Студент : Тарасов А. Е.
Научный руководитель: д.х.н., проф. Клюев М.В.
Зав. кафедрой д.х.н., проф. Клюев М.В.
г. Черноголовка, 2005 г.
Введение
Гель-проникающая хроматография (ГПХ, гель-хроматография, гель-фильтрация, эксклюзионная хроматография) является одним из основных методов определения параметров молекулярно-массового распределения (ММР) полимеров и олигомеров. Этот метод имеет преимущество перед другими методами определения параметров ММР полимеров и олигомеров в быстроте и точности анализа. Но, не смотря на все преимущества этого метода, он все-таки не лишен недостатков. Одним из основных недостатков этого метода является его относительность, то есть для определения параметров ММР полимеров и олигомеров прибор необходимо откалибровать.
Данная курсовая работа посвящена исследованию возможностей известных методов калибровки хроматографа и экспериментальной проверке справедливости универсальной калибровочной зависимости для олигомеров пиперилена.
Обзор литературы
Особенности хроматографирования полимеров
Особенности полимерных растворов определяются тем, что их высокомолекулярный компонент – макромолекулы – являются сложными автономными системами, от поведения и свойств которых зависят свойства раствора в целом [1]. Это приводит к ряду аномалий по сравнению с растворами низкомолекулярных веществ. Поэтому в хроматографическом поведении полимерных растворов следует различать две стороны: общую с растворами низкомолекулярных веществ и ту, которая связана с проявлением определенных свойств макромолекул. Последняя приводит к закономерностям, не наблюдавшимся в хроматографии низкомолекулярных веществ: зависимость удерживаемых объемов (Vr) от конформационных изменений, происходящих с макромолекулами при попадании в поры сорбента, специфические зависимости Vr от скорости элюирования, концентрации раствора, его температуры и выбора растворителя.
Конформационные изменения, происходящие с макромолекулами при переходе из каналов подвижной фазы в поры сорбента, оказывают существенное влияние на результаты, получаемые в гель-хроматографии. Они приводят к появлению коэффициента распределения kd в уравнении:
,
где V0 – исключенный объем, Vp – объем всего порового пространства сорбента.
С увеличением скорости элюирования процесс становится более неравновесным. Это приводит, наряду с расширением хроматографических пиков, к увеличению их асимметрии и, как следствие этого, к сдвигу максимума пика.
Рис. 1. Размеры молекул весьма чувствительны к концентрации раствора. Взаимное отталкивание молекул уменьшает их размеры. А уменьшение размеров элюируемых молекул приводит к увеличению доступной для них доли порового пространства сорбента, и как следствие этого, к возрастанию удерживаемых объемов (Рис. 1 Зависимость удерживаемых объемов от концентрации элюируемого раствора (г/л) 1 – 5; 2 – 3; 3 – 1.3; 4 – 0.6; 5 – 0.15).
Также размеры молекул весьма чувствительны к температуре раствора. Их поведение в хороших растворителях
описывается уравнением:
,
где α – коэффициент набухания макромолекул; ψ1 – энтропийный параметр; Cm – константа, характеризующая данный ряд полимер-гомологов и не зависящая от молекулярной массы полимера (); Θ – идеальная температура (Т), при которой химический потенциал взаимодействия полимер – растворитель обращается в нуль.
Немаловажную роль в ГПХ играет выбор растворителя. Прежде всего, он должен обеспечивать отсутствие адсорбционного взаимодействия макромолекул с матрицей сорбента, во-вторых, выбор растворителя существенно предопределяет размеры макромолекул, а в случае использования набухающих сорбентов (гелей) задает и размеры пор в них. В-третьих, определенную роль играет и вязкость растворителя. С ее увеличением уменьшается диффузная подвижность макромолекул, и процесс в большей степени отклоняется от равновесного, вследствие чего хроматографические пики становятся более размытыми и асимметричными.
Эффект разделения в ГПХ обусловлен несколькими механизмами. Основными среди них являются молекулярноситовой, диффузионный и эксклюзионный. Действие каждого из них в конечном счете сводится к более быстрому продвижению вдоль хроматографической колонки крупных макромолекул, по сравнению с макромолекулами меньших размеров. В основе молекулярноситового механизма лежит соизмеримость элюируемых макромолекул и пор сорбента. Диффузионный механизм определяется подвижностью макромолекул в каждой из фаз колонки. От него зависит степень неравновесности процесса. Эксклюзионный механизм проявляется при хроматографировании на гелях. Причиной его является типичный для макромолекул эффект взаимного объемного исключения полимерных сегментов.
Калибровочная зависимость Мура
Рис. 2. Известно, что интерпретация данных ГПХ анализа в ММР полимеров основана на сопоставлении полимера данной молекулярной массы с величиной удерживаемого объема (Vr). Действительно, для макромолекул, эффективные хроматографические размеры которых близки к среднему размеру пор сорбента, наполняющего хроматографическую колонку, достаточно хорошо выполняется соотношение Мура:
,
где С1 и С2 – коэффициенты определяемые экспериментально (Рис. 2. Калибровочная зависимость Мура). Для определения этих коэффициентов хроматографические колонки калибруют [2]. Калибровочная процедура в ГПХ представляет собой совокупность экспериментальных и вычислительных операций, позволяющих подготовить в метрологическом отношении прибор для определения молекулярных масс и молекулярно-массового распределения полимеров. Калибровочная процедура в ГПХ преследует две цели. Это калибровка элюентных объемов в значения молекулярных масс, и учет на приборное уширение пиков, которое неизбежно при любом хроматографическом процессе.
Проведение калибровочных процедур справедливо только при соблюдении следующих условий:
1. отсутствие (или малая) концентрационная зависимость удерживаемых объемов;
2. отсутствие адсорбционных взаимодействий на сорбенте;
3. одинаковые условия (элюент, температура, скорость элюирования) при проведении калибровочных и аналитических экспериментов;
4. предельно высокое разрешение хроматографических колонок или использование хроматограмм скорректированных на приборное уширение.
Экспериментально элюентные кривые полимеров представляют собой автоматически записанные зависимости показателя преломления раствора вымываемых молекул от Vr.
Как показали Бергер и Шульц для полимеров узкого ММР на кривых, близких по форме к гауссовым, максимуму пика соответствует среднегеометрическое значение от и . Таким образом если располагать набором узких фракций исследуемого полимера с известными средними молекулярными массами, то, прохроматографировав их на системе колонок, можно значения элюентного объема максимумов пиков прокалибровать в логарифмах молекулярной массы исследуемого полимера. Если построить зависимость Vr от ln , где , в виде плавной линии, проходящей через точки, в пределах погрешности эксперимента (хроматографического и определения молекулярных масс) получится искомая калибровочная кривая. В большинстве случаев можно подобрать такую систему колонок, для которой в рабочем диапазоне будет выполняться линейная зависимость Мура.
Методы расчета параметров ММР
Рис. 3. Для количественной характеристики исследуемого полимера необходимо проведение калибровочной процедуры: нахождение функции Vr от , определение величин , , и построение функции распределения. В работе [3] описывается один из методов для определения параметров ММР полимеров – это метод треугольника (Рис. 3. Нахождение значений М0, М1, и M2 из хроматограммы методом треугольника). С использованием калибровочной зависимости находятся значения М0, М1, и M2 в соответствующих точках хроматограммы. Затем на основании величин а, b и М0 производится расчет средних молекулярных масс по уравнениям:
,
,
,
где , .
Также параметры ММР можно определить методом, который использовали при их определении дробным осаждением. Сущность этого метода заключается в том, что гель-хроматограмма делится на узкие участки и определяется доля каждого из них во всей хроматограмме. Затем, из калибровки определяется молекулярная масса этого участка и умножается на долю участка в образце. Сумма произведений молекулярных масс на долю участка в образце дает значение , то есть , можно найти как .
Универсальная калибровочная зависимость Бенуа
Рис. 4. Как было показано Бенуа и сотрудниками на примере 38 образцов относящихся к 9 типам полимерных соединений, резко отличающихся как по химической природе, так и по структуре в ГПХ наблюдается универсальная зависимость Vr от произведения характеристической вязкости на молекулярную массу полимера (Рис. 4. Универсальная калибровочная зависимость Бенуа):
,
где [η] – характеристическая вязкость, С1 и С2 – коэффициенты определяемые экспериментально. Однако точность определения С1 и С2 невысока, и зависит от точности определения значений и [η]. Поэтому возможность точного определения параметров ММР на гель-хроматографе экспериментально не реализуется из-за больших ошибок допускаемых при определении величин и [η]. Но несмотря на это универсальная зависимость Бенуа используется, так как не всегда возможно построить калибровочную зависимость Мура для исследуемого полимера ввиду отсутствия для него охарактеризованных по молекулярным массам стандартов.
Параметры ММР полимера из универсальной калибровки Бенуа можно рассчитать, зная значения констант Марка – Хаувинга - Куна (К и α) в уравнении:
для стандарта, по которому строится зависимость и исследуемого полимера в одном растворителе. Как видно из универсальной калибровочной зависимости Бенуа, справедливо равенство
из которого с учетом уравнения Марка – Хаувинга – Куна, можно калибровочную зависимость стандарта пересчитать в калибровочную зависимость исследуемого полимера по уравнению:
.
И уже из нее рассчитать параметры ММР исследуемого полимера.
Универсальная калибровочная зависимость для олигомеров
В некоторых работах по ГПХ малых молекул обобщенных в обзоре [4] для характеристики размера молекул предлагаются: эффективная длинна цепи, молярный объем или молярную массу. Кузаев, используя Ван-дер-ваальсовый объем в качестве универсального параметра размеров олигомерных молекул, показал, что ГПХ является абсолютным методом определения параметров ММР олигомеров [5]. Зависимости Vr = f (lg ΔV) подчиняются все олигомеры, для данного типа колонок (Рис. 5. Универсальная калибровочная зависимость для олигомеров). И как в случае калибровочной зависимости Бенуа для полимеров можно построить абсолютную калибровочную зависимость исследуемого олигомера на основании калибровочной зависимости для стандартов. Затем одним из вышеописанных способов рассчитать параметры ММР исследуемого олигомера.
Приборное уширение
Параметры ММР полученные любым из методов интерпретации гель-хроматограмм являются приблизительными, пока не будут скорректированы с учетом приборного уширения.
Приборное уширение – это уширение вводимой пробы в процессе хроматографирования, происходящее в ГПХ как и во всяком статистическом процессе, то есть если в колонку вводится кратковременный импульс раствора индивидуального вещества, то на выходе получается широкий «размазанный» импульс.
Как показано в работе [6] когда индивидуальное вещество проходит через систему жидкостного хроматографа, происходит целый ряд явлений, которые приводят к «размытию» вводимого импульса раствора. Эти явления можно условно разделить на три группы:
1. явления, связанные с геометрией колонки, упаковкой геля в колонке и молекулярной диффузией компонентов образца в подвижной фазе;
2. явления, связанные с самими процессами проникновения макромолекул в поры геля и выхода из них, а также адсорбционные явления;
3. размытие, возникающее при вводе пробы, в подводящих путях и в кювете детектора.
Все используемые методы определения приборного уширения были основаны на нахождении параметра G (V, y) в уравнении Танга:
,
где F (V) – гель-хроматограмма всего полимерного образца; G (V, y) – функция приборного уширения; W (y) – гипотетическая хроматограмма, которая получалась бы если приборное уширение отсутствовало. В качестве эмпирической модели функции приборного уширения использовалась гауссова функция, так как при использовании такой модели решение уравнения Танга становится простым с математической точки зрения.
Все используемые методы определения приборного уширения различаются тем, что используют разные методики определения параметра h в уравнении и не позволяют в полной мере использовать точность прибора.
В работе 3 показано, что применение метода Хамилека Рэя является адекватным для учета приборного уширения. Доказывается справедливость в его использовании для получения истинных значений параметров ММР. Корректировка значений , и производится по следующим формулам:
,
,
,
где , и - среднечисловая, средневесовая и средневязкостная молекулярные массы; , и - молекулярные массы, полученные из гель-хроматограммы. Приведенные выше формулы справедливы в случае линейной калибровочной кривой:
,
или, что то же самое,
(; )
Экспериментальная часть
Гель-проникающая хроматография осуществлялась на хроматографе фирмы «Waters» элюент – тетрагидрофуран, скорость его подачи 1.0 мл/мин. Для разделения олигомеров использовали стирогелевые колонии с пористостью 200, 500 и 1000 Å, а для разделения полимеров – с пористостью 3 ∙ 103, 3 ∙ 105, 3 ∙ 107 Å. Рефрактометрический детектор позволял работать с малыми навесками полимеров, которые вводили в течение 1 минуты в виде растворов в тетрагидрофуране концентрацией 0.1 – 0.2 вес. %. Растворитель (ТГФ) перед использованием сутки выдерживался над КОН и перегонялся с дефлегматором над КОН, для удаления образующихся в нем примесей и влаги. Навески стандартов брались с таким расчетом, чтобы при их растворении получались растворы с концентрацией 0,1 г/мл.
Перед и во время опыта растворитель дополнительно дегазируется пропусканием через него тока аргона.
Колонки для разделения полимеров (набор колонок В) калибровали с помощью полистирольных стандартов. Молекулярно-массовые характеристики полистирольных стандартов и соответствующие им объемы удерживания представлены в таблице:
Паспортные данные полистирольных стандартов и соответствующие им объемы удерживания.
№ п/п
/
Мp
Vr
1.
1950
2100
1.08
2025
128.20
2.
3100
4000
1.29
3550
126.35
3.
20200
20800
1.03
20500
116.35
4.
36000
33000
0.92
34500
112.50
5.
193000
200000
1.04
196000
103.20
6.
3150000
3750000
1.19
3440000
88.45
7.
3780000
4100000
1.08
4290000
88.30
8.
4050000
4870000
1.20
5500000
87.10
9.
9250000
11100000
1.20
10100000
86.45
Для калибровки набора колонок А использовали следующие стандарты таблица 2:
Паспортные данные стандартов полигликолей и соответствующие им объемы удерживания.
№п/п
Mp
Vr
№п/п
Mp
Vr
ППГ
ПЭГ
1.
76
23.28
1.
62
23.70
2.
134
22.56
2.
106
23.14
3.
425
19.45 – 20.10
3.
150
22.50
4.
790
18.47
4.
300
20.68
5.
800
18.54
5.
400
20.09
6.
1025
17.75
6.
600
19.30
7.
1200
17.61
7.
1010
18.32
8.
1220
17.70
8.
1500
17.23
9.
2000
16.75
9.
2000
16.78
10.
2020
16.65
10.
3000
15.95
11.
3900
15.49
11.
6000
15.05
12.
4000
15.42
Калибровочная зависимость Мура для набора колонок В построена с помощью математической программы Origin 6.0. При проведении калибровочной прямой через экспериментальные точки использовался метод наименьших квадратов. С помощью этой программы были определены коэффициенты С1 и С2 в уравнении Мура. С1 = 31.79406, С2 = 0.94179. Из калибровочной кривой видно, что данной системы колонок рабочий диапазон по молекулярным массам равен от нескольких сотен до нескольких миллионов.
Также на основании результатов хроматографирования полистирольных стандартов и с помощью констант Марка Хаувинга Куна для набора колонок В была построена универсальная калибровочная зависимость Бенуа.
Для набора колонок А была построена универсальная калибровочная кривая. Для этого рассчитаны Ван-дер-ваальсовые объемы молекул стандартов полиэтиленгликоля (ПЭГ) и полипропиленгликоля (ППГ) [6]. Ван-дер-ваальсовый объем всей молекулы рассчитывался по формуле:
,
где – ΔVi - Ван-дер-ваальсовый объем атомов входящих в молекулу полимера. Инкримент объема ΔVi рассматриваемого атома рассчитывается по формуле:
,
где R – межмолекулярный радиус рассматриваемого атома; h – высота сегмента вычисляемого по формуле:
,
где di – длины связей между двумя атомами; Ri – межмолекулярные радиусы соседних с рассматриваемыми, валентно связанных атомов.
Молекулярные массы стандартов полигликолей и соответствующие им Ван-дер-ваальсовые объемы молекул
ППГ
ΔV ППГ
ПЭГ
ΔV ПЭГ
76
78.2
62
61.0
134
141.4
106
107.0
425
458.5
150
153.0
790
856.2
300
309.8
800
867.1
400
414.4
1025
1112.3
600
623.5
1200
1303.0
1010
1052.1
1220
1324.8
1500
1564.4
2000
2174.7
2000
2087.1
2020
2196.5
3000
3132.5
3900
4245.0
6000
6268.9
4000
4354.0
Для проверки правильности построения универсальной калибровочной зависимости было рассчитано ММР некоторых стандартов. Оно совпадает с молекулярной массой указанной в паспорте стандарта.
Молекулярные массы стандартов по паспорту и расчитанные.
Паспортные данные
Рассчитанные данные
р стандарта
/
р рассчитанное
800
815
800
0.982
807
1200
970
1203
1.206
1095
3900
2307
4008
1.736
3040
При расчете параметров ММР олигопиперилена получены значения и , которые согласуются с этими значениями в паспортных данных.
Выводы
В ходе работы было показано, что для набора колонок В рабочий диапазон молекулярных масс составляет от нескольких сотен до нескольких миллионов. Подобранные колонки обеспечивают линейную калибровочную зависимость в рабочем диапазоне молекулярных масс.
Так же была показана справедливость олигомерной универсальной калибровочной зависимости для олигопиперилена. Было показано, что с использованием данной калибровочной зависимости можно получить абсолютные значения параметров ММР олигопиперилена.
Литература
1. Б. Г. Беленький, Л. З. Виленьчик Гелевая хроматография полимеров //, В сб. Гель-проникающая хроматография, Черноголовка, 1974, с. 5 – 34.
2. Б. Г. Беленький, П. П. Нефедов Калибровочная процедура в ГПХ полимеров //, В сб. Гель-проникающая хроматография, Черноголовка, 1974, с. 48 – 60.
3. А. И. Кузаев, С. Д. Колесникова, А. А. Брикенштейн Гель-проникающая хроматография олигомеров этилена // Высокомолекулярные соединения, 1999 г. том XVII (A), № 5, с. 1358 – 1365.
4. G. D. Edwards, Q. Y. Ng / Pesins Technical Center, Union laboratories, shell, Chemical Company, Union Newjersey 07083 / .J Polymer Sei., l, 21, 105 – 107, 1968
5. А. И. Кузаев Определение абсолютных значений молекулярных масс олигомеров стирола и окси этилена методом гель-проникающей хроматографии // Высокомолекулярные соединения, 1980г. том XXII (A), , стр. 1146 – 1151
6. Н. Г. Таганов Учет приборного уширения в гель-проникающей хроматографии // В сб. Гель-проникающая хроматография, Черноголовка, 1974, с. 106 – 122.
7. А. А. Аскадский, Ю. И. Матвеев Химическое строение и физические свойства полимеров. – М.,: Химия, 1983. 248 с.