2. Експериментальна частина.2.1. Об’єкти та методи досліджень 2.1.1. Матеріали дослідженьМатеріалом для досліджень служили зразки периферичної крові хворих фенілкетонурією, членів їхніх родин, донорів з різних регіонів України, пацієнтів, включених у програму генетичного тестування, а також біоптати хоріона, плаценти і некультивовані клітки амніотичної рідини, отримані від вагітних з цих родин у ході пренатальної Днк-діагностики. Зразки крові пацієнтів, включених у програму генетичного тестування, були надані клінікою “Исида- IVF” (м. Київ). Для виділення ДНК у роботі були використані наступні реактиви: желатин, протеіназа К, додецилсульфат натрію, TRITON X-100, етилендіамінтетраамінуксусна кислота виробництва фірми "SIGMA"; сахароза, перхлорат натрію, магнію хлорид, етанол, ізопропанол, хлороформ, фенол, натрію хлорид вітчизняного виробництва марок ЧДА й ОСЧ. Олігонуклеотидні праймери для полімеразної ланцюгової реакції, гомологічні нуклеотидним послідовностям гена ФАГ були синтезовані в Інституті біоорганічної хімії РАН (Москва) і на фірмах Amersham, Pharmacia Biotech (Австрія), Genosys (Великобританія), MWG Biotech AG (Великобританія). Використовувалася термостабільна Taq полімераза виробництва "Біокон" (м. Москва, Росія), Fermentas (Литва). Набори дезоксинуклеотидтрифосфатів виробництва "Біокон" (м. Москва, Росія) і Amersham, Pharmacia Biotech (Австрія). Рестрицируючі ендонуклеази Msp, Eco1301, Mnl, Rsa, Eco881, BamHI, Sau3A, Hinf, фірми Fermentas (Вільнюс, Литва), а також Dde фірми Amersham, Pharmacia Biotech (Австрія) .“ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequincing Ready Reaction Kits” виробництва компанії “PE Biosystem” був використаний при проведенні реакції сіквенувания. TRIS (гідроксиметиламінометан), ТАЕ, акриламід, бісакриламід, сечовина, агароза, етидіум бромід, формамід, бромфеноловий синій, ксиленцианол виробництва фірми "SIGMA"; TEMED (N,N,N,N'-тетраметилетилендиамін) виробництва фірми "REANAL"; ТЕАА (триетиламін ацетат), ацетонитріл виробництва фірми “Lennox” були використані при фракціонуванні ПЛР продуктів методами електрофорезу і хроматографії. Інші реактиви вітчизняного виробництва марок ОСЧ і ЧДА. 2.1.2. Методи досліджень2.1.2.1. Виділення й очищення ДНКДНК виділяли зі зразків свіжої крові по методу, запропонованому авторами з Німеччини [70]. Для поділу лейкоцитарної і еритроцитарной фракцій до відомих обсягів крові (8-10 мл) зі стандартним консервантом глюгициром доливали рівний обсяг розчину, що містить 3,5% желатину і 0,8% NaCl. Потім суміші давали разслоїтися у вузькому циліндрі і піпеткою відбирали світлий верхній шар, що містить взвісь лейкоцитів. Після цього взвісь переносили в центрифужну склянку, додавали рівний обсяг фізіологічного розчину (0,8% NaCl) і центрифугували при 3000 g протягом 10 хвилин. Осад кліток ресуспендували, додавали 100 мл фізраствору (0,8% NaCl), та повторно центрифугували. Потім осад лейкоцитів ресуспендували в 2 мл фізраствору (на 10 мл крові) і додавали 2 мл 0,5М ЕДТА (рН 8,0). Після цього лизирували клітки додаванням розчину додецилсульфату натрію (SDS) до кінцевої концентрації 1%. Для осадження білків до лізату додавали розчин перхлорату натрію до кінцевої концентрації 1,2М. Депротеінізацію лізати здійснювали додаванням рівного обсягу суміші хлороформу з ізоаміловим спиртом (24:1) і плавним помішуванням на протязі 10 хвилин з наступним центрифугуванням при 3000 g протягом 15 хвилин. Після центрофугування відбирали водяну фазу і повторювали процедуру депротеінізації 2-3 рази до зникнення інтерфази. Потім до очищеного лізату повільно додавали 0,6-0,8 об’єму ізопропілового спирту й осад ДНК вимотували на скляну паличку. Після цього промивали осад ДНК на паличці 70%-ним етанолом, підсушували і розчиняли в невеликій кількості (2-3 мл) деіонізированної води. Після повного розчинення ДНК переосаджували двома об’ємами холодного 96% етилового спирту, попередньо додавши NaCl до кінцевої концентрації 0,1М. Після підсушування осад розчиняли в 0,1ХSSс або у деіонізированій воді. Якість препаратів ДНК оцінювали методом електрофорезуу в 0,6%-ному агарозному міні-гелі. З лейкоцитів крові з великими термінами давнини (2-5 доби), некультивованих кліток амніотичної рідини, хоріона і плаценти ДНК виділяли - шляхом гідролізу лізатів кліток протеіназою К с наступною фенол-хлороформною екстракцією [71]. У випадку виділення ДНК з крові до відомого об’єму (1-10 мл) охолодженої при температурі +4˚С крові для лізису лейкоцитів додавали 7-9 об’ємів холодного буфера, що містить 5 мМ МgCl2, 0,10 мМ ТРИС-НСl (p 8,0), 1% Тритон Х-100, 0,32 М сахарози й осаджували ядра шляхом центрофугування при 2500g при температурі +4˚З протягом 15 хвилин. Осад ядер ресуспендували в 500-700 мкл (при виділенні ДНК із 5-10 мл крові) буфера, що містить 100 мМ NaCl, 10 мМ ТРИС-НСl (рН 8,0), 1 мМ ЕДТА (рН 8,0). Потім додавали 10%-ний розчин SDS до кінцевої концентрації 0,5% і протеіназу К до кінцевої концентрації 100 мкг/мл. Після інкубації лізатів ядер протягом 4 годин при 550С або протягом 12-16 годин при температурі 370С здійснювали їхню депротеінізацію шляхом послідовної екстракції фенолом (рН 8,0) забуференному Tris-HCl, сумішшю рівних обсягів фенолу з хлороформом і хлороформом до зникнення інтерфази після центрофугування. Осад ДНК одержували додаванням до очищеної водяної фази 2-2,5 об’ємів холодного 96% етилового спирту, промивали 70%-ним етиловим спиртом, підсушували і розчиняли в деіонізированій воді. Процедура виділення ДНК із кліток плоду відрізнялася від вищеописаної відсутністю першого етапу – центрофугування із сахарозним буфером. Якість препаратів ДНК визначали методом електрофорезу в 0,6%-ному агарозному гелі.2.1.2.2. Ампліфікація послідовностей гена ФАГ методом полімеразної ланцюгової реакціїПолімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили в автоматичному режимі на термоциклері "Perkin Elmer" (фірма "Cetus", США). Реакційна суміш об’ємом 25 мкл містила: - ТРИС-НСl – 67 мМ (рН 8,8 при 250С); - (NH4)2SO4 – 16,7 мМ; - -меркаптоетанолу – 10 мМ; - ЕДТА – 6,7 мкМ; - MgCl2 – 2,5-3 m; - Бичачий сироватковий альбумін – 170 мкг/мл; - dNTP – по 400 мкм кожного типу; - ДНК – 1 мкг матриці; - термостабильна ДНК-полімераза – 0,5 одиниць активності; - олігонуклеотидні праймери – по 1 10–3 оптичних одиниць кожного. Далі в пробірку додавали по 20 мкл вазелінової олії для запобігання випару зразків і поміщали пробірки в термоциклер. У залежності від складу нуклеотидних основ і розміру ампліфіцируємого фрагменту використовувалися різні програми проведення полімеразної ланцюгової реакції, що включають у себе три основні етапи: денатурація ДНК, віджиг праймерів, синтез ДНК. Для R408W, IVS12nt1, Y414C, IVS10nt546 використовувався наступний температурний цикл: 1) попередня денатурація протягом 4 хв при температурі 94ºС; 2) 30 циклів кожний з яких складається з трьох етапів (2.1 – 2.3): - денатурація ДНК – 94ºС протягом 40 з, - віджиг праймерів проводився при температурі 57ºС протягом 40с., - елонгація - 72ºС протягом 40 с. 3) елонгація - 72ºС протягом 7 хв.Для R158Q використовувався наступний температурний цикл: 1) попередня денатурація протягом 4 хв при температурі 94ºС; 2) 30 циклів, кожний з яких складається з трьох етапів (2.1 – 2.3): - денатурація ДНК – 94ºС протягом 50 з, - віджиг праймерів - 60ºС протягом 50 с, - елонгація - 72ºС протягом 50 с. 3) елонгація - 72ºС протягом 7 хв.Для ампліфікації сьомого екзона використовувався наступний температурний цикл: 1) попередня денатурація протягом 5 хв при температурі 94ºС; 2) 5 циклів, кожний з яких складається з трьох етапів (2.1 – 2.3): - денатурація ДНК – 94ºС протягом 40 с, - віджиг праймерів - 61ºС протягом 40 с, - віджиг праймерів - 59ºС протягом 40 с, - елонгація 72ºС протягом 50 с. 3) 30 циклів, кожний з яких складається з трьох етапів (3.1 – 3.3): - денатурація ДНК – 94ºС протягом 40 с, - віджиг праймерів - 60ºС протягом 10 с, - віджиг праймерів - 59ºС протягом 15 с, - віджиг праймерів - 57ºС протягом 45 с. 3.5) елонгація 72ºС протягом 50 с., 4) елонгація 72ºС протягом 7 хв.Після 30 - 35 циклів ампліфікації зразки витримували протягом 10 хвилин при температурі 700С и прохолоджували при кімнатній температурі. При необхідності синтезовані продукти ПЛР зберігали протягом до 2-х місяців при +40С.2.1.2.3. Ідентифікація мутацій методом рестрикційного аналізуДаний метод аналізу нуклеотидної послідовності, заснований на ампліфікації in vitro фрагмента ДНК гена, що фланкирують ділянку локалізації мутації з наступною обробкою продукту ПЛР ендонуклеазою рестрикції, сайт дізнавання для якої з'являється або зникає в результаті мутації. У тих випадках, коли не вдається підібрати рестриктазу для такого аналізу, використовується один з варіантів методу полімеразної ланцюгової реакції – метод сайт спрямованого мутагенезу. Один із праймерів, що використовувався при методі сайт- спрямованого мутагенезу несе на 3'-кінці одиничну нуклеотидну заміну, що дозволяє створити сайт рестрикції в нормальній або мутантній послідовності. Полімеразна ланцюгова реакція проводилася за основною схемою описаною в розділі 2.2.2. У таблиці 2.1 наведені послідовності і температура віджигу олігонуклеотидних праймерів, що використовувалися для ампліфікації екзонних і інтронних послідовностей гена ФАГ. Для проведення рестрикційногоого аналізу мутацій до продуктів ПЛР об’ємом 10 –20 мкл (у залежності від концентрації продукту) додавали 1 – 10 одиниць активності відповідної ендонуклеази рестрикції (таблиця 2.2) і інкубіровали суміш протягом 2 – 16 годин при температурі +37 0С в усіх випадках, за винятком рестриктази Eco881, для якої інкубацію проводили при температурі +4 0С. Продукти рестрикції аналізували в 1,8% агарозному гелі. Як маркер молекулярної маси використовували 100 Base-Pair Ladder (фірма "Pharmacia"). Гелі фарбували бромістим етидіумом і сканували на УФ-трансіллюмінаторі. Таблиця 2.1. Послідовності олігонуклеотидних праймерів і особливості проведення ПЛР для наступного рестрикційногоого аналізу мутацій гена ФАГ. Мутація Послідовність праймерів T віджигуC R158Q 5'- TCCTGTGTACCGTGCAAGCC-3'5'- CCATCCTCAACTGGATGAGG-3' 60 R252W, R261Q, R261X, G272X, S273F, P281L 5’- cagaactgaaactgactcgg –3’ 5’- tgctccaagagagtcatacc –3’ 55 R408W 5'- ATGCCACTGAGAACTCTC TT-3'5'- AGTCTTCGATTACTGAGAAA-3' 55 Y414C 5'- TCGGCCCTTCTCAGTTCGGT-3'5'- AGTCTTCGATTACTGAGAAA-3' 55 Ivs10nt546 5'- TGCAGCAGGGAATACTGATC-3'5'- TAGACATTGGAGTCCACTCTC-3' 55 Ivs12nt1 5'- TCGTAAGGTGTAAATTACGTA-3'5'- ATGCCACTGAGAACTCTC TT-3' 55 Таблиця 2.2. Умови проведення аналізу мутацій гена ФАГ методом рестрикційного аналізу Мутація Локалізація Розмір ПЛР продуктуп.н. Ендо-нуклеаза Розмір рестрикційних фрагментівп. н. Посилання R158Q 5 екзон 142 -MspI 123+19 70 R252W 7 екзон 169 -Eco881 113+56 74 R261Q 7 екзон 169 -HinfI 87+82 74 R261X 7 екзон 169 -DdeI 85+84 75 G272X 7 екзон 169 -BamHI 119+50 75 S273F 7 екзон 169 +Sau3A 119+50 75 P281L 7 екзон 169 +MspI 147+22 70 R408W 12 екзон 245 +Eco1301 148+97 72 R408W 12 екзон 245 -MnlI 105+27+72+39132+72+39 76 Y414C 12 екзон 147 -RsaI 126+21 70 Ivs10nt546 10 інтрон 295 +DdeI 246+49 73 Ivs12nt1 12 інтрон 215 -RsaI 195+20 71 + сайт рестрикції створюється при мутації; - сайт рестрикції зникає при мутації розмір рестрикційних фрагментів у «нормальній» послідовності ДНК розмір рестрикційних фрагментів при мутації 2.1.2.4. Аналіз алельних варіантів VNTR-локусу 3`-нетрансльованої ділянки гена ФАГДля аналізу алельних варіантів VNTR-локусу гена ФАГ проводили ампліфікацію in vitro специфічної послідовності ДНК цього локусу з використанням олігонуклеотидних праймерів, приведених у таблиці 2.3 [72]. Полімеразна ланцюгова реакція проводилася при умовах, описаних у розділі 2.1.2.2.Таблиця 2.3. Послідовності олігонуклеотидних праймерів, які використо-вуються для ампліфікації in vitro методом ПЛР VNTR-локусу гена ФАГ Назва праймера Нуклеотидна послідовність VNTR a 5'- GCTTGAAACTTGAAAGTTGC-3' VNTR b 5'- GGAAACTTAAGAATCCCATC-3' Ампліфікація проводилася з використанням термоциклерів «Ампли-2» і «Ампли-3» по наступній програмі: 1 цикл 94 ºС – 4 хв 3 цикли 94 ºС – 36 сек. (денатурація) 57 ºС – 45 сек (віджиг праймерів) 71 ºС – 45 сек (синтез) 26 циклів 94 ºС – 36 сек (денатурація) 53 ºС – 30 сек (віджиг праймерів) 58 ºС – 42 сек (віджиг праймерів) 65 ºС – 90 сек (синтез)Продукти ПЛР аналізували після їхнього фракціонування в 1,8% агарозному гелі. Гелі фарбували бромістим етидієм і сканували на УФ-трансіллюмінаторі.