--PAGE_BREAK--1.4 Биологическая индикация
Общие закономерности поведения загрязнителей пестицидов в почве достаточно хорошо изучены. Вместе с тем, последствия комплексного воздействия поллютантов на биоценозы и фитопопуляцию в реально встречающихся концентрациях исследованы недостаточно. Остатки агрохимикатов в почве и растениях вступают в сложные взаимодействия различного характера, включая антагонизм, синергизм, аддитивность.
Для получения объективной картины загрязнения агроценоза необходимы исследования в двух направлениях. Во-первых, должны совершенствоваться методы инструментального химического анализа, во-вторых, целесообразно более широкое использование биоиндикаторов.
Применение организмов, реагирующих на загрязнение среды обитания изменением визуальных признаков, имеет ряд преимуществ. Оно позволяет существенно сократить или даже исключить применение дорогостоящих и трудоемких физико-химических методов анализа. Биоиндикаторы интегрируют биологически значимые эффекты загрязнения. Они позволяют определять скорость происходящих изменений, пути и места скопления в экосистемах различных токсикантов, делать выводы о степени опасности для человека и полезной биоты конкретных веществ или их сочетаний [41–45].
В зависимости от скорости проявления биоиндикаторных реакций выделяют несколько различных типов чувствительности тест-организмов:
I тип – биоиндикатор проявляет внезапную и сильную реакцию, продолжающуюся некоторое время, после чего перестает реагировать на загрязнитель;
II тип – биоиндикатор в течение длительного времени линейно реагирует на воздействие возрастающей концентрации загрязнителя;
III тип – после немедленной, сильной реакции у биоиндикатора наблюдается ее затухание, сначала резкое, затем постепенное;
IV тип – под влиянием загрязнителя реакция биоиндикатора постепенно становится все более интенсивной, однако достигнув максимума постепенно затухает;
V тип – реакция и типы неоднократно повторяются, возникает осцилляция биоиндикаторных параметров [46].
Для экотоксикологического картирования агроландшафта можно использовать биоиндикаторы, аккумулирующие загрязнители по безбарьерному типу, т.е. прямопропорционально их концентрации во внешней среде. Например, покровные ткани растений (кора) и животных (шерсть) представляются малоактивными индикаторами для этого метода. Листья, цветки и другие органы растений накапливают поллютанты по фонобарьерному типу. Подобные органы и ткани приемлемы для биотестирования загрязнения почв, вод и атмосферы.
При биоиндикации агроценоза необходимо учитывать и тератогенный эффект загрязнителей, т.е. способность вызывать у тест-организмов различные пороки развития. Последствия действия тератогенных загрязнителей различны: в одних случаях тератогенез может охватывать лишь клеточные органеллы, отдельные клетки, в других – затрагивает ткани, органы и весь организм. Поэтому следует учитывать подобные изменения с помощью известных тест-систем, а также отрабатывать новые методы биоиндикации тератогенного действия загрязнителей [47].
Биоиндикация, как инструмент для проведения экологического контроля за состоянием агроэкосистемы, может входить в систему экологического нормирования, методической основой которого является биотестирование. Поэтому система биотестирования должна быть достаточно гибкой, т.к. норма реакции для каждого агроценоза будет индивидуальной.
Специальные биотесты для определения загрязнения фитопопуляции солями тяжелых металлов, остатками пестицидов, микотоксинами и другими агентами сводятся к оценке степени изменения морфометрических, физиологических и биохимических показателей биоты. Подобные нарушения проявляются в изменении энергии прорастания, всхожести семян, размеров корней, в повреждении растений под воздействием загрязнителей.
Классическим тест-объектом на загрязнители является одноклеточная зеленая водоросль хлорелла (Chlorella vulgaris). Ее преимущества для экспресс-анализа загрязнения агроценоза заключаются в коротком жизненном цикле и возможности проводить оценку по таким показателям, как пигментное секторирование, нарушение споруляции клеток и летальность.
Другой метод оценки химических веществ, основанный на эффекте замедленной флюоресценции. Этот эффект проявляется у растений при наличии сформированного фотосинтетического аппарата. Гербициды (ингибиторы фотосинтеза) способны изменять интенсивность флюоресценции. Этим способом можно выявить наличие гербицидов ингибиторов реакций Хилла, однако в случае других пестицидов метод малоэффективен.
Существуют достаточно надежные способы количественной регистрации воздействия загрязнителей, например, плазмолиз. Для определения количества погибших клеток пользуются методом витального окрашивания. Живые клетки сильно ограничивают проникновение в протоплазму органических веществ, и, будучи помещенными в раствор ряда красителей, практически не окрашиваются. В мертвые клетки краска проникает свободно, благодаря чему наличие погибших клеток легко поддается учету.
Метод индукции флюоресценции хлорофилла позволил исследовать активность фотосинтетического аппарата у ряда растений при изменении внешних условий среды. Эта особенность хлорофилла была предложена в качестве индикаторного признака нарушений, вызванных воздействием поллютантов [48].
Лишайники являются надежными индикаторами загрязнения воздуха и традиционно используются для целей биоиндикации. Лихенодиагностика позволяет осуществлять картирование территории по степени загрязненности атмосферного воздуха. Однако возможности лихеноиндикации ограничены чувствительностью нативных видов, поскольку многие лишайники, аккумулируя загрязнитель из атмосферы при его хроническом воздействии, гибнут от низких концентраций, зачастую не достигающих установленнных для человека и теплокровных животных нормативов.
Для биотестирования отработано немало методов на различных культурах: белой горчице (Sinapis alba L.), озимой и яровой пшенице (Triticum aestivum L.), овсе (Avena L.), гречихе (Fagopyrum L.), огурце (Cucumis L.), кресс-салате (Lepidium sativum L.), сое (Glycine L.), льне (Linum L.), еже сборной (Dactylis glomerata L.).
На горчице учитывают степень ингибирования первичного корешка проростка после обработки семян противодвудольным гербицидом. Определяют также увядание растений, торможение прироста листьев надземной массы проростков.
Овес и рис используют как индикаторы почвенных противозлаковых гербицидов, так как это наиболее чувствительные виды среди злаковых культур. При этом основным тестом является ингибирование роста зародышевого корня и листа.
Редис является традиционным биотестом при исследовании остатков пестицидов в почве и конечной продукции растениеводства, т. к. обладает по сравнению с другими объектами наиболее высокой чувствительностью к фитотоксичным препаратам, что обусловлено высокой энергией прорастания его семян и скороспелостью культуры.
На огурце и гречихе тестируют гербициды – производные мочевины и фенилкарбаматы. При этом у огурца учитывают рост первичного корня, у гречихи – утолщение стебля, деформацию зародышевых листьев, а также торможение роста. Кресс-салат используется как тест-объект для оценки загрязнения воздуха и почвы. Тест длится 10 дней. При наличии вредных веществ снижается процент всхожести и ингибируется рост зародышевых корешков.
Видимо, успешное решение проблем биоиндикации во многом будет определяться подбором, а иногда и направленным созданием сортов (линий) культурных растений, чувствительных к загрязнению. К сожалению, в настоящее время подобные сорта и линии отсутствуют. Поэтому усилия исследователей должны быть направлены на поиск перспективных форм и работу с ними [44].
2. Объект, программа и методика исследований
Объектом исследований являлись проростки озимого тритикале сорта «Михась».
Выбор данного сорта в качестве объекта исследований был связан с тем, что данный сорт является стандартом, районированным по всей республике. Из 350–400 тыс. га посевных площадей отводимых ежегодно под озимое тритикале до 56% занято посевами этого сорта.
Предметом наших исследований являлось изучение влияния глифосатсодержащего гербицида «Раундап» на развитие проростков озимого тритикале и на содержание в них хлорофилла.
Выбор препарата «Раундап» для изучения его влияния на развитие проростков озимого тритикале, был основан на том, что согласно отраслевому регламенту возделывания озимого тритикале (ОР МСХП РБ 0215–2005) данный гербицид может применяться на полях, предназначенных под посев тритикале после уборки предшественника по вегетирующим многолетним сорнякам. Учитывая, что период полураспада глифосата составляет от 3 до 141 дня, нами была выдвинуто предположение о возможности влияния остаточных количеств данного гербицида на развитие проростков исследуемой культуры. На основании этого и была составлена программа исследований.
В программу исследований входили следующие вопросы:
– Изучение влияния исследуемого гербицида на лабораторную всхожесть семян.
– Изучение влияния раундапа на развитие проростков.
– Изучение влияния раундапа на содержание в вегетативной массе проростков хлорофилла.
– Изучение влияния глифосатсодержащего гербицида «Раундап» на развитие проростков озимого тритикале в динамике.
Методика исследований
Для проведения исследований были отобраны относительно одинаковые по размеру неповрежденные семена озимого тритикале. Масса 1000 семян составляла 49,5 грамм. Семена (по 100 шт.) помещались в пластиковые контейнеры-растильни размером 150х150х110 мм. На дне контейнера находился слой стерильной ваты толщиной 0,5 см покрытый сверху фильтровальной бумагой. В каждый контейнер было внесено по 70 мл водной вытяжки из почвы. В почвенные вытяжки вносили гербицид «Раундап» в следующих концентрациях по действующему веществу: 5,0; 12,5; 25,0; 37,5; 50,0; 100,0; 150,0; 200,0; 250,0; 300,0; 350,0; 400,0; 450,0; 500,0; 550,0; 600,0; 650,0; 700,0; 750,0; 800,0; 850,0; 900,0; 950,0; 1000,0 мкг/л.
Через 7 дней определяли лабораторную всхожесть семян. После определения всхожести ростки отделяли от корешков и зерновки и проводили их взвешивание на аналитических весах ВЛР-200. Далее производили измерение длины ростков, а затем их высушивали до воздушно-сухого состояния и повторно взвешивали.
Весовой коэффициент определяли как отношение суммарной сырой массы проростков к их суммарной длине (мг/мм).
Экстракцию хлорофилла проводили 96%-м этанолом. Для экстрагирования отбирали по 100 мг сухих проростков, измельчали их с кварцевым песком в присутствии карбоната кальция. Полученную массу количественно переносили в бюксу с 20 мл этилового спирта. Через 24 часа проводили вакуумную фильтрацию вытяжки, а затем доводили ее объем до 50 мл. Оптическую плотность спиртовой вытяжки хлорофилла определяли на спектрофотометре «Solar PV 1251C» при l= 649 и 665 нм. Количество хлорофилла рассчитывали по формулам:
CХл а = 13,70´D665 – 5,76´D649
CХл в = 25,80´D649 – 7,60´D665 [49].
Статистическая обработка результатов исследований проводилась при помощи табличного редактора Excel и пакета статистического анализа STATISTICA 6.0 с использованием практического руководства Ю.М. Жученко [50].
В эксперименте по изучению влияния раундапа на проростки озимого тритикале в динамике, нами использовались следующие концентрации гербицида в почвенной вытяжке: 0,05; 0,25 и 0,50 мг/л.
3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1 Влияние микроконцентраций гербицида «Раундап» на всхожесть семян озимого тритикале
На первом этапе наших исследований (2006–2007 гг.) было установлено, что препарат гербицидной активности «Раундап» оказывает некоторое влияние на энергию прорастания и лабораторную всхожесть семян озимого тритикале, но нам не удалось установить закономерности в этом влиянии. Были проведены эксперименты, в которых увеличили число повторностей и использовали большее разнообразие концентраций пестицида.
Результаты наших исследований по влиянию гербицида «Раундап» на всхожесть семян озимого тритикале представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Влияние гербицида «Раундап» на всхожесть семян озимого тритикале
Как видно из представленных данных, между всхожестью семян озимого тритикале и концентрацией изучаемого препарата зависимости не установлено (коэффициент корреляции r = – 0,21 при уровне значимости р = 0,31). Во всех случаях всхожесть семян культуры ниже контрольной, но не снижается более чем на 10%.
Таким образом, нами было установлено, что препарат гербицидной активности «Раундап» в микроконцентрациях оказывает незначительное влияние на начальные этапы развития проростков озимого тритикале сорта «Михась», тогда как в литературных источниках указывается отсутствие влияния данного гербицида на всхожесть семян культурных растений.
3.2 Влияние гербицида «Раундап» на развитие проростков озимого тритикале
Влияние раундапа на развитие проростков оценивалась по следующим показателям: сырая масса проростков, воздушно-сухая масса проростков, содержание воды в проростках, средняя длина проростков и весовой коэффициент развития проростков. Результаты наших исследований по влиянию гербицида на накопление вегетативной массы представлены в табл. 2.
Таблица 2 – Влияние раундапа на накопление проростками озимого тритикале вегетативной массы
продолжение
--PAGE_BREAK--
Из данных приведенных в таблице видно, что между концентрацией используемого гербицида и накоплением проростками озимого тритикале вегетативной массы зависимости установить не удалось. Отмечается как резкое снижение, так и следующее за ним увеличение сырой и сухой массы проростков. При этом в варианте опыта, где концентрация пестицида составляла 12,5 мкг/л, снижение массы проростков было максимально – 84,8% от контроля. Схожие величины снижения массы как сырой, так и воздушно-сухой отмечаются и для вариантов опыта, где концентрации пестицида составляли 350 и 600 мкг/л. Сухая масса проростков изменялась в несколько большем диапазоне, но существенных отличий от тенденций отмеченных в случае сырой массы не наблюдалось. Этот факт отражает и определенный для этих показателей коэффициент корреляции, который составил r = 0,92 при р
Таким образом, при увеличении концентрации раундапа отмечается незакономерное колебательное изменение сырой и сухой массы проростков без влияния на обводненность побегов. Исходя из установленного механизма физиологического воздействия гербицида, природу подобного развития проростков мы объяснить не можем.
Результаты исследований по влиянию микроконцентраций гербицида «Раундап» на длину проростков представлены в таблице 3.
Таблица 3 – Влияние микроконцентраций препарата «Раундап» на длину проростков озимого тритикале
Как видно из представленных данных, достоверного влияния раундапа на проростки озимого тритикале не установлено. Как и в случае с накоплением проростками вегетативной массы, отмечается скачкообразное изменение средней длины проростков, как в сторону уменьшения, так и увеличения анализируемого показателя. Наименьшая средняя длина проростков зафиксирована при концентрации пестицида 600 мкг/л (84,3% к контролю), а наибольшая при 250 мкг/л (107,8% от контроля).
После предварительной статистической обработки результатов исследований нами был проведен однофакторный дисперсионный анализ для установления достоверности отличий выборок анализируемого показателя. Результаты этого анализа показали, что только при концентрациях 12,5; 250,0; 350,0; 600,0; 650,0 мкг/л анализируемые выборки длин проростков достоверно отличаются от контрольной. Именно к этим выборкам относятся минимальный и максимальный показатели средней длины. Только в указанных концентрациях гербицид достоверно стимулирует или ингибирует развитие проростков озимого тритикале.
Суммарная длина проростков во всех вариантах опыта оказалась ниже контроля, но, исходя из результатов дисперсионного анализа, мы можем оценивать этот показатель только в достоверно отличимых выборках.
Так как именно суммарная длина проростков является основным критерием при оценке токсичности, то можно констатировать наличие только ингибирующего влияния использованного гербицида на развитие проростков озимого тритикале. Это предположение основывается на том, что при концентрации пестицида 250 мкг/л суммарная длина проростков практически не отличается от таковой в контроле, хотя средняя длина проростков достоверно превышает контрольную почти на 8%.
Отмечаемые расхождения между двумя анализируемыми показателями (средняя и суммарная длина) дают возможность предположить, что для оценки влияния пестицидов на развитие проростков необходимо учитывать как среднюю, так и суммарную длину только после проведения дисперсионного анализа на достоверность отличий выборок.
Кроме приведенных выше характеристик развития проростков нами было введено понятие «весового коэффициента развития проростков», который, на наш взгляд, более полно отражает развитие вегетативной массы проростков (рисунок 4).
Как видно на рисунке, несмотря на существенный разброс в показателях весового коэффициента в зависимости от концентрации, прослеживается тенденция к увеличению анализируемого показателя. Этот факт является косвенным признаком стимулирующего влияния глифосатсодержащего гербицида «Раундап» на развитие проростков тритикале.
Рисунок 4 – Зависимость весового коэффициента от концентрации пестицида
3.3 Влияние гербицида «Раундап» на содержание в вегетативной массе проростков хлорофилла
Действие многих ксенобиотиков на высшие растения очень часто выражается в их влиянии на фотосинтетический аппарат. Это отражается на количественном и качественном содержании пигментов в растениях. В этой связи нами было проведено исследование влияния различных концентраций пестицида на содержание в проростках озимого тритикале хлорофиллов.
Результаты наших исследований по изучению влияния гербицида «Раундап» на содержание в проростках озимого тритикале хлорофиллов представлены в таблице 4.
Таблица 4 – Влияние гербицида на содержание в проростках хлорофилла
Результаты опытов по определению содержания хлорофилла показали, что также как и в предыдущих случаях зависимости между концентрацией пестицида в питательном растворе и содержанием хлорофилла в проростках нет.
Наблюдается скачкообразное незакономерное колебание содержания как хлорофилла а, так и хлорофилла b. Однако есть незначительный тренд снижения анализируемых показателей в зависимости от концентраций, но установить его достоверность пока не представляется возможности. Необходим более детальный анализ данных с учетом дополнительных серий экспериментов. Следует отметить, что максимальные концентрации хлорофилла фиксируются в вариантах опыта, где концентрация используемого гербицида составляла 12,5 и 25,0 мкг/л. В тоже время при концентрации 750 мкг/л отмечался максимум в соотношении концентраций хлорофиллов a и b (рисунок 5). Причину данного явления мы пока объяснить не можем.
Рисунок 5 – Отношение концентрации хлорофиллов a и b (контроль 100%) 1 – контроль, 2–25 – варианты опытов с различной концентрацией
Таким образом, на данном этапе исследований мы не можем использовать содержание хлорофилла в качестве показателя влияния гербицида «Раундап» на проростки озимого тритикале.
В ходе проведенных экспериментов было установлено, что озимое тритикале сорта «Михась» является относительно устойчивым к действию микроколичеств глифосатсодержащего гербицида «Раундап». Однако развитие проростков идет неравномерно, особенно в первые дни развития. Следовательно можно предположить, что используемый глифосатсодержащий ксенобиотик в динамике оказывает несколько более выраженное влияние по сравнению с результатами экспериментов с выращиванием проростков в течение 7 дней.
продолжение
--PAGE_BREAK--