацию, а через формальный поворотв плоскости на 180° соединения D-ряда, в результате чего образуется соединение,относящееся к L-ряду. Следует помнить, что представленное на рис. 5.2 изображениеациклической формы D-глюкозы, относится к D-ряду, так как гидроксильная группа упредпоследнего атома углерода (в данном случае С-5) расположена справа от него.
/>
Защитив предварительнореакционноспособную альдегидную группу по С-1, можно окислить D-глюкозу поположениюС-6,получив D-глюкуроновую кислоту (рис. 5.3).
Если теперь С-1альдегидную группу восстановить до первичного гидроксила, мы получим соединение,структура которого приведена на рис. 5.4.
/>
Наиболее важнаяфункциональная группировка (в данном случае карбоксильная при С-6) обычно располагаетсяв верхней части изображения, а соответствующему атому углерода присваивается номерС-1. Следовательно, если повернуть лист бумаги на 180° или перевернуть изображениев плоскости, мы по-
получим соединениеL-ряда — производное альдогексозы L-гулозы, называемое L-гулоновой кислотой (рис.5.5). Последующие циклизация и окисление приводят к образованию L-аскорбиновой кислоты.
Считается, чтовсе хлорофиллсодержащие растения и прорастающие семена могут синтезировать аскорбиновуюкислоту согласно схеме, приведенной на рис. 5.8.
/>
Согласно некоторымисточникам, у растений более важна цепь превращений с участием D-галактуроновойкислоты, в результате которой после восстановления и замыкания лактонного кольцавместо L-гулонолактона образуется L-галактуронолактон, также превращающийся в L-аскорбиновуюкислоту. Предшественником D-галактуроновой кислоты является, очевидно, D-галактоза— углевод, обнаруженный у млекопитающих и не найденный по крайней мере в значительныхколичествах у растений. Поэтому трудно предполагать, что этот процесс может бытьважным. Тем не менее независимо от того, является ли исходным соединением D-глюкозаили D-галактоза, биосинтез L-аскорбиновой кислоты происходит через инверсию. Однакоэтому противоречат экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что у некоторыхрастений, например у созревающей клубники, превращение D-глюкозы в L-аскорбиновуюкислоту осуществляется не через инверсию. Если использовать D-глюкозу, меченнуютритием (3Н) по положению С-6, в образующейся L-аскорбиновой кислотемеченым оказывается также положение С-6. Результаты генноинженерной работы, в которойбыла получена экспрессия гена фермента редуктазы Corynebacterium в бактериях Erwiniaherbicola, демонстрируют наличие в цепи превращений еще двух промежуточных соединений— D-глюконовой и 2,5-дикетоглюконовой кислот. В этом случае нет необходимости винверсии, чтобы объяснить, каким образом D-глюкоза трансформируется в L-аскорбиновуюкислоту. Очевидно, следует предположить, что одни растения продуцируют L-гулоновуюкислоту через D-глюкуроновую или D-гaлактуроновую кислоты, тогда как у других процесспротекает через образование d-глюконовой и 2,5-дикетоглюконовой кислот и не требуетинверсии.
Большая частьисследований по синтезу аскорбиновой кислоты
у животных былавыполнена на лабораторных крысах, и результаты подтвердили идею о полной С-1/С-6инверсии между D-глюкуронатом и L-гулонатом. Большинство представителей земной фауныспособны биосинтезировать L-аскорбиновую кислоту из d-глюкозы через промежуточныесоединения — D-глюкуроновую кислоту, L-гулоновую кислоту, L-гулонолактон и 2-кето-L-гулонолактон. Исключениесоставляют приматы (включая и Homo sapiens) и некоторые другие млекопитающие, атакже рыбы, насекомые и некоторые виды птиц. Остается лишь гадать, почему эти представителиживотного мира утратили способность к биосинтезу аскорбиновой кислоты. По-видимому,их далекие предки лишились генетического материала, необходимого для синтеза ферментаL-гулонолактоноксидазы, что и заблокировало завершающую стадию в цепи превращений.Полагают, что эта досадная ошибка произошла 25 миллионов лет назад и именно онапривела к тому, что человек делит несомненные трудности
своего положенияс другими приматами, морскими свинками, индийскими крыланами, некоторыми видамиптиц, включая дрозда с экзотическим голосом; рыбами и некоторыми видами насекомых,включая обитающую в пустыне саранчу, тутового шелкопряда и жуков Anthonomus. Возможно,что у всех травоядных насекомых (поедающих зеленые растения) существует потребностьв поступлении витамина С с пищей. Выведение его из рациона, например, саранчи приводитк абортивной линьке и смерти. У тех представителей животного мира, которые способнысамообеспечивать себя аскорбиновой кислотой, ее биосинтез осуществляется в печени(млекопитающие) или почках (птицы, рептилии, амфибии).
3.2 ВитаминС в продуктах питания
Homo sapiens целиком зависит от поступлениявитамина С с пищей. Единственным животным продуктом, содержащим значительные количествавитамина С, является молоко (1-5 мг/100г); содержится он также и в печени. Самыебогатые источники аскорбиновой кислоты — это свежие овощи и фрукты (особенно цитрусовые,томаты и зеленый перец), печеный картофель (17 мг/100 г)
и листовые овощи.Очень богаты витамином С гуава (300 мг/100 г) и черная смородина (200 мг/100 г),но они не слишком распространены в западных странах. В табл. 5.1 приведены исчерпывающиеданные о содержании витамина С в наиболее употребляемых овощах и фруктах.
Известно, чтокулинарная обработка овощей и фруктов часто влечет за собой потери аскорбиновойкислоты. Так, при измельчении продуктов значительно возрастает ферментативная активностьаскорбатоксидазы, содержащейся в растениях, богатых витамином С. Этот фермент присутствуетво всех растительных тканях и обычно либо неактивен, либо содержится внутри визикул.Другой фермент, обусловливающий потерю аскорбиновой кислоты, фенолаза, катализируетокисление полифенольных соединений кислородом воздуха, за счет чего происходит потемнениетаких фруктов, как яблоки. При наличии аскорбиновой кислоты фермент восстанавливаето-хиноны снова до о-дифенолов. Процесс сопровождается образованием дегидроаскорбиновойкислоты, которая быстро превращается в 2,3-дикетогулоновую кислоту, и
/>
катализируетсяионами Cu(II) и других переходных металлов. Именно поэтому не рекомендуется готовитьовощи и фрукты в медной и железной посуде. И, конечно, основным фактором, влияющимна потерю витамина С в процессе приготовления пищи, является просто его растворениев воде. Исследования скорости разрушения витамина С при кулинарной обработке, выполненына модельных системах, привели к предположению, что это процесс первого порядка.Влияние температуры на скорость распада витамина С адекватно описывается уравнениемАррениуса, где κ — константа скорости первого порядка, А — предэкспоненциальныймножитель, Еа — энергия активации, R — газовая постоянная и Т — абсолютная температура:
/>
Как показали результатыэкспериментов, график зависимости lnkот 1/Т представляетсобой прямую линию, что позволяет вычислить энергию активации. Стандартные величинылежат в пределах 80-120 кДж · моль -1. Однако растения — очень сложныесистемы, на скорость распада витамина С в которых влияют и другие факторы, напримермикроорганизмы и (или) природные ферменты. Поэтому энергия активации служит толькодля приблизительной оценки влияния температуры на этот процесс. Более того, дополнительнымпараметром является отсутствие воздушной среды. Ситуация еще больше усложняется,если реакция не
подчиняется первомупорядку. Так, например, имеются данные, что при хранении соков распад аскорбиновойкислоты является процессом нулевого порядка. Трудно понять, почему наблюдается такоеразличие в кинетике, однако несомненно, что решающее влияние на разрушение витаминаС оказывает природа системы. Следует отметить, что овощи, приготовленные в микроволновойпечи, сохраняют гораздо больше витамина С, чем приготовленные обычными способами.Это может происходить главным образом
благодаря использованиюменьших объемов воды, хотя должно сказываться и сокращение времени кулинарной обработки.Таким образом, потери витамина С можно предотвратить, не только избегая длительногокипячения овощей в медной посуде, но и если готовить их целиком.
4 Аналитическиеаспекты химии витамина с
4.1 Аналитическаяхимия
Анализ L-аскорбиновой кислоты и ееразличных форм представляет собой определенную трудность, и даже сегодня нет универсальногорутинного метода, который был бы свободен от недостатков. Любой метод анализа должендавать возможность одновременно определять как саму L-аскорбиновую кислоту, таки продукты ее окисления и находить четкие различия между этими соединениями. Крометого, аналитический метод должен позволять работать с минимальными количествамипрепаратов. Это, так сказать, требования высшего порядка. Но ситуация осложняетсятем, что в животных и растительных тканях витамин С присутствует в окружении множествадругих органических молекул.
Аскорбиновую кислотуследует либо отделять от них, либо использовать для анализа некое уникальное свойствоэтой кислоты. Очевидно, что таким уникальным свойством является ее способность участвоватьв окислительно-восстановительных реакциях, что и составляет основу многих аналитическихметодик. Другие методы базируются на определении суммарного количества витаминаС как в окисленной, так и в восстановленной формах. Иногда такое определение болеепредпочтительно, поскольку многие полезные свойства этого соединения, используемыев медицине, присущи как самой аскорбиновой кислоте, так и продуктам ее окисления.
4.2 Биологическиеметоды анализа
Сегодня биологическиеметоды представляют главным образом исторический интерес. Но на самом деле их преимуществозаключается в том, что они основаны на определении конкретного профилактическогои лечебного свойства, а именно антискорбутной активности, присущей и дегидроаскорбиновойкислоте. Биологические методы требуют больших затрат времени и средств и дают широкийразброс результатов, которые не всегда надежны. Для проведения биоанализа используютморских свинок, так как крысы синтезируют собственный витамин С. Животных выдерживаютна искусственном рационе с добавлением различных количеств витамина, затем забивают,а их зубы подвергают гистологическому анализу. В результате устанавливают степеньзащиты от цинги в зависимости от количеств аскорбиновой кислоты, поступающей с пищей.Антискорбутная активность 0,05 мг аскорбиновой кислоты принята в качестве международнойединицы для измерения содержания витамина С.
4.3 Титриметрическиеи колориметрические методы анализа
Титриметрическиеметоды основаны на использовании восстановительных свойств L-аскорбиновой кислоты.Обычно она окисляется до дегидроаскорбиновой кислоты. В методике, предложенной ещев 1927 г., используется 2,6-дихлорфенолиндофенол или 2,6-ди-хлор-4[(4-гидроксифенил)имино]циклогексадиен-3,5-он-1,который при нейтральных рН дает синюю окраску, при кислых — розовую, а при взаимодействиис L-аскорбиновой кислотой образует бесцветный продукт. Структура этого соединенияприведена на рис. 7.1.
/>
Эта реакция лежитв основе наиболее популярного титриметрического метода анализа витамина С. Она простав исполнении благодаря легкости определения конечной точки титрования и без трудаможет быть использована для анализа растворов, содержащих довольно высокие концентрациивитамина С. К сожалению, данный метод очень чувствителен к присутствию других восстановителей,с которыми витамин С часто соседствует в растворах (диоксид серы, таннины, ионыметаллов, восстанавливающие сахара и т. п.). В каждом конкретном случае есть способыуменьшить влияние примеси, но устранить эффект всех примесных восстановителей ванализируемом растворе одновременно невозможно. И если раствор первоначально окрашен,это маскирует изменение цвета вследствие реакции; в таких случаях для определенияконечной точки использовали разнообразные инструментальные методы, например, полярографию.Было предложено много других титрующих реагентов, например, соединения железа(Ш).В этом случае конечную точку определяют при добавлении в качестве индикаторов феррозина,а, а'- дипиридина или 2,4,6-трипиридил-симм-триазина (рис. 7.2).
/>
Полагают, чтоединственным продуктом многих изученных окислительно-восстановительных реакций L-аскорбиновойкислоты является дегидроаскорбиновая кислота. Но часто это не так, и окисление идетдальше. Поэтому разработка точного и чувствительного метода определения концентрациив растворе L-аскорбиновой кислоты, дегидроаскорбиновой кислоты и отдельных или всехпродуктов дальнейшего окисления все еще остается актуальной.
Практическое применениеметода
Количественноеопределение аскорбиновой кислоты в мандарине
Выполнение работы:
На аналитическихвесах берут навеску 5-10г и растирают в ступке с 15см3 HCl. Полученный экстракт затемотфильтровывают в колбу объемом 50 см3, затем ступку и пестик моют дистилированойводой и также фильтруют в эту колбу. В 2 конические колбы на 50 см3 отбираюталиквоту фильтрата по 5см3,
Добавляют по 10см3 дистилированой воды и титруют раствором 2,6- ДХФИФ до слаборозовойокраски. Титрование проводят не меньше 4 раз и определяют средний V 2,6-ДХФИФ.
m= 7,38г
V(ДХФИФ)=1,2 см3
С(ДХФИФ)= 0,001М
V(2,6-ДХФИФ) С(2,6-ДХФИФ) М(С6Н8О6)fэкв (С6Н8О6)Vк 100
m Va
4.4 Спектрофотометрическийанализ
Водные растворыL-аскорбиновой кислоты бесцветныи не поглощают в видимой области спектра, но при нейтральных значениях рН в спектреоглощения наблюдается сильный сигнал при 265 нм. Это обстоятельство было бы оченьудобно использовать для непосредственного спектрофотометрического анализа, но вбольшинстве случаев растворы витамина С содержат вещества, также поглощающие в УФ-области,что в некоторой степени ограничивает использование этого метода. В течение рядалет были сомнения относительно точного значения молярного коэффициента экстинкциипри 265 нм; в разных работах давались значения от 7500 до 16650. Причина таких различийобъясняется быстрым окислением L-аскорбиновой кислоты в нейтральных и слабокислых растворах атмосфернымкислородом. До тех пор, пока спектры поглощения снимаются в строго анаэробных условиях,неизбежны низкие величины, так как поглощение продуктов окисления, при 265 нм незначительно.
Сложности появляютсяпри наличии в растворе ионов Си + и других переходных металлов, являющихся потенциальнымикатализаторами окисления молекулярным кислородом. Их следует удалять или связыватьв комплекс путем добавления хелатирующего агента этилендиаминтетрауксусной кислоты.Положение максимума поглощения зависит от рН и в кислых растворах смещается в область245 нм. На основании величины поглощения при этой длине волны в растворе солянойкислоты и хлорида калия определяли содержание витамина С в безалкогольных напиткахи некоторых лекарственных препаратах, где незначительны примеси других веществ.Часто бывает желательно определить в одном и том же растворе содержание дегидроаскорбиновойи L-аскорбиновой кислот. Дегидроаскорбиновая кислота поглощает в УФ-области при220 нм, но величина молярного коэффициента экстинкции значительно ниже и составляет720. Таким образом, в этом случае чувствительность спектрофотометрического анализапочти в 20 раз меньше, чем в случае L-аскорбиновой кислоты. Позже мы увидим, чтоэтот факт имеет далеко идущие последствия при хроматографическом разделении L-аскорбиновойи дегидроаскорбиновой кислот.
Для того чтобыпреодолеть проблемы, связанные с присутствием в животных и растительных тканях веществ,поглощающих в УФ-области, проводился поиск реагентов, дающих специфические цветныереакции с L-аскорбиновой кислотой и(или) продуктами ее окисления. Титриметрическийметод с использованием дихлорфенолиндофенола, описанный выше, был адаптирован дляколориметрии. Для спектрофотометрического определения можно использовать и окрашенное2,4-динитрофенилгидразиновое производное витамина. Обнаружено, что это же самоесоединение образуется с дегидроаскорбиновой и 2,3-дикетогулоновой кислотами, являющимисяпродуктами окисления L-аскорбиновой кислоты (рис. 7.3). Эта реакция имеет широкоепрактическое применение для определения содержания дегидроаскорбиновой кислоты иизвестна под названием метода Роу. Он заключается во взаимодействии раствора дегидроаскорбиновойкислоты с 2,4-динитрофенилгидразином в специфических условиях при 37°С в течение4 ч, в результате чего образуется озазон — производное 2,3-дикетогулоновой кислоты.Эту же реакцию можно использовать и для определения содержания L-аскорбиновой кислоты,предварительно окислив ее до дегидроаскорбиновой кислоты над активированным углем(норит) раствором брома и т. п. При добавлении к озазону сильной кислоты образуетсяраствор красного цвета, поглощающий при 530 нм.
/>
Основу для колориметрическогои спектрофотометрического методов анализа создает также ярко-синий цвет продуктареакции L-аскорбиновой кислоты с соединениями диазония (рис. 7.4).
Альтернативныйподход заключается в использовании флуоресценции продукта конденсации дегидроаскорбиновойкислоты с о-фенилендиамином. Облучение образующегося хиноксалина на длине волны350 нм приводит к его флуоресценции при 427 нм. Обычно методика включает окислениеL-аскорбиновой кислоты до дегидроаскорбиновой, и затем суммарное количество определяетсяспектрофлуорометрически.
4.5 Электрохимическиеметоды
Электрохимическиеметоды предоставляют возможность высокоселективного анализа с высокой точностьюи воспроизводимостью; к тому же они очень просты в исполнении. Было предложено множествометодик. Например, в таблетках поливитаминов, содержащих соединения Fe'-11-', витаминС был проанализирован методом дифференциальной пульсирующей вольтамперометрии настеклянном углеродном электроде. Однако эти методики не нашли широкого применения,так как необходима большая работа по их
совершенствованию.
4.6 Хроматографическиеметоды
Хроматографическиеметоды дают самую большую надежду на преодоление основной проблемы, связанной сприсутствием в смесях, содержащих витамин С, множества мешающих анализу веществ.Как мы уже видели, пока не существует методов, позволяющих четко и непосредственноопределять небольшие количества L-аскорбиновой кислоты и(или) продуктов ее окисленияв присутствии любых других соединений. Единственный удовлетворительный способ достиженияспецифичности заключается в хромато-
графическом отделениианализируемых соединений друг от друга, а также от остальных веществ.
Вплоть до относительнонедавнего времени наиболее часто из хроматографических методов использовали обычногазожидкостную хроматографию (ГЖХ). Определить L-аскорбиновую кислоту непосредственноэтим методом невозможно из-за ее нелетучести. Для того чтобы иметь такую возможность,была разработана длительная процедура превращения L-аскорбиновой кислоты в летучийтриметилсилиловый эфир. Такой метод позволяет получать точные и воспроизводимыерезультаты, но из-за длительности предварительной подготовки образца он не так удобен,как разработанный недавно метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).В настоящее время ВЭЖХ стала альтернативным способом быстрого определения самыхразнообразных органических и неорганических соединений. Она часто находит применениев фармацевтической промышленности для анализа болеутоляющих и других препаратов.ВЭЖХ давно используется и для анализа витаминов.
Однако это нерешает всех проблем в случае определения витамина С. Остается еще много сложностей,и метод не всегда удается использовать с одинаковой легкостью как для анализа всегоразнообразия образцов, так и для определения малых концентраций.
Однако, когдаприменение метода ВЭЖХ возможно, он обычно дает надежные, точные и воспроизводимыерезультаты. Вопрос количественного определения разделенных веществ в ВЭЖХ требуетналичия специфического физического свойства у витамина С (как у L-аскорбиновой кислоты,так и у продуктов ее окисления). Ко времени написания этой книги наиболее широкое
распространениеполучили детекторы, измерявшие поглощение в УФ- или видимой области спектра. Онипозволяют определять нанограммовые количества L-аскорбиновой кислоты, но при определениидегидроаскорбиновой кислоты их чувствительность гораздо ниже из-за значительно болеенизкого молярного коэффициента экстинкции (см. выше). Остается проверить, нельзяли повысить
эффективностьанализа, используя детекторы другого типа, чувствительные к массе. Для ВЭЖХ обычноиспользуют колонку с мелкопористым полимерным обратнофазовым сорбентом с развитойповерхностью, таким, как, например, PLRS-s 100A, при низких значениях рН воднойподвижной фазы. Для этого подходит 0,2 М раствор NaH2PO4, который создает рН около2,1, а также подавляет действие ионов металлов и дает хорошо забуференную подвижнуюфазу. Такой метод был использован для определения содержания L-аскорбиновой кислоты и продуктовее окисления во фруктовых соках. В данной среде УФ-спектрофотометрический детектор,регистрирующий поглощение при 220 нм (при этой длине волны оба соединения имеютблизкие молярные коэффициенты экстинкции), имеет удовлетворительную чувствительность.Типичная хроматограмма приведена на рис. 7.6.
/>
Из нее явствует,что этим методом разделяются не только L-аскорбиновая и дегидроаскорбиновая кислоты,но и продукты их дальнейшего окисления, соответствующие оторым пики также присутствуютна хроматограмме. Это одна из многих методик с использованием ВЭЖХ, пригодных дляпроведения подобного анализа.
4.7 Неорганическаяхимия
Этот раздел будетпосвящен главным образом реакциям L-аскорбиновой кислоты с ионами металлов и ихкомплексами. Однако было бы неуместно обсуждать эту тему без рассмотрения свойствсоединения, которое в буквальном смысле „покушается" на всю неорганическуюхимию. Следовательно, сюда важно включить рассмотрение довольно сложного химизмаокислительно-восстановительныхреакций витамина С, а также информацию о количественном и качественном определениии свойствах соединений, которые часто фигурируют как промежуточные продукты такихреакций, а именно аскорбат-радикалов.
5. Статистическаяобработка результатов анализа
Метод исключения грубых промахов по Q-критерию
Метод заключаетсяв расчете величины Q:Q = (x1 — x2) / R, где x1 – возможный промах измеренийx2 – результат измерения, ближайший по значению к х1R– размах варьирования, т.е. разность междунаибольшим и наименьшим значениями. Если Q Qтаб – результат отбрасывается
Для определения погрешности титрования следует провести ста тистическую обработкувыбранных данных. Стандартное отклонение:
/>
Погрешность титрования: />
Литература
1. М. Девис, Дж. Остин, Д. Патридж «Витамин С. Химия и биохимия», Москва«Мир» 1999