А. И. БожковНа пути в третье тысячелетие:надежды и сомнения современной биологииТам, где природа кончает производить свои виды,там человек начинает из природных вещей создавать с помощью этой же самой природы бесчисленные виды новых вещейЛеонардо да Винчи,из записных книжекУходящее столетие чрезвычайно многолико и противоречиво. Однако именно в ХХ веке человечество научилось использовать энергию атома, направлено изменять наследственность и вышло в космос. Вероятно, эти три величайшие достижения человечества останутся в памяти людей даже тогда, когда они смогут летать к звездам и победят старость и смерть. В формировании облика уходящего столетия большую роль сыграли достижения биологических наук. Начало века ознаменовалось официальным рождением генетики (1900 г.) – науки, изучающей механизмы и закономерности наследования и изменчивости генетических признаков. Уже в 50-х годах было доказано, что той таинственной молекулой, в которой закодированы наследственные признаки, является молекула ДНК. Спустя 10 лет после этого открытия два замечательных ученых Ф. Крик и Дж. Уотсон смогли обобщить результаты многих исследований и предложить структурную модель ДНК. Модель двойной спирали ДНК была столь проста и изящна, что перед этой красотой и кажущейся простотой не смогли устоять многие исследователи и они, что называется, ринулись на разгадку тайн наследственности. Эти исследования молекулярных механизмов жизнедеятельности привели к рождению нового научного направления - молекулярной биологии. В этой области биологических исследований за 20 лет сделано такое большое количество фундаментальных открытий, что впору было говорить о наступлении века биологии. И эти высказывания оправдались появлением генной инженерии, а точнее, технологии рекомбинантных ДНК, которая изменила не только методологию биологических исследований, но и наше мировоззрение. В 70-х годах начинаются интенсивные исследования, направленные на разработку методов получения трансгенных животных и клонов животных и растений. Именно эти научные исследования и легли в основу современной биотехнологии. Безусловно, современная биотехнология является апогеем развития молекулярной биологии, вместе с тем, она стала интегрирующим звеном многих биологических, химических и технических наук. Специалисты вполне обоснованно считают, что именно биотехнология способна решить такие глобальные проблемы, как сохранение окружающей среды, охрана здоровья, получение новых продуктов питания, энергетические проблемы, с которыми столкнется человечество в третьем тысячелетии. Нет сомнений, третье тысячелетие будет не только, а может, и не столько веком информационных технологий, столько веком биологии и биотехнологии. Вместе с тем достижения биотехнологии уже сегодня столь серьезны, что они породили и глубокие сомнения в безопасности выбранного пути. Вопрос этот отнюдь не простой и не может быть решен в одночасье. Попытаемся и мы получить ответ на этот вопрос на примере возможностей и ограничений двух технологий: технологии рекомбинантных ДНК и метода клонирования животных. Тех самых технологий, которые вызывают наибольший интерес и тревогу одновременно.^ Технология рекомбинантных ДНК или генная инженерияТехнологию рекомбинантных ДНК можно определить как конструирование в искусственных условиях функционально активных генетических структур или рекомбинантных ДНК. Рекомбинантные ДНК - это ДНК, образованные в результате объединения нескольких фрагментов ДНК, которые были выделены из различных источников, и эта генетическая конструкция перенесена в реципиентную клетку, где она проявляет свою активность, т. е. принимает участие в синтезе определенных белков. В результате таких манипуляций в реципиентной клетке синтезируются новые типы белков, которые ранее в ней отсутствовали, или, говоря другими словами, рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентной клетки и сообщают ей новые свойства. Так были получены клетки бактерий E.coli, синтезирующие такие человеческие белки, как инсулин, соматостатин, гормон роста и др. (рис. 3).Основным объектом манипуляции в технологии рекомбинантных ДНК являются гены или фрагменты ДНК, кодирующие определенные белки. Необходимо отметить, что материальная основа гена была определена после раскрытия структуры ДНК, и уже спустя менее 20 лет ген был "материализован", т. е. стало возможным выделение и манипуляция отдельными генами как молекулами. Сейчас с геном можно "работать": выделять, подвергать его микрохирургическим операциям, переносить в другие клетки. Ген можно выделить, используя различные подходы: можно "вырезать" его из природной молекулы ДНК, можно получить копию гена на предварительно выделенной молекуле матричной РНК, а можно осуществить химический синтез гена (при условии, что известна последовательность нуклеотидов необходимого гена). Инструментами в технологии рекомбинантных ДНК являются ферменты и прежде всего рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы), ДНК-полимеразы, РНК зависимая ДНК-полимераза (ревертаза), лигазы. Наиболее удачным подходом при переносе гена в реципиентную клетку является использование кольцевых молекул ДНК (векторов). Такие векторные молекулы ДНК способны самостоятельно (независимо от ДНК клетки) существовать в клетках бактерий. Необходимо отметить, что выделенные гены не обладают видовой специфичностью и позволяют конструировать фрагменты ДНК любого происхождения и тем самым преодолевать видовые генетические барьеры и осуществлять неограниченные межвидовые генетические переносы. В качестве примера можно привести эксперименты по синтезу белков человека в клетках бактерий или образование моноклональных антител в клетках растений. Развитие технологии рекомбинантных ДНК породило множество опасений, большинство которых сводится к тому, что свободные манипуляции генами могут привести к появлению организмов с новыми свойствами, а так как эти свойства нами не контролируются, то это может быть опасно для человека. Эти мысли в свое время были высказаны известными учеными – Бергом, Уотсоном, Поллоком и другими и рассматривались как весьма веские и аргументированные соображения. В результате в 1975 году на конференции в Ассиломаре (Калифорнийское побережье США) было решено, что генно-инженерные работы необходимо вести в особых лабораториях. К таким исследованиям допускались лишь те, кто сдал экзамен по "технике генетической безопасности". Весь воздух, выходящий из лаборатории должен был пропускаться через систему специальных фильтров, не допускающих выхода микроорганизмов в среду. Персонал перед выходом из такой лаборатории обязан был принимать душ и менять одежду. Такие защитные мероприятия оказались очень дорогостоящими, а вред генетических исследований не был доказан. Мы еще раз отчетливо осознали всю бездну нашего незнания, и, естественно, принять в таких условиях какие-то радикальные меры предосторожности просто невозможно. Накопленный за последние годы опыт в этой области показал, что опасения слишком преувеличены и основаны на простой человеческой логике и эмоциях, а не на фактах. На поверку оказалось, что трансформированные клетки (клетки, содержащие рекомбинантные ДНК) чрезвычайно прихотливы и требуют особо бережного отношения. За более чем 20-летний опыт работы с такими клетками не было зафиксировано ни одного случая заражения или какого-либо вреда для человека. Вместе с тем накопленный опыт пока невелик, и трудно прогнозировать результаты, которые еще будут получены в этой интенсивно развивающейся области. А пока все высказанные прогнозы как оптимистические, так и пессимистические, не оправдались. Пожалуй, наиболее отчетливо две противоположные точки зрения о потенциальном вреде и пользе генно-инженерных работ высказали два всемирно известных ученых - Э. Чаргафф и Г. Бойер. Первооткрыватель структурных единиц ДНК Э. Чаргафф говорил: "Имеем ли мы право необратимо противодействовать эволюционной мудрости миллионов лет только для того, чтобы удовлетворить амбиции и любопытство нескольких ученых?" На это высказывание Г. Бойер ответил так: "Это так называемая эволюционная мудрость дала нам комбинацию генов, которая привела к бубонной чуме, оспе, желтой лихорадке, тифу, полиомиелиту и раку и которая продолжает давать такие новые болезни, как лихорадка Ласса, магдебурский вирус, а совсем недавно геморрагическую лихорадку, которая дает 100-ю смертность у инфицированных людей в Заире и Судане". Не все так просто, можно приводить бесконечное множество аргументов "за" и "против" технологии рекомбинантных ДНК, однако выбор будет определяться реальной пользой и конкретной опасностью. А пока все потенциальные выгоды или опасности будут оставаться эмоциональными высказываниями. Развитие технологии рекомбинантных ДНК и других методов генной инженерии уже оказалось чрезвычайно полезным в решении ряда практических задач. Я приведу только два примера практического использования этих технологий, в частности картирование генома человека и решение проблем наследственных болезней человека.^ Картирование генома человека и наследственные болезниТехнология получения рекомбинантных ДНК позволила не только осуществлять синтез необходимых человеку белков, но и привела к созданию генетических маркеров, или так называемых генных зондов. Используя эти генные зонды, можно точно определить структуру генетического аппарата человека. Необходимо напомнить, что до появления методов генной инженерии о существовании генов судили только по появлению мутаций, наличие которых определяли по изменению глазного пигмента, морфологии конечностей или другим признакам экспериментальных животных. После того как было констатировано наличие гена, начиналось определение его местоположения в геноме. Метод определения локализации гена в хромосоме был основан на явлении рекомбинация родительских хромосом или кроссинговера, который определяет частоту появления особей с новыми признаками. Методы технологии рекомбинантных ДНК позволили вводить нужный фрагмент ДНК в клетку бактерии, там его размножить (клонировать) и впоследствии выделить, очистить и осуществить физическое картирование. После этого определить последовательность нуклеотидов в данном гене (секвенирование). Технология рекомбинантных ДНК позволила глубже понять фундаментальные механизмы функционирования генома. В частности, стали понятны генетические причины многообразия антител, обнаружено существование онкогенов, выявлена интрон-экзонная организация генов и открыты мобильно диспергированные генетические элементы. Уже этот краткий перечень фундаментальных достижений в биологии свидетельствует об огромной пользе технологии рекомбинантных ДНК. Не меньшее значение может иметь эта технология и в медицине. К настоящему моменту описано почти 3000 наследственных заболеваний и в этом отношении чрезвычайно важны методы диагностики. Генетическая диагностика с использованием генных зондов может быть проведена на 11-й неделе беременности, она позволяет выявить более десятка серьезных заболеваний и точно установить характер мутации соответствующего гена. Разработка методов генной инженерии позволила начать реализацию проекта "Геном человека", который направлен на расшифровку 3,5 млрд. нуклеотидных последовательностей, которые составляют генетический аппарат человека. Выполнение этого проекта позволит установить наличие и локализацию большинства мутаций, что будет иметь большое значение в борьбе с наследственными болезнями. Насколько это актуально? Для ответа можно привести только две цифры. Более половины детской смертности в индустриально развитых странах связано с серьезными наследственными заболеваниями и от 2 до5 % рождающихся детей имеют генетические дефекты. Следовательно, развитие методов технологии рекомбинантных ДНК уже позволило решить целый ряд фундаментальных задач и подготовить базу их практического использования. Это будет иметь большое значение в борьбе с генетическими болезнями и онкологическими заболеваниями. Кроме того, даст возможность получать ценные медицинские препараты, такие как гормоны, факторы роста, ферменты. И в этом отношении технологии рекомбинантных ДНК нет альтернативы. Вместе с тем технологии рекомбинантных ДНК, как и другие методы, имеют свои ограничения, которые, в частности, связаны с низкой эффективностью переноса генов в реципиентные клетки, с неконтролируемой экспрессией чужеродных генов, с потерей в некоторых случаях чужеродных генов. Решение этих задач наверняка приведет нас к открытию новых закономерностей функциональной организации генома и будет способствовать дальнейшему прогрессу наших знаний. И все же не следует преувеличивать возможности технологии рекомбинантных ДНК. Так, после создания этой технологии некоторые чрезмерно эмоциональные ученые начали говорить об очередной биологической революции. На что академик А. А. Баев возразил: "Технологическая реконструкция ДНК является лишь утонченной технологией манипуляции генами и не содержит нового взгляда на процессы наследственности, а потому причисление ее к событиям революционного ранга вызывает раздумье". Не менее популярной и интригующей стала разработка и использование методов клонирования животных.^ Клонирование животныхБлагодаря усилиям журналистов проблема клонирования млекопитающих стала чрезвычайно популярной. О возможностях и перспективах клонирования можно прочитать в художественной литературе, увидеть специальные репортажи на телеэкранах. Правда, Й. Тихий (герой романа С. Лема) и герои книги М. Смита "Клоны" (1997) сталкиваются с морально-этическими проблемами. Большой резонанс и общественный интерес вызвала книга А. Левина (американский журналист, который пишет на темы науки) "Мальчики из Бразилии". Повествование основано на том, что в джунглях создана лаборатория, в которой клонируют "гитлеров" из клеток кожи фюрера. Бесспорно, наибольший общественный резонанс имело сообщение, опубликованное в известном журнале "Нейчур" в феврале 1997 г. о рождении овечки Долли в институте Рослин, в Эдинбурге, и последовавшего за этим принятия Конгрессом США законопроекта, запрещающего "создавать" человеческие существа путем клонирования и ядерного переноса в соматические клетки. Итак, благодаря усилию журналистов и склонности к сенсациям некоторых ученых было сформировано представление о том, что биологи бросили вызов Создателю и могут "воскресить" из мертвых давно ушедших. Возможности в создании новых биологических форм не ограничены, а, следовательно, таят в себе большие опасности. Первая реакция человека на новое и неизвестно - это страх, а за страхом, как правило, следует запрет. Вместе с тем, необходимо помнить, что за всю историю нашей цивилизации ни один запрет не был эффективным. И все же давайте отбросим страх и первичное, порой, бессознательное неприятие нового и проанализируем ситуацию с клонированием. Основные аргументы противников клонирования основаны на том, что это неестественно. В связи с этим необходимо напомнить, что клонирование постоянно происходит в естественных условиях, в результате которого рождаются однояйцовые или идентичные близнецы. Вегетативное размножение простейших и растений является природным клонированием. Итак, что такое клонирование, как оно осуществляется и когда были начаты эти работы? Клонирование – это воспроизведение генетических копий взрослого организма. Клонирование эмбрионов условно может быть разбито на четыре основных этапа: 1. Из соматической клетки (любая клетка тела, исключая половую) выделяют клеточное ядро. Необходимо напомнить, что в ядрах половых клеток содержится половина всех хромосом, такой набор называют гаплоидным, а при слиянии двух половых клеток происходит восстановление хромосомного набора (один от клетки отца, другой от клетки матери) и такой восстановленный набор называют диплоидным. Во всех клетках организма диплоидный набор хромосом, и он в определенных условиях может обеспечивать развитие целого организма. 2. Выделяют ооцит (женскую половую клетку) и удаляют ее собственное ядро, т. е. проводят энуклеацию ооцита. 3. В энуклеированный ооцит пересаживают диплоидное ядро соматической клетки 4. Осуществляют активацию ооцита к развитию (для этого используют электрический импульс) и пересаживают его (ооцит) в матку реципиентной самки. Первые пересадки ядер из одной клетки в другую были успешно проведены Командоном и Де Фонбрюном еще в 1939 г. на клетках амеб, а Бриггс и Кинг осуществили пересадку живых ядер соматических клеток в ооцит лягушки в 1952 г. С тех пор пересадки ядер проводились многократно и результаты были обобщены замечательным английским эмбриологом Дж. Гердоном в 1974 г. К сожалению, сейчас уже многие забыли, что в конце 70-х годов после удачного клонирования лягушек уже прошла одна жаркая дискуссию о возможности клонирования людей. Тогда пришли к выводу, что млекопитающие – не лягушки, и, вероятно, понадобится не один десяток лет, чтобы научиться клонировать зародыши млекопитающих. Однако результаты были достигнуты гораздо раньше. Широкомасштабное клонирование эмбрионов крупного рогатого скота уже проведено в США и Канаде. Клеточные ядра были получены от 34-64-клеточных эмбрионов. Эти ядра пересаживали в ооциты, из которых были удалены их собственные гаплоидные ядра и реконструированные таким способом ооциты пересаживали коровам-реципентам, у которых впоследствии рождались телята, похожие друг на друга как близнецы. Возникает вопрос насколько необходимо и целесообразно такое клонирование. С помощью клонирования могут быть получены клоны ценных пород животных, высокая стоимость которых известна, эта технология позволяет регулировать пол животных, что очень важно в сельском хозяйстве. Описанная технология клонирования позволяет использовать диплоидные ядра не только от эмбрионов, но и из клеток взрослых животных. Именно это и открыло фантастические возможности генетического воспроизводства вымерших животных или людей, если сохранились целыми их клеточные ядра. А ведь можно заранее побеспокоиться и создать банк клеточных ядер, из которых при необходимости могут быть получены соответствующие организмы. Что еще, кроме воспроизводства ценных пород сельскохозяйственных животных, может дать нам технология клонирования? По данным специалистов, в России и Украине каждая шестая семейная пара бесплодна. Это не только семейная трагедия, но и серьезная государственная проблема. Проблема может быть решена с помощью технологии клонирования, при этом ребенок будет генетической копией того из родителей, чье клеточное ядро обычной соматической клетки пересажено в яйцеклетку матери. Необходимо обратить внимание, что при этом вы реально продолжаете себя во времени, т. е. создаете своего двойника. Еще более серьезная проблема - это избавление от тяжелых генетических болезней. Если у одного из родителей обнаружена генетическая мутация (метод картирования), то ребенок может родиться благодаря использованию ядра соматических клеток только здорового родителя. Существует и большое количество экзотических подходов к использованию клонирования, на которых не будем останавливаться. Резюмируя, можно утверждать, польза и те блага, которые может получить человек в третьем тысячелетии, используя технологию рекомбинантных ДНК и методы клонирования, огромны и они во много раз превышают тот страх и опасения, которые высказывают эмоциональные скептики. Вместе с тем на пути реализации этих современных технологий пока существуют серьезные ограничения. Так, технология клонирования далека от совершенства и эффективность ее пока невысока. Овечка Долли лишь одни удачный случай из 277 вариантов, т. е. 276 попыток были неудачны. Из 302 пересаженных реконструированных ооцитов крупного рогатого скота беременными оказались только 110 коров или 36,4 %. Более того, 10 эмбрионов погибло на ранних этапах развития и родилось только 100 телят. Проблема низкой эффективности технологии становится особенно острой, если работы проводятся с эмбрионами человека. Ведь результат каждого неудачного случая - появление человеческих уродов. Кто должен нести ответственность за это? Возникает серьезная социальная и этическая проблема, и таких проблем сегодня очень много. Поэтому заявления, подобные тем, которые были сделаны чикагским физиком Сидом (1998 г.) о том, что он готов осуществить клонирование людей, пока преждевременны. Если и ставить вопрос о клонировании людей, то только тогда, когда эффективность этого метода будет обеспечивать не меньшую эффективность, чем обычная хирургическая операция. Однако такое положение дел останавливает далеко не всех исследователей. Американский физик Ричард Сид на пресс-конференции, которую он провел в Японии, заявил о своих намерениях начать клонирование людей в Токио. Для этого он планирует построить сеть суперсовременных клиник. В этих клиниках будут осуществлять лечение бесплодных пар, устранять генетические дефекты и клонировать редких животных. На следующем этапе будет проводиться клонирование отдельных органов людей, и только после этого осуществлено клонирование людей. И, как заявил Р. Сид, первый клонированный ребенок появится из клеток организма его жены. Для реализации проекта понадобится около 20 млн. долларов, а это совсем немного, если учесть стоимость современного самолета и возможной пользы от этих работ. Р. Сид не одинок в своих намерениях. Немецкие ученые считают, что правительству Германии необходимо внести изменения в закон и положение о научно-исследовательских работах с целью открытия возможности клонирования клеток и тканей для лечения серьезных заболеваний. Несмотря на официальный запрет клонирования людей в США, генетики штата Висконсин уже получили клоны клеток зародышей человека. И в этом смысле история повторяется. Американские ученые предлагают разобраться с потенциальной опасностью клонирования, а сами в это время совершенствуют методы этой технологии. В начале 1999 г. ученые Великобритании получили официальное разрешение властей на выращивание человеческих органов для оперативной хирургии.^ Вместо заключенияМногие специалисты увлеклись анализом перспектив современных биологических технологий и, как водится в таких ситуациях, забыли о трудностях, возникающих при использовании этих методов. А ведь еще Гердан в своих классических работах по пересадке ядер показал, что с увеличением возраста доноров их ядра, взятые для пересадки, постепенно утрачивают способность обеспечивать нормальное развитие яиц реципиента. Большая часть аномалий, наблюдаемых у зародышей с пересаженными ядрами, возникала за счет изменения ядра донора. Мы очень мало пока знаем о механизмах влияния цитоплазмы ооцита на процессы развития и свойства организма, который был получен методом клонирования. Уже начали появляться сообщения, что организмы, полученные в результате повторного клонирования, необычайно быстро стареют. Если это окажется закономерностью (пока этого мы не знаем), то сможет пролить свет на феномен ускоренного старения (прогерию), что очень важно для выяснения механизмов явления. Все это может позволить совершенно по-другому рассматривать процессы старения человека. Я убежден, что поиск ответов на те вопросы, которые возникли и еще возникнут при развитии таких технологий, будут точками роста новых знаний, которые определят облик грядущего века. И все же эксперименты по технологии рекомбинантных ДНК и клонированию – это не прихоть и амбиции современных биологов, это – естественный путь познания природы. Путь познания не бывает безопасным, однако альтернативы ему нет. Мы стоим на пороге нового тысячелетия – на пороге будущего, и уместно вспомнить слова Г. Уэллса, которые он написал в начале 20-го века: "Вполне возможно, что прошлое – всего лишь начало начала, а все, что есть и было, – лишь первый луч зари. Вполне возможно, что все достигнутое человеческим разумом – всего лишь сон перед пробуждением..." Закончить это краткое повествование я хочу словами У. Вивера: "Мы говорим о вступлении в биологический век, и это – не пустые слова. Это явление огромной значимости, один из поворотных пунктов в истории человеческой мысли. Биологи говорят о биохимической генетике, электрофорезе и электронном микроскопе, о строении молекул и радиоактивных изотопах. Не подумайте, что все это не более чем одна из забав. Это надежный путь к решению проблемы рака и полиомиелита, ревматизма и сердечно-сосудистых заболеваний. На этом пути будут получены знания, на основе которых мы сможем решать проблемы обеспечения продовольствием все возрастающего населения Земли. Это путь к познанию тайн жизни".