Молекулярные механизмы программируемой клеточной гибели

Содержание Морфологические признаки апоптоза. Основные отличия от некроза 3 Молекулярные механизмы апоптоза 5 Каспазы 5 Bcl-2-зависимый путь апоптоза 9 Fas-опосредованный путь апоптоза 14 Апоптоз, включаемый гранзимом В цитотоксических Т-лимфоцитов 18 Интеграция митохондриального и Fas-опосредованного путей апоптоза 18 Биологическая роль апоптоза 20 Апоптоз и патологии 22 Список литературы 24 Морфологические признаки апоптоза. Основные отличия от некроза

У многоклеточных организмов генетически заложена программа гибели клеток (апоптоза). Со времени введения термина «апоптоз» J. Kerr [4] в 1972 году интерес к процессу физиологической гибели клеток неуклонно растет, что связано с нарушениями его регуляции в ряде патологических состояний, в том числе при аутоиммунных и онкологических заболеваниях [9]. Гибель клеток может осуществляться в активной и пассивной форме путем апоптоза и некроза [14]. Форма клеточной гибели – по пути апоптоза или некроза – во многом определяется внутриклеточной

концентрацией NAD+ и АТР. Снижение уровня NAD+ и АТР ведет к индукции некроза [12]. Некроз – непрограммируемая, патологическая форма клеточной смерти, характеризуется разрывом цитоплазматической и внутриклеточных мембран. Это приводит к разрушению органелл, высвобождению лизосомальных ферментов и выходу цитоплазмы в межклеточное пространство. Начинается воспалительный процесс, исходом которого может быть как выздоровление, так и гибель организма.

Признаки воспаления сформулировал еще Цельс (25 г. до н.э. – 45 г. н.э.) – это “rubor, tumor, calor et dolor” (покраснение, опухание, жар и боль). Наличие или отсутствие воспаления у животных и человека используется как признак, позволяющий отличить апоптоз от некроза. При электронно-микроскопическом исследовании в развитии апоптоза выделяют четыре последовательные стадии. Для первой характерна агрегация ядерного хроматина в виде гранулярных масс, примыкающи

х к ядерной мембране в виде полулуний. Ядрышко увеличено в размере вследствие того, что его крупные гранулы разделены светлыми промежутками. Ядерная мембрана имеет фестончатую форму, ее целостность сохраняется до начала формирования апоптозных телец [12]. Затем ядро разделяется на фрагменты, в которых хроматин либо занимает всю поверхность, либо располагается в виде полулуний на ограниченном участке ядерной мембраны. Цитоплазма конденсируется и формирует выпячивания. Теряя контакты, клетка светлым ободком отделяется от с

оседних. Конденсация цитоплазмы приводит к уплотнению органелл, которые сохраняют свою целостность на протяжении всех стадий апоптоза. Позднее в цитоплазме появляются полупрозрачные вакуоли. На второй стадии клеточная мембрана теряет тургор. Активируется транслоказа, с помощью которой фосфатидилсерин выводится в наружный слой липидного бислоя плазмолеммы. Гликолипиды мембраны теряют остатки сиаловой кислоты [

6]. На поверхности клетки активируются специфические рецепторы, с которыми способны взаимодействовать макрофаги. В конечном итоге клетка распадается на окруженные мембраной апоптозные тельца, имеющие овоидную или неправильную форму с фрагментами ядра или без них. Третья стадия начинается с фагоцитоза апоптозных телец макрофагами. В их переваривании участвуют лизосомы фагоцитов. На четвертой стадии процесс переваривания фагоцитированного материала завершается. Апоптозные тельца, не захваченные макрофагами, подвергаю

тся аутолизу. Хотя морфологические изменения при апоптозе однотипны, независимо от того, происходит ли он у насекомых или позвоночных, в клетках разных тканей можно выделить некоторые особенности процесса. Например, в сократительных клетках миофибриллярный аппарат тормозит фрагментацию, характерную для апоптоза. Обилие тонофиламентов в кератиноцитах обусловливает ригидность их цитоплазмы и ограничивает раннее изменение формы. В некоторых эпителиоцитах апоптоз заканчивается одним или двумя крупными апоптозными тельцами. Для апоптоза

тимоцитов не вполне характерна ограниченная фрагментация ядра и цитоплазмы. Основные проявления апоптоза происходят в ядре клетки на биохимическом уровне и начинаются с фрагментации ДНК. Сначала образуются крупные фрагменты ДНК, содержащие 700, 200-250, 50-70, позднее – 30-50 тыс. пар оснований. Одновременно регистрируются конденсация хроматина и выпячивания ядерной мембраны. Затем происходит межнуклеосомная деградация ДНК – ее расщепление в

результате формирования разрывов между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-190 пар оснований. Первоначально считалось, что такая деградация служит ключевым событием и условием реализации апоптоза. В последующем выяснилось, что некоторые ингибиторы топоизомеразы II, индуцируя апоптоз, вызывают формирование крупных фрагментов ДНК без ее межнуклеосомных нарушений [10]. Молекулярные механизмы апоптоза Апоптоз – многоэтапный процесс. Начальный этап – прием сигнала, предвестника гибели в виде

информации, поступающей в клетку извне или возникающей в недрах самой клетки. К эффекторам апоптоза относят свободные кислородные радикалы, эндонуклеазы, цистеиновые и сериновые протеазы, семейство TNF, нейротрансмиттеры (глутамат, допамин, N-метил-d-аспартат), онкогены (myc, rel) и гормоны [10]. Сигнал воспринимается рецептором, подвергается анализу и далее передается молекулам-посредникам. В конечном итоге происходит активация особых ферментов, называемых каспазами. Наряду с апоптозными имеются

каспазы, которые активируют цитокины, участвующие в воспалительных процессах. Каспазы Каспазы относятся к семейству эволюционно консервативных протеаз – ферментов, катализирующих ограниченное расщепление клеточных белков. Известны 14 членов семейства, в активном центре каждого фермента расположен остаток цистеина. Все они являются аспазами: специфически узнают определенные тетрапептидные звенья белков и расщепляют пептидную связь по карбоксильному концу остатка аспарагиновой

кислоты. В клетке каспазы синтезируются в форме латентных предшественников – проферментов, называемых прокаспазами (рис.1). Рис.1. Активация прокаспаз путем протеолитического расщепления на субъединицы и их последующей ассоциации: I – продомен, II – промежуточный домен, предшественник большой субъединицы, III – C-концевой домен, предшественник малой субъединицы каспаз [12]. По особенностям действия различают инициирующие и эффекторные каспазы или соответственно каспазы первого и второго эшелонов. Актив

ация инициирующих прокаспаз происходит при участии специальных белков-адаптеров. На этапе активации каспаз первого эшелона жизнь клетки еще можно сохранить. Существуют регуляторы, которые блокируют или, напротив, усиливают разрушительное действие каспаз первого эшелона. К ним относятся белки Bcl-2 (ингибиторы апоптоза: A1, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-XL, Brag-1, Mcl-1 и NR13) и Bax (промоторы апоптоза: Bad, Bak, Bax, Bcl-XS, Bid, Bik, Bim, Hrk, Mtd). Эти белки эволюционно консервативны: гомолог

Bcl-2 обнаружен даже у губок Geodia cydomium и Suberites domuncula, у которых апоптоз необходим для морфогенеза. Субстраты каспаз первого эшелона (к ним относятся каспазы-2, -8, -9, -10 и -12) – латентные формы каспаз второго эшелона – прокаспазы-3, -6, и -7[12]. По субстратной специфичности каспазы делят на 3 семейства: 1 группа (1, 4, 5 каспазы) – предпочитают действовать на тетрапептид включающий триптофан, играют основную роль в

воспалении; 2 группа (2, 3, 7 каспазы) – узнают тетрапептид, в котором на первом месте расположен аспарагин; 3 группа (6, 8, 9, 10) – узнают тетрапептид, начинающийся с гидрофобной аминокислоты (лейцина, изолейцина, валина) [1] Свыше 60 различных белков являются субстратами эффекторных каспаз. По функциональной принадлежности они разделяются на несколько групп: • подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, ответственной за фрагментацию ДНК. В нормальных клетках апоптозная ДНКаза CAD (caspase-activated DNase

– ДНКаза, активируемая каспазой) образует неактивный комплекс с ингибитором CAD, обозначаемым ICAD или DFF (DNA fragmentation factor – фактор фрагментации ДНК). При апоптозе ингибитор ICAD с участием каспаз-3 или -7 инактивируется и свободная CAD, вызывая межнуклеосомальные разрывы хроматина, ведет к образованию фрагментов ДНК с молекулярной массой, кратной молекулярной массе ДНК в нуклеосомных частицах, – 180–200 пар нуклеотидов. Эти фрагменты

при электрофоретическом разделении в агарозном геле дают характерную лесенку ДНК. Апоптоз возможен и без фрагментации ДНК; • происходят инактивация и нарушение регуляции белков, участвующих в репарации ДНК, сплайсинге мРНК, репликации ДНК. Мишенью каспаз является поли(АДФ-рибозо)полимераза (ПАРП). Этот фермент участвует в репарации ДНК, катализируя поли-АДФ-рибозилирование гистонов и других

белков, связанных с ДНК. Донором АДФ-рибозы является NAD +. Активность ПАРП возрастает в 500 раз и более при связывании с участками разрыва ДНК. Апоптозная гибель клетки сопровождается расщеплением ПАРП каспазами. Чрезмерная активация ПАРП при массированных разрывах ДНК, сильно снижая содержание внутриклеточного NAD+, ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту не

кроза; • разрушаются белки цитоскелета: ламины (структурные белки, выстилающие изнутри поверхность внутренней ядерной мембраны), актин, фодрин, кератины, а также фермент гельдолин, катализирующий деполимеризацию актина; • модифицируются белки – регуляторы клеточного деления. Активируются циклинзависимые киназы, разрушаются белки (p21 и p27), подавляющие активность этих киназ; • разрушаются антиапоптозные белки семейства Bcl-2, проапоптозный белок Bid, белки

IAP; • модифицируются белки, участвующие в межклеточной сигнализации, ядерные факторы траскрипции. Наибольшей активностью в расщеплении этих белков обладает каспаза-3: считают, что после ее активации клетка необратимо теряет пути к выживанию. Структурно прокаспаза (молекулярная масса до 50 кДа) состоит из трех звеньев: N-концевого звена (продомена), промежуточного домена, предшественника большой субъединицы (20 кДа) и С-концевого домена, предшественника малой субъединицы (10 кДа) зрело

го фермента. Продомены инициирующих (а также воспалительных) прокаспаз содержат свыше 100 аминокислотных остатков. Они выполняют важную функцию в активации фермента: осуществляют взаимодействие прокаспаз с белками-адаптерами. В этих белок-белковых взаимодействиях участвуют специализированные участки продоменов, у разных прокаспаз это DED (death effector domain – домен эффектора смерти), CARD (caspase recruitment dоmain –домен рекрутирования каспазы), DD (death domain – домен смерти) [1

3]. Все они имеют сходную структуру, содержат по шесть α-спиральных участков. Прокаспазы обладают незначительной протеолитической активностью, составляющей 1–2% активности зрелой каспазы [8]. Будучи в мономерной форме, прокаспазы, концентрация которых в клетке ничтожна, находятся в латентном состоянии. Предполагается, что пространственное сближение молекул прокaспаз при их агрегации ведет к образованию активных каспаз через механизм протеолитического само- и перекре

стного расщепления (ауто- или транс-процессинга). Так, у прокаспазы-9 это CARD, а у прокаспазы-8 два последовательно соединенных DED. Такие же домены имеются у адаптерных молекул, что позволяет реализовать междоменное, так называемое гомофильное взаимодействие между прокаспазой и адаптером – CARD–CARD, DED–DED. Продомены эффекторных прокаспаз короче, чем у инициирующих прокаспаз, содержат менее 30 ами

нокислотных остатков и выполняют функцию ингибитора активации прокаспаз. Выявлены белки (их обозначают IAP), которые, блокируя отщепление продомена эффекторных прокаспаз и тем самым подавляя их активацию, предотвращают апоптоз. Активация каспазы заключается в протеолитическом удалении продомена, разрыве связи между большой и малой субъединицами и последующей сборке из них гетеродимера. Два гетеродимера, связываясь друг с другом через малые субъединицы, образуют тетрамер – активную форму

каспазы, обладающую двумя идентичными каталитическими центрами [5]. Существует несколько путей развития эффекторной фазы апоптоза, принципиальное отличие которых заключается в механизме инициации и трансдукции проапоптического сигнала. В настоящее время описано три генеральных пути апоптоза: митохондриальный (Bcl-2-зависимый) путь, гранзим В- связанный путь, и опосредованный через «рецепторы смерти» [11]. Bcl-2-зависимый путь апоптоза

В клетках, подвергшихся воздействию индуктора апоптоза, резко снижается мембранный потенциал (Dy)митохондрий. Падение Dy обусловлено увеличением проницаемости внутренней мембраны митохондрий (permeability transition) вследствие образования гигантских пор. Разнообразны факторы, вызывающие раскрытие пор. К ним относятся истощение клеток восстановленным глутатионом, NAD(P)H, ATP и ADP, образование активных форм кислорода, разобщение окислительного фосфорилирования протонофорными соединениями, увеличение содержания

Ca2+ в цитоплазме [7]. Образование пор в митохондриях можно вызвать церамидом, NO, каспазами, амфипатическими пептидами, жирными кислотами. Поры имеют диаметр 2,9 нм, позволяющий пересекать мембрану веществам с молекулярной массой 1,5 кДа и ниже. Следствием раскрытия поры является набухание митохондриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и высвобождение растворимых белков межмембранного объема. Среди этих белков – ряд апоптогенных факторов: цитохром с, прокаспазы 2, 3 и 9, белок A

IF (apoptosis inducing factor), представляющий собой флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа. Прокаспаза-3 обнаруживается как в межмембранном объеме митохондрий, так и в цитоплазме. Образование гигантских пор не является единственным механизмом выхода межмембранных белков митохондрий в цитоплазму. Предполагается, что разрыв наружной мембраны митохондрий может быть вызван гиперполяризацией внутренней мембраны (ср. с гипополяризацией при раскрытии гигантских пор).

Возможен и альтернативный механизм, без разрыва мембраны, – раскрытие гигантского белкового канала в самой наружной мембране, способного пропускать цитохром с и другие белки из межмембранного пространства. Высвобождаемый из митохондрий цитохром с вместе с цитоплазматическим фактором APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) участвует в активации каспазы-9. APAF-1 – белок с молекулярной массой 130 кДа, содержащий CA

RD-домен (caspase activation and recruitment domain) на N-конце и 12 повторяющихся аминокислотных WD-40-последовательностей (WD – дипептид из триптофана и аспартата) на С-конце, образует комплекс с прокаспазой-9 в присутствии цитохрома с и dATP или АТР (концентрация dATP в клетке в 1000 раз ниже концентрации АТР). К наиболее охарактеризованным WD-белкам относится b -cубъединица

G-белков. Из этих субъединиц собираются жесткие, симметричные структуры, наподобие веера или пропеллера. WD-Повторы свойственны белкам, участвующим в регуляции деления и дифференцировки эукариотных клеток, транскрипции генов, модификации мРНК, трансмембранной передачи сигналов, слияния мембранных везикул. Среди прокариот WD-белки обнаружены у цианобактерий. APAF-1 играет роль арматуры, на которой происходит аутокаталитический процессинг каспазы-9. Предполагается, что в результате зависимого от гидролиза dATP (

или АТР) конформационного изменения APAF-1 приобретает способность связывать цитохром с. Связав цитохром с, APAF-1 претерпевает дальнейшее конформационное изменение, способствующее его олигомеризации и открывающее доступ CARD-домена APAF-1 для прокаспазы-9, которая тоже содержит CARD-домен. Так образуется конструкция, называемая тоже апоптосомой (рис.2), с молекулярной массой > 1,3 млн дальтон, в составе которой – не менее 8 субъединиц APA

F-1. Благодаря гомофильному CARD-CARD-взаимодействию с APAF-1 в эквимолярном соотношении связывается прокаспаза-9, а затем прокаспаза-9 связывает прокаспазу-3. Пространственное сближение молекул прокаспазы-9 на мультимерной арматуре из APAF-1-цитохром-с-комплексов, по-видимому, приводит к межмолекулярному протеолитическому процессингу прокаспазы-9 с образованием активной каспазы-9.

Сходный механизм предложен для активации прокаспазы CED-3 у червя Caenorhabditis elegans–аналога прокаспазы-9 млекопитающих. Альтернативный вариант – прокаспаза-9, связавшись с апоптосомой, может принять конформацию, которая приводит к внутримолекулярному процессингу (самоактивации). Зрелая каспаза-9 затем расщепляет и активирует прокаспазу-3. Мутантный APAF-1, лишенный WD-40-повторов, активирует прокаспазу-9, но не способен к рекрутированию и активации прокаспазы-3. Ф

лавопротеин AIF, будучи добавленным к изолированным ядрам из клеток HeLa, вызывает конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК, а при добавлении к изолированным митохондриям печени крыс – высвобождение цитохрома с и каспазы-9. Микроинъекция AIF в интактные фибробласты крыс приводит к конденсации хроматина по переферии ядра, разрыву ДНК на крупные фрагменты длиной 50 т.п.н. и больше, диссипации Dy в митохондриях и переходу фосфатидилсерина из внутреннего слоя цитоплазматической мембраны в наружный.

Ни один из этих эффектов AIF не предотвращается пептидным ингибитором каспаз N-бензоилоксикарбонил-Val-Ala-Asp-трифто рметилкетоном (Z-VAD.fmk), который предотвращает апоптоз, индуцированный микроинъецированным цитохромом с. Эти данные показывают, что AIF является митохондриальным эффектором ПКС у животных, действующим независимо от каспаз. Рис.2. Структура апоптосомы – гептамерный комплекс моле

кул АPAF-1 и цитохрома с [5]. Кроме рассмотренных компонентов, при нарушении наружной мембраны митохондрий из межмембранного объема выделяется термолабильный фактор, вызывающий необратимое превращение ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу. Фактор устойчив к ряду испытанных ингибиторов протеаз, включая каспазы, сериновые и металлопротеазы. Ксантиндегидрогеназа катализирует зависимое от NAD+ окисление ксантина до гипоксантина и последующее окисление гипоксантина до мочевой кислоты.

Ксантиноксидаза катализирует те же реакции, но не с NAD+, а с О2 в качестве акцептора электронов. При этом образуются О2 Н2О2, а из них – и другие активные формы кислорода (АФК), которые разрушают митохондрии и являются мощными индукторами апоптоза. Механизмы образования АФК, конечно, не ограничиваются ксантиноксидазной реакцией. Главным источником А

ФК в клетках являются митохондрии. Резкое увеличение АФК происходит при возрастании мембранного потенциала в митохондриях, когда снижено потребление ATP и скорость дыхания лимитируется ADP. Доля электронного потока через дыхательную цепь митохондрий, идущая на образование О 2 достигает 1-5 %. Цитоплазматическая мембрана макрофагов и нейтрофилов, как уже отмечалось, содержит О2- – генерирующую NADPH-оксидазу. В зависимости от пути, по которому осуществляется активация ка

спаз, различают разные типы клеток. Клетки типа I (в частности, линия лимфобластоидных В-клеток SKW и T-клетки линии Н9) подвергаются ПКС по пути, зависимому от апоптозных рецепторов плазматической мембраны без участия митохондриальных белков. Клетки типа II (например, линии Т-клеток Jurkat и СЕМ) погибают по пути апоптоза, зависимому от митохондриального цитохрома с. ПКС, вызванная химиотерапевтическими соединениями,

УФ- или γ-облучением, по-видимому, напрямую связана с апоптозной функцией митохондрий: клетки, лишенные генов белка APAF-1 или каспазы-9, устойчивы к химио- и радиационной обработке, но погибают при индукции Fas-рецептора. Некоторые клетки, например, клетки эмбриональной нервной системы, включают механизмы апоптоза, если они испытывают дефицит апоптозподавляющих сигналов (называемых также факторами выживания) от других клеток. Физиологический смысл процесса – в элиминации избыточных нервных клеток, конкурирующих за о

граниченный фонд факторов выживания. Эпителиальные клетки при отделении от внеклеточного матрикса, вырабатывающего факторы выживания, тоже обречены на ПКС. Факторы выживания связываются соответствующими цитоплазматическими рецепторами, активируя синтез подавляющих апоптоз агентов и блокируя стимуляторы апоптоза. Некоторые вещества (например, стероидные гормоны) оказывают дифференцированный эффект на различные типы клеток – предотвращают апоптоз одних типов клет

ок и индуцируют его у других [13]. Существует еще несколько механизмов, приводящих к апоптозу через ингибирование Bcl-2. Например, возможна регуляция через онкосупрессор - белок p53, замедляющий в нормальных клетках пролиферативную активность. При повреждении ДНК под действием ионизирующего или ультрафиолетового излучения, ингибиторов топоизомеразы II, а также при некоторых других воздействиях, происходит активация экспрессии гена р53. Белок p

53 задерживает клетку в фазе G1/S клеточного цикла (через репрессию генов, регулирующих транскрипцию), чтобы дать время для работы репаративных систем. На уровне транскрипции фактор р53 регулирует экспрессию генов, участвующих в блокаде клеточного цикла - р21 (ингибитор большинства циклин-зависимых киназ), а также взаимодействует либо с комплексами, определяющими синтез и репарацию ДНК, либо с белками, модулирующими апоптоз (например, Вах).

Если повреждения ликвидировать не удается, то p53 запускает апоптоз. Происходит это через инактивирование Bcl-2 при связывании с белком Bax. Известно, что некоторые стимулы, такие как гипоксия или митогенные онкогены, активируют ген p53, переводя клетку на апоптический путь [3]. Fas-опосредованный путь апоптоза Инициаторная фаза апоптоза может осуществляться опосредовано через «рецепторы смерти». Хорошо изучен механизм Fas-опосредованного апоптоза C

D95-позитивных клеток. Для его развития необходимо взаимодействие Fas-рецептора, презентированного на мембране Fas-позитивных клеток, и Fas-лиганда. Взаимодействие важно для таких типов физиологической регуляции как уничтожение зрелых Т-клеток на завершающих стадиях иммунного ответа, киллинг опухолевых или инфицированных вирусом клеток цитотоксическими T-лимфоцитами и NK-клетками. Принципиальное отличие Fas-опосредуемого пути апоптоза от митохондриального заключается в

том, что он обходит регулирование со стороны белков Bcl-2 и является Ca2+- независимым. CD95 экспрессируется на поверхности клеток многих типов: на тимоцитах, лимфобластоидных клеточных линиях, активированных Т- и В-лимфоцитах, а также на фибробластах, гепатоцитах, кератиноцитах, миелоидных клетках и клетках нервной системы (нейронах, астроцитах и олигодендроцитах). Белок CD95 принадлежит к семейству рецепторов фактора некроза опухолей (ФНО) и содерж

ит 3 повтора аминокислотной последовательности, богатых цистеином. Его зрелая мембранная форма - гомотримерный гликопротеин из 320-335 аминокислотных остатков (молекулярная масса 42-52 кДа). Ген Fas у человека (название гена - APT) локализован в длинном плече десятой хромосомы (10q23) и состоит из 9 экзонов. Человеческий Fas относится к мембранным белкам I типа. В его структуре можно выделить следующие регионы: экстрацеллюлярный, состоящий примерно из 160 аминоки

слотных остатков, закодированных в первых пяти экзонах гена Fas, трансмембранный, закодированный в 6 экзоне, и интрацеллюлярный, соответствующий 7-9 экзонам. Выявлено, что периферические клетки крови и некоторые опухолевые клеточные линии, кроме полноразмерной Fas-мРНК, имеют варианты РНК, полученные в результате альтернативного сплайсинга. Они кодируют растворимый Fas-антиген (sFas). Мономерные формы sFas блокируют центры связывания на Fas-лиганде, делая их недоступными для мембранного

CD95 антигена - апоптоз не инициируется. Апоптозу препятствует и формирование мембранных Fas-олигомеров с участием растворимого CD95-мономера. Мутации гена Fas приводят к экспрессии неактивных продуктов. Врожденные или приобретенные дефекты гена Fas ассоциированы с лимфопролиферативными и аутоиммунными заболеваниями. Подобная стратегия защиты от апоптоза реализуется и в опухолевых клетках. Соматические мутации гена, кодирующего CD95, впервые были описаны на примере лимфом. В настоящее врем

я известно, что подобные явления наблюдаются во многих линиях опухолевых клеток как лимфоидного, так и нелимфоидного ряда, причем частота мутаций гена достигает 4-28%. Все это, несомненно, препятствует апоптозу. Fas-лиганд (FasL) относится к семейству фактора некроза опухолей и является мембранным белком второго типа. Ген лиганда расположен в первой хромосоме человека. FasL экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах и NK-клетках, а также на клетках Сертоли и паренхимных клетках передней камеры глаза, что позв

оляет этим клеткам убивать любую Fas-экспрессирующую клетку, в том числе и активированный Т-лимфоцит. Белок существует в двух формах: нерастворимой (мембраносвязанной) и растворимой, отщепляемой от клетки с помощью металлопротеиназы. Растворимая форма человеческого FasL сохраняет свою активность. Подобно другим лигандам рецепторов семейства ФНО, FasL - гомотример, причем справедливо это не только для мембранной, но и для растворимой формы.

Примерно 70-80 аминокислотных остатков цитоплазматического участка молекулы CD95 образуют домен смерти (DD - death domain). После того, как триммер Fas-лиганда взаимодействует с тримером Fas, последний изменяет свою конформацию так, что DD-домен оказывается способным связываться с соответствующим доменом белка-адаптера FADD/Mort-1. Различные формы белка FADD в своем составе содержaт два ключевых домена: эффекторный домен сме

рти DED на N-конце и, связывающийся с молекулой CD95, DD на C-конце. Адаптер FADD ассоциата способен взаимодействовать с неактивной прокаспазой-8 (FLICE). Связывание происходит через DED-домены обеих молекул. Комплекс, в состав которого входит CD95, FADD и прокаспаза-8, образуется в течение нескольких секунд и носит название DISC (сигнальный комплекс, индуцирующий смерть) (рис.3). В составе

DISC прокаспаза-8 самоактивируется, и в цитоплазму выходят продукты активации - субъединицы p10 и p18-20, которые впоследствии формируют тетрамер. Активные субъединицы каспазы-8 активируют каспазу-3. Наступает эффекторная фаза Fas-опосредуемого апоптоза. В течение ее происходит активация протеолитической системы клетки, которую и формируют цистеиновые протеиназы. Рис.3. Сигнальный комплекс, индуцирующий смерть (DISC), который содержит

CD95, FADD и прокаспазу-8 или -10 [5]. Помимо FADD, сродством к DD-домену CD95обладают и другие цитоплазматические белки. Например, адаптерный фактор Daxx способен связываться с мембранной формой Fas-протеина и инициировать осуществление FADD-независимого SAPK/JNK/p38-пути (системы стресс-активируемых протеинкиназ), в котором активируются факторы транскрипции c-Jun.

Белки c-Jun взаимодействуют с энхансерами различных проапоптических факторов, например, Fas, Fas-лиганда и т.п. К ассоциации с интрацеллюлярным С-фрагментом молекулы CD95 способна тирозиновая фосфатаза FAP-1. FAP-1 отрезает 15 аминокислотных остатков от DD-домена и тем самым исключает возможность формирования DISC. В результате апоптотические процессы не развиваются. Высокие внутриклеточные концентрации этой фосфатазы создаются в

CD95-резистентных опухолевых клетках [11]. Апоптоз, включаемый гранзимом В цитотоксических Т-лимфоцитов Цитотоксические Т-лимфоциты могут вызвать апоптоз инфицированной клетки-мишени не только через механизм, зависимый от Fas-рецептора. Существует второй механизм – с помощью белка перфорина, впрыскиваемого Т-киллером в зону контакта с клеткой-мишенью. Полимеризуясь, перфорин образует в плазматической мембране клетки-мишени трансмембранные каналы, по которым внутрь клетки поступают гранзимы (фрагментины) – смесь

протеолитических ферментов, выделенных Т-киллером. Существенным компонентом этой смеси является гранзим В – специфичная к остатку аспарагиновой кислоты сериновая протеаза (в активном центре - серин), превращающая прокаспазу-3 в каспазу-3. Причем в превращении прокаспазы-3 в каспазу-3 гранзим B обладает большей активностью, чем инициирующие каспазы-8 и -10 (соответственно в 2 и 7 раз) [2]. Интеграция митохондриального и Fas-опосредованного путей апоптоза

Выше отмечалось, что Fas/FasL-система обособлена от Bcl-2-системы, причем в реализацию этих путей вовлечено огромное количество белков (табл.1). Однако в Fas-позитивных клетках нередко наблюдается интеграция этих двух систем. В этом случае говорят о клетках II типа, характеризующихся тем, что концентрация прокаспазы-8 в цитозоле мала и, в связи с этим, чрезвычайно низка интенсивность активации каспазы-3. Кроме того, д

ействие этих ферментов лимитируется гиперэкспрессией Bcl-2. В клетках второго типа наиболее выражено действие каспазы-8 через белок Bid, что ведет к развитию митохондриального пути апоптоза. Протеиназа отрезает дезактивирующий фрагмент Bid, превращая белок в активный tBid (truncated Bid -усеченный). В свою очередь, tBid связывает Bcl-2, ликвидируя апоптоз-ингибирующее действие последнего. В клетках

первого типа индукция апоптоза сопряжена с активацией большого количества молекул каспазы-8 из комплекса DISC. Это означает, что с большой скоростью будет активировано большое количество каспазы-3, -все успевает произойти до падения митохондриального трансмембранного потенциала. Таким образом, здесь апоптоз идет без участия митохондриальных субстратов. Стоит отметить, что в клетках обоих типов наблюдается митохондриальная апоптогенная активность, но эта активность блокируется гиперэк

спрессией Bcl-2. Лишь в клетках второго типа гиперэкспрессия Bcl-2 компенсируется инактивирующим связыванием с Bid [11]. Табл.1. Белки, участвующие в реализации Bcl-2 и Fas-опосредованного путей [5] Биологическая роль апоптоза Можно выделить три основные физиологические функции апоптоза: 1)обеспечение программы индивидуального развития организма (онтогенеза) и дифференцировки клеток, 2) поддержание тканевого гомеостаза, 3) защита от патогенов и поврежденных собственных клето

к. В онтогенезе высших позвоночных животных апоптоз проявляется в процессе их эмбрионального развития. Некоторые примеры: образование первичной полости в бластуле, гибель избыточных, невостребованных клеток при развитии периферической нервной системы, разделение пальцев в результате отмирания межпальцевых перепонок, апоптоз при формировании пищеварительной системы, сердца, печени и других органов. У низших позвоночных – отмирание хвоста у головастика в процессе его превращения в лягушку, у беспозвон

очных – метаморфоз насекомых. Пример клеточной дифференцировки с участием элементов программируемой клеточной гибели – биогенез эритроцитов, клеток эпителия глазного хрусталика, кератиноцитов кожного эпидермиса. В различных тканях существуют определенные нормы по количеству клеток. Если количество клеток будет выше или ниже нормы, это означает нарушение тканевого гомеостаза. Апоптоз функционирует как механизм, контролирующий количество и качество клеток, поддерживая тканевой гомеостаз в организме. Элимини

руются ненормальные, функционально неактивные клетки, в том числе клетки, функции которых нарушены под влиянием факторов абиотической природы (активные формы кислорода, антиметаболиты, УФ-облучение). Через апоптоз исчезают и функционально активные клетки: T- и B-лимфоциты, активировавшиеся и размножившиеся в ответ на внедрение патогена, погибают по окончании инфекционного процесса. Элиминируются клетки, представляющие потенциальную угрозу для организма: если нарушена

ДНК, включается программа смерти с помощью различных механизмов, один из которых зависит от особого белка клетки – белка p53. Программируемая клеточная смерть, зависимая от p53, служит как противоопухолевый механизм, не дает также размножаться клеткам с дефективной ДНК, предотвращая появление клеток-мутантов. Клетки ткани, вышедшие из сферы межклеточного взаимодействия, потерявшие контакт с другими клетками ткани и одиноко блуждающие по организму, тоже подвергаются а

поптозу. Вирусы, некоторые бактерии, грибы и простейшие являются внутриклеточными паразитами. Хотя специфичные к ним антитела вырабатываются организмом человека или животного, они не могут настигнуть вредителя, затаившегося в цитоплазме, под покровом клеточной оболочки жертвы. И тогда в ход вступают цитотоксические T-лимфоциты. Они убивают клетки, ставшие жертвами инфекционного возбудителя, и тем самым прекращают его дальнейшее размножение. Обладая аппаратом распознавания зараженной клетки среди массы здоровых кле

ток, T-киллер вызывает ее гибель, включая программу самоубийства клетки-мишени. Натуральные киллеры через механизм апоптоза способны обезвредить опухолевые клетки [12]. Апоптоз и патологии Отклонения ПКС от нормы – в сторону усиления или подавления – приводят к тяжелым заболеваниям (рис.4), часто с летальным исходом. Нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона), ишемические повреждения (инсульт, инфаркт миокарда, послеоперационные реперфузионные осложнения, возникающ

ие при остановке и последующем восстановлении кровотока в различных органах), некоторые болезни крови, цирроз печени, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), вызываемые патогенной бактерией Heliсobacter pylori гастрит и язва желудка – это заболевания, обусловленные усилением апоптоза. Известны низкомолекулярные пептиды, которые эффективны как ингибиторы каспаз и перспективны как лекарственные соединения в терапии рассмотренных болезней. Рак, некоторые аутоим

мунные заболевания (красная волчанка) и вирусные инфекции (герпесные, аденовирусные), бронхиальная астма, шизофрения вызваны подавлением апоптоза. Некоторые вирусы содержат гены ингибиторов каспаз или гомологов апоптозного белка Bcl-2. Эти вирусы предотвращают апоптоз зараженной клетки: создаются условия для длительного поддержания инфекционного возбудителя в организме (персистенции). Подавлением апоптоза инфицированной клетки объясняется появление лекарственно устойчивых форм возбудителя туберкулеза [12]. Рис.4

Заболевания, вызванные нарушениями в регуляции апоптоза [5] Программируемая клеточная гибель – механизм, широко распространенный в различных царствах живого, включая прокариот. Эволюционно апоптоз возник у прокариот как механизм противовирусной защиты популяций и был закреплен у одноклеточных эукариот. В дальнейшем, с появлением многоклеточных организмов, механизм совершенствовался и был приспособлен, наряду с защитой от патогенов, для реализации важных жизненных функций – диф

ференцировки клеток и тканей при эмбриогенезе и постэмбриональном развитии, элиминирования клеток иммунной системы, невостребованных, состарившихся клеток либо клеток, подвергшихся воздействию мутагенных факторов. Апоптоз у животных и человека стал неотъемлемым инструментом для осуществления наследственного и приобретенного, гуморального и клеточного ответа иммунной системы. Исследования в области апоптоза открывают новые перспективы в клеточной биологии и иммунологии. Список литературы 1.

Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis // Biochem J 1997 № 326 р.1–16 2. Elmore S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death // Toxicol Pathol 2007 - №35(4) р.495–516. 3. Haupt Susan, Berger Michael, Zehavit Goldberg and Ygal Haupt. Apoptosis – the p53 network // Journal of Cell Science. -

2003 №116 р.4077-4085 4. Kerr J.F Wyllie A.H Curie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Br. J. Cancer 1972 V. 26 p. 239-257 5. Rajesh P. Rastogi, Richa and Rajeshwar P. Sinha. Apoptosis: molecular mechanisms and pathogenicity //EXCLI Journal 2009 №8 р.155-181 6. Robert A. Schwartzman and John A. Cidlowski. Apoptosis: The Biochem

istry and Molecular Biology of Programmed Cell Death // Endocrine Reviews 1993 V. 14, No.2 p.133-151 7. Santella L and Carafoli E. Calcium signaling in the cell nucleus // FASEB J 1997 №11 р.1091-1109 8. Wolf B.B Green D.R. Suicidal tendencies: apoptotic cell death by caspase family proteinases // J. Biol. Chem 1999 V. 274, № 29 р. 20049-20052. 9. Варга О. Ю Рябков В. А. Апоптоз: понятие, механизмы реализации, значение// Экология че

ловека 2006 №7 c.28-32 10. Матвеева Н.Ю. Апоптоз: морфологические особенности и молекулярные механизмы // Pacific Medical Journal 2003 № 4 p. 12-16 11. Рыжов С. В Новиков В. В. Молекулярные механизмы апоптотических процессов // Российский биотерапевтический журнал 2006 T.1, №3 с. 27-33 12. Самуилов В. Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соросовский образовательный журнал 2001 T. 7, №10 с.18-25

13. Самуилов В.Д Олескин А.В Лагунова Е.М. Программируемая клеточная смерть // Биохимия 2000 Т. 65, № 8 c. 1029–1046 14. Ярилин А.А Никонова М.Ф Ярилина А.А Варфоломеева М.И Григорьева Т.Ю. Апоптоз, роль в патологии и значимость его оценки при клинико-иммунологическом обследовании больных // Медицинская иммунология 2000 Т.2, № 1 с 7-16