--PAGE_BREAK--РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Дослідження месенджерних систем, що опосередковують сигнали актг в адренокортикальних клітинах. Регуляція кортикотропіном адренокортикальної функції забезпечується здебільшого за рахунок прямого фосфорилювання cAMP-залежною ПКА специфічних білків, а також стероїдогенних факторів, що беруть участь в реакціях стероїдогенезу, змінюючи його швидкість. Не викликає сумнівів, що cAMP/ПКА-залежна месенджерна система не є єдиною системою опосередкування дії АКТГ в клітині. Гормон здатний активувати різні протеїнкінази, проте інші сигнальні каскади, залучені до перенесення сигналів АКТГ, досліджені значно менше, ніж cAMP/ПКА-залежний. Особливу увагу дослідників в цьому аспекті привернула протеїнкіназа С. Відомо, що деякі протеїни можуть одночасно бути субстратами для кількох кіназ, що є важливим загальним принципом інтеграції пострецепторних сигналів в клітині. Це істотно ускладнює розуміння механізмів опосередкування регуляторних сигналів АКТГ та можливої взаємодії між різними месенджерними системами. Потрібно також зазначити, що механізми дії АКТГ досліджувались раніше здебільшого на лініях пухлинних клітин надниркових залоз, спробу оцінки дії гормону на умовно нормальних тканинах надниркових залоз людини ми провели вперше.
Участь цAMФ-залежної ПКА та серин/треонінової протеїнкінази С в реалізації ефектів АКТГ.
На початку досліджень необхідним було з’ясування специфіки механізмів перенесення регуляторного сигналу АКТГ в корі надниркових залоз людини із залученням цAMФ-залежної ПКА та серин/треонінової ПКС. В дослідах використовували післяопераційні умовно нормальні тканини надниркових залоз хворих, прооперованих у клініці Інституту. АКТГ in vitro у концентрації 0,2 од./100 мг тканини не призводить до активації ПКА та ПКС ні в мембранній, ні в цитозольній фракціях. При збільшенні концентрації кортикотропіну до 2 од./100 мг тканини протеїнкіназна активність у мікросомній фракції зростає у 4,5 рази порівняно з контрольними пробами у випадку ПКА та у 1,4 рази у випадку ПКС.Визначення розподілу ізоформи ПКС-aв субклітинних фракціях клітин після інкубації у середовищі з різним вмістом АКТГ за допомогою імуноблот-аналізу показало, що із збільшенням концентрації кортикотропінукількість ферменту зростала в ядерній фракції (рис. 1), не змінюючись ні в мікросомній, ні в цитозольній фракціях адренокортикоцитів. Отже, суттєва роль у трансдукції сигналу кортикотропіну в адренокортикальних клітинах людини може належати не тільки мембранозв’язаній формі ПКС, але і ядерній ПКС.
Рис. 1. Вміст a-ізоформи ПКС в ядерній фракції адренокортикоцитів умовно нормальної тканини кори надниркових залоз людини при різних концентраціях АКТГ.
А -Вестерн-блот аналіз. Б -сканограма плівки. В -узагальнені результати п’яти дослідів. 1 – контроль, 2 – АКТГ 0,2 од./100 мг тканини, 3 – АКТГ 2 од./100 мг тканини.** -вірогідний вплив АКТГ, p
Субклітинний розподіл ПКС та експресія рецепторних тирозинкіназ в пухлинах надниркових залоз людини.Відомо, що у проліферативних процесах важливу роль відіграє ПКС, яка є важливою ланкою внутрішньоклітинних сигнальних механізмів, порушення яких призводить до ініціації та прогресії онкогенезу. Зміни рівня експресії ізоферментів ПКС та їхньої активності мають значний вплив на процеси проліферації та можуть бути залучені до процесів пухлинної трансформації у корі надниркових залоз. Тому доцільним було визначити загальну активність протеїнкінази С і розподіл ізоформ ПКС у субклітинних фракціях клітин адренокортикальних тканин надниркових залоз людини за умов норми і різноманітних патологічних станів. Визначення активності ПКС здійснювалось у цитозольній, мікросомній та ядерній фракціях пухлин та умовно нормальних тканин.Статистично вірогідна різниця спостерігається між активністю ПКС у мікросомній фракції клітин умовно нормальної та пухлинної тканин і не спостерігається у цитозолі та ядрах.В препаратах ядерної, цитозольної та мікросомної фракцій клітин кори надниркових залоз людини було проаналізовано експресію десяти ізоферментних форм ПКС. Найвищий рівень експресії спостерігався у випадку ПКС-α. На отриманих знімках чітко виявляються смуги білка у діапазоні молекулярної маси 80 кДа, що відповідає молекулярній масі α-ізоформи ПКС (рис. 2).
Експресії немає
ц м я ц м я
умовно аденома
нормальна
тканина
Рис. 2. Розподіл різних ізоформ протеїнкінази С в цитозольній (ц), мікросомній (м) та ядерній (я) субклітинних фракціях адренокортикоцитів в умовно нормальній і пухлинній тканинах надниркових залоз людини.
Ці дані узгоджуються з результатами інших авторів, які також визначали найвищий рівень експресії для α-ізоформи ПКС в адренокортикоцитах порівняно з досить незначним для інших ізоформ [Shigematsuetal., 1992].
Розподіл ПКС-aміж цитозольною та мікросомальною фракціями визначається походженням тканини: в умовно нормальній тканині фермент рівномірно розподіляється між фракціями, а в аденомах (група, утворена об’єднанням всіх досліджених випадків доброякісних новоутворень) ПКС-aтранслокується з цитозолю до мікросомної фракції. Найістотніша відмінність від контролю спостерігалась у випадках карцином. Для ядерної фракції не вдалося знайти певної закономірності між відносною кількістю ПКС-α та типом тканини(табл. 1).Виявлена транслокація ПКС-aрозглядається нами як активація ферменту за умов дослідженої патології. Очевидно, саме ПКС-α бере активну участь у формуванні пухлин та підтримці пухлинного росту. Можливо, надекспресія цього ферменту, тривала активація ПКС внаслідок дії канцерогенних чинників або порушення метаболізму фосфоліпідних активаторів призводить до патологічної відповіді – порушення клітинного циклу та розвитку пухлин.
Отримані дані свідчать, що пухлини кори надниркових залоз характеризуються транслокацією основної ізоформи ПКС – Са2+/фосфоліпід-залежної a-ізоформи до мікросомної фракції адренокортикоцитів і збільшенням загальної активності ПКС в мікросомній фракції пухлин. На разі можна стверджувати, що α-ізоформа ПКС в надниркових залозах може брати участь у онкогенезі і слугувати маркером малігнізації.
Таблиця 1
Розподіл a-ізоформи ПКС у цитозольній, мікросомній та ядерній фракціях клітин кори та пухлин надниркових залоз людини, %
Тип тканини
Цитозольна
фракція
Мікросомна
фракція
Ядерна
фракція
Умовно нормальна (8)
46,19 ± 2,18
41,26 ± 1,97
13,62 ± 1,21
Аденома (4)
29,35 ± 3,61
50,40 ± 2,0 *
17,40 ± 1,58
Карцинома (4)
26,09 ±8,16
73,91 ±8,16*
-
Примітка. * -вірогідна різниця між цитозольною та мікросомною фракціями, р
Крім α-ізоформи ПКС позитивні результати було отримано для -ε, -δ, -η, -θ, -μ, -ζ ізоформ. Розподіл ізоформ ПКС-α, -ε, -δ, -ζ μіж субклітинними фракціями наведено на рис. 2. ПКС-ε, -δ, -η, -θ, -μ βідносяться до родини нових, а ПКС-ζ до нетипових протеїнкіназ. Всі вищезгадані форми є Са2+-незалежними, їх визначення в корі надниркових залоз було проведено вперше. Рівень експресії цих ізоферментів в корі надниркових залоз людини є досить високим, хоча меншим порівняно з Са2+/фосфоліпід-залежною ПКС-α. За винятком δ-ізоформи, вони виявляються в усіх досліджуваних субклітинних фракціях – цитозольній, мікросомній та ядерній (рис. 2).
Розподіл ізоформ ПКС-ε, -δ, -ζ μіж цитозольною, мікросомальною та ядерною фракціями наведено у таблиці 2. У випадку ПКС-ε усереднені дані за всіма дослідженими групами демонструють переважний вміст ε-ізоформи ПКС у цитозольній фракції (табл. 2). Отже, розподіл протеїнкінази С-eне залежить від типу тканини і характеризується зсувом до цитозольної фракції. Транслокація ПКС-δ до мембранної фракції спостерігалась у випадку аденом. Розподіл ПКС-ζ є подібним до ПКС-eв аденомах. В умовно нормальній тканині різниця між цитозольною та мікросомною фракціями ставить менше 10 %. У аденомах відносний розподіл протеїнкінази С-ζ характеризується зсувом до цитозольної фракції. Частка ядерної фракції становить в досліджених групах 14-18 % (табл. 2).
Таблиця 2
Субклітиннийрозподіл ε, δ, ζізоформ ПКС у фракціях клітин кори та пухлин надниркових залоз людини, %
Примітка. * -вірогідна різниця між цитозолем та мікросомною фракцією, р
Таким чином, отримані дані свідчать про участь ферментів родини ПКС у формуванні пухлинних патологій, оскільки процес транслокації до мембран є дуже суттєвим для активації ферменту та взагалі для існування пухлинних клітин.
Крім серин/треонінових протеїнкіназ, до яких відноситься ПКС, широко представлені в клітинах рецепторні і цитоплазматичні фосфотирозинові протеїнкінази. Зараз активно обговорюються факти щодо фенотипічного зв’язку експресії РТК в клітині зі злоякісною трансформацією і метастатичним потенціалом тканини. Ми провели оцінку експресії мРНК РТК за рахунок використання зворотної транскрипції – полімеразної ланцюгової реакції, яка свідчить про вірогідні відміни у експресії мРНК РТК між нормальною та пухлинною тканинами у карциномах кори надниркових залоз. Експресія в злоякісних пухлинах є найбільш вираженою і відрізняється від експресії мРНК РТК в доброякісних пухлинах надниркових залоз, які досліджувались (експресія спостерігалась тільки в одному випадку гормонально-активної аденоми – альдостероми). Визначення експресії РТК за допомогою зворотної транскрипції – полімеразної ланцюгової реакції може вважатись, з нашої точки зору, методом диференційної діагностики злоякісності пухлин надниркових залоз. Використання цього методу може бути перспективним для діагностики карцином адренокортикальної тканини.
Залучення МАР-кіназної системи до перенесення сигналу АКТГ.
Пострецепторні етапи дії АКТГ, які полягають в перенесенні сигналу з активованого рецептора на внутрішньоклітинні процеси, що контролюються гормоном, пов’язують з системою cAMP-залежної ПКА, а також ПКС. Крім цих кіназ, кортикотропін викликає швидку активацію протеїнкіназ, що активуються мітогенами (МАР) – ERK1/2 і JNK в клітинах Y1, отриманих з адренокортикальної пухлини мишей. Трактування таких даних потребує уваги щодо пухлинного походження клітин лінії Y1, на яких здебільшого проводили дослідження дії АКТГ на систему МАР-кіназ, – регуляція функції і поділу цих клітин може суттєво відрізнятись від процесів у нормальних клітинах. Тому метою наступного етапу роботи було з’ясування участі МАР-кіназної сигнальної системи, а також факторів транскрипції c-jun та c-fos в трансдукції регуляторного сигналу АКТГ in vivo в корі надниркових залоз щурів.Досліди проведені на тлі істотного збільшення синтезу сумарних 11-гідроксикортикостероїдів (11-ОКС) корою надниркових залоз після введення щурам кортикотропіну в дозі 2 од./100 г маси тіла. Через 1 год після введення АКТГ рівень сумарних 11-ОКС у плазмі крові збільшувався з 1824±156 нмоль/л в контролі до 3220±168 нмоль/л (р
Згідно одержаних даних, через 1 год після введення щурам АКТГ вміст ERK1/2 в адренокортикальній тканині зростає в 1,6 рази, а через 6 год починає знижуватись. За даними літератури проліферативна дія кортикотропіну реалізується в клітинах кори надниркових залоз в першу чергу за рахунок активації ERK1/2 кіназ (р42/44), які відносяться до родини серин/треонінових протеїнкіназ, що активуються мітогенами. До родини МАР-кіназ відносять також JNK(c-JunNH2-термінальна кіназа або SAPK– протеїнкіназа, що активується стресом) та р38 кіназу. Ці серин/треонінові кінази в свою чергу є активаторами транскрипційних факторів, які регулюють експресію генів ферментів стероїдогенезу. За отриманими нами даними, найвиразніший вплив АКТГ чинить на рівень JNK кінази. Через 1 год після введення АКТГ її вміст зростає більш ніж вдвічі, через 6 год вірогідно знижується, проте залишається істотно вищим, ніж у контролі (рис. 3).На клітинах Y1 показали, що АКТГ здатний індукувати швидке зростання активності ERK1/2 та стимулювати входження клітин у S-фазу клітинного циклу [Forti, 2006; Lotfi, Armelin, 1998].Важливим елементом трансдукції та ампліфікації різних регуляторних сигналів в ядрі є транскрипційний фактор АР-1, який складається з двох субодиниць, транскрипційних факторів с-jun і с-fos. Вміст білка с-jun в адренокортикальній тканині зростає майже в 1,7 рази через 1 год після введення АКТГ (рис. 3). Звертає на себе увагу значне збільшення з часом вмісту білка с-fos, який вірогідно зростає в 1,7 рази тільки через 6 год після введення кортикотропіну.
Дослідження ролі
АКТГ в апоптичних процесах в надниркових залозах.
Кортикотропін, як головний регулятор адренокортикальної функції, забезпечує не тільки диференціювання, проліферацію адренокортикоцитів, а також їх генетично запрограмовану загибель шляхом апоптозу. Існує припущення, що шлях перенесення сигналу cAMP-залежною ПКА може водночас приводити до інгібування росту адренокортикальної пухлини [Keegan, Hammer, 2002; Kirschner, 2002], а інактивація рецепторів АКТГ може спровокувати формування пухлини [Kirschner, 2006]. Здебільшого дослідження механізмів апоптозу проводять як на клітинному, так і молекулярному рівнях, використовуючи як експериментальні моделі клітинні лінії.
Не існує жодної роботи, яка була б проведена на постопераційних тканинах надниркових залоз людини, що позбавляє можливості екстраполяції експериментальних даних на людський організм. Зважаючи на повну відсутність даних участі апоптичних процесів в патогенезі навіть найпоширеніших захворювань надниркових залоз, ми провели дослідження на гіперплазованій адренокортикальній тканині людини. Дослідження ролі АКТГ у регуляції апоптозу адренокортикальних клітин проводили за допомогою двохметодичних підходів: визначення вмісту каспази-3 методом імуноблот-аналізу та за фрагментацією ДНК, яка є свідченням завершальних етапів апоптозу. Утворення характерної для апоптозу чіткої «драбинки» здійснюється ендонуклеазами, які розщеплюють ДНК хроматину на відрізки фіксованого розміру.
продолжение
--PAGE_BREAK--
Рис. 3. Вплив АКТГ in
vivo
на вміст JNK-кінази і транскрипційного фактора c-junу корі надниркових залоз щурів.
А – типові результати імуноблот-аналізу одного досліду з 3-х, Б – усереднені дані. 1 – контроль, 2 – АКТГ 1 год, 3 – АКТГ 6 год. * – різниця з контролем є вірогідною, # – різниця з групою АКТГ 1 год є вірогідною, р
Внесення до середовища інкубації АКТГ викликає вірогідні зміни вмісту каспази-3 в адренокортикоцитах (рис. 4).
Рівень каспази-3 за присутності кортикотропіну знижується як в абсолютних величинах (в 1,7 рази), так і у відсотках по відношенню до контролю (на 40 %). Хелеритрину хлорид (ХХ), який здатний інгібувати активність ПКС, виявляє протилежну дію: вміст каспази-3 збільшується на 22 %. При сумісному додаванні АКТГ і ХХ в більшій мірі спостерігається ефект, характерний для ХХ. Подібна закономірність спостерігається при дослідженні фрагментації ДНК. Під впливом АКТГ спостерігається зниження рівня фрагментації ДНК на 13 %, ці зміни є вірогідними. Тенденція до збільшення фрагментації ДНК спостерігається як при додаванні до середовища інкубації інгібітору ПКС ХХ, так і його комбінації з кортикотропіном. Отримані нами результати свідчать про те, що кортикотропін здійснює антиапоптичний вплив на кору надниркових залоз людини. Виявлені під дією АКТГ антиапоптичні зміни в клітинахнадниркових залоз, оцінювані за вмістом каспази-3 і ступенем фрагментації ДНК.
Наш час відзначається інтенсивними спробами залучити до кола протипухлинних засобів препарати, що діють саме на ланки сигнальних шляхів, залучених до трансформації клітин. Інгібування ПКС, зокрема хелеритрином, може стати допоміжним заходом для посилення апоптичної загибелі клітин під впливом канцеростатичних препаратів або іонізуючої радіації. Крім ПКС-залежного впливу хелеритрину, що може викликати апоптоз, ймовірною є його пряма дія на ДНК. Виходячи з цього, посилення фрагментації ДНК під впливом хелеритрину хлориду може пояснюватись його цитотоксичною дією, високим ступенем спорідненості до ДНК та здатності цього алкалоїда до інтеркаляції [Осип та ін., 2004; Kaminskyyetal., 2005]. Конформація молекул хелеритрину зумовлює його енергетично вигідне розміщення між парами азотистих основ у спіралі ДНК, що призводить до стабілізації спіралі (підвищення температури плавлення) ДНК і, як наслідок, до гальмування процесів реплікації.
Таким чином, можна стверджувати, що вплив кортикотропіну на функцію кори надниркових залоз є значно складнішим, ніж вважалось до цього часу. Ефекти АКТГ здебільшого пов’язані з регуляцією стероїдогенезу в адренокортикальній тканині. Однак отримані нами дані щодо впливу кортикотропіну на зміни рівня каспази-3 та фрагментації ДНК дозволяють віднести його до чинників, що регулюють одночасно апоптичні процеси в адренокортикоцитах.
Зв’язування 125І-АКТГ та 125І-ПРЛ в корі надниркових залоз за умов адренокортикальної патології.Відомо, що апоптоз не тільки відіграє важливу роль у елімінації пухлинних клітин, але й посилюється в останніх за дії деяких протипухлинних препаратів. Застосування хлодитану (о, п’-ДДД, 2-о-хлорфеніл-2-п-хлорфеніл-1,1-дихлоретан) при хворобі та синдромі Іценка-Кушинга та при лікуванні певних випадків злоякісних перетворень у надниркових залозах значно підвищило ефективність терапії цих патологій [Комиссаренко, Резников, 1972; Schteingart, 2007].
Рис. 5. Вплив хлодитану на специфічне зв’язування 125І-АКТГ (А) та 125І-ПРЛ (Б) мікросомами адренокортикоцитів людини.
Вплив хлодитану є вірогідним, p
Кількість спостережень вказано всередині стовпчиків.
Вивчення відхилень гормональної рецепції в корі надниркових залоз під впливом хлодитану в певній мірі заповнює прогалину в розумінні механізму його дії, розвитку резистентності до нього та може стати підґрунтям для використання більш ефективної схеми лікування хвороби Іценка-Кушинга. Зважаючи на практично повну відсутність аналізу як рецепторної ланки в патогенезі захворювань надниркових залоз, так і зміни рецепції тропних гормонів гіпофіза при адренокортикальних патологіях та за умов їх терапії, ми провели дослідження впливу хлодитану на зміни рецепції 125І-АКТГ та 125І-ПРЛ. Для вивчення дії хлодитану на зв’язування 125І-АКТГ та 125І-ПРЛ використані мікросомні фракції клітин кори надниркових залоз пацієнтів з різними діагнозами: хвороба Іценка-Кушинга на різних стадіях, кортикостерома, альдостерома. Розглянувши наявний матеріал ми не помітили істотних відмін між ними в характері впливу хлодитану в залежності від типу патології. Тому всі дані охарактеризовано як одна вибірка.
Для вивчення зв’язування використано АКТГ, мічений за Tyr23, а Tyr2, який бере участь у формуванні центру, відповідального за гормон-рецепторну взаємодію, залишається нейодованим. Такий ліганд повністю зберігає біологічну активність, зокрема, здатність взаємодіяти з рецепторами та активувати стероїдогенез.
Параметри зв’язування 125І-ПРЛ в мікросомній фракції кори надниркових залоз людини свідчать про наявність тільки одного типу сайту зв’язування ПРЛ, який за своїми характеристиками є типовим представником рецепторів високої афінності та низької ємності: Bmax=1,2±0,08 х 10-10М; Ka=0,14±0,02 х 109 М-1. Оцінка параметрів зв’язування 125І-ПРЛ ізольованими адренокортикальними клітинами свідчить, що афінність рецепторів у цьому випадку є подібною до мембран мікросом. Цей факт може бути додатковим свідченням того, що диспергування і очищення адренокортикоцитів істотно не впливає на нативність клітин та їх здатність до відтворення нормальних фізіологічних процесів. Більш низьку абсолютну зв’язувальну ємність плазматичних мембран адренокортикоцитів порівняно до мембран мікросом можна пояснити тим, що на поверхні клітини є доступною лише незначна частка тих рецепторів, які містять мікросоми. Специфічне зв’язування (Bsp) як 125І-АКТГ, так і 125І-ПРЛ знижується у мікросомах кори надниркових залоз людини за присутності хлодитану (рис. 5).
Зв’язування починає зменшуватись, починаючи з концентрації 0,01 мкмоль/л, та сягає мінімуму за присутності 0,3 мкмоль/л хлодитану (рецепція 125І-ПРЛ) або 1,0 мкмоль/л хлодитану (рецепція 125І-АКТГ). Подальше збільшення концентрації хлодитану нівелювало його інгібувальний ефект на зв’язування досліджуваних лігандів (рис. 5). Факт встановлення залежності зниження специфічного зв’язування 125І-АКТГ та 125І-ПРЛ від концентрації хлодитану у мікросомній фракції адренокортикоцитів може стати підставою для пошуків способів подолання резистентності деяких типів пухлин до цього препарату та збільшення ефективності його використання.
Шляхи внутрішньоклітинного перенесення регуляторних сигналів естрадіолу в корі надниркових залоз
Продукція cAMP та cGMP, активність ПКА та ПКС в корі надниркових залоз людини під впливом естрадіолу.
Дослідження молекулярних механізмів дії естрогенів призвело до появи нових теорій, більш чітко окреслило етапи реалізації ефектів стероїдних гормонів. До останнього часу вплив естрогенів на клітини-мішені пов’язували виключно з геномними ефектами, що не потребують залучення вторинних посередників для внутрішньоклітинного перенесення регуляторних сигналів. Зараз розглядається участь в цих процесах декількох месенджерних систем, серед яких важливе місце відводять cAMP-залежному каскаду.
При визначенні вмісту сумарних 11-ОКС у середовищі інкубації ми показали дозозалежне збільшення продукції стероїдів зрізами кори надниркових залоз людини під впливом естрадіолу. Максимальний рівень синтезу кортикостероїдних гормонів спостерігається через 4 год інкубації при концентрації естрадіолу 100 мкМ і становить 6212 ±841 нмоль/л у порівнянні з 2363 ±271 нмоль/л у контрольних пробах (р
Утворення cAMP тканиною кори надниркових залоз людини вірогідно збільшується через 3 год інкубації.
Ці зміни стають ще істотнішими через 4 год інкубації, коли спостерігається 7-разове збільшення продукції cAMP. Рівень cGMP не змінювався ні за умов використання різних концентрацій естрадіолу, ні за умов різних термінів інкубації.
Дослідження впливу естрадіолу на активність ПКА та ПКС в субклітинних фракціях кори надниркових залоз людини дозволило продемонструвати, що інкубація з естрадіолом-17βпротягом 4 год у концентрації 10 мкМ не призводить до активації ПКА ні в мембранній, ні в цитозольній фракціях (табл. 3). При збільшенні концентрації до 100 мкМ протеїнкіназна активність у мікросомній фракції зростає більш ніж на 50 % порівняно з контролем.Визначення активності ПКС в мікросомній фракції показало, що естрадіол активує цю кіназу. Активність ПКС збільшується на 50 % у мікросомній фракції зрізів кори надниркових залоз за умов дії естрадіолу (100 мкМ) (табл. 3).
Таблиця 3
Вплив 17b-естрадіолу invitroна активність ПКА і ПКС (нмоль субстрату х хв-1 х мг-1білка) у субклітинних фракціях зрізів умовно нормальної тканини кори надниркових залоз людини
Примітка. * – різниця з контролем є вірогідною, р
Продемонстровані шляхи пострецепторної передачі регуляторних сигналів естрадіолу за умовах in vitro на первинній культурі клітин надниркових залоз поросят і зрізах кори надниркових залоз людини залишають відкритим питання щодо тотожності цих шляхів на рівні цілісного організму. Відомо, що природні та синтетичні естрогени активно використовуються для лікування раку простати у чоловіків [Tammela, 2004], тому дослідження ефектів естрадіолу на інтактних та кастрованих експериментальних тваринах можуть дозволити певну екстраполяцію на зміни функції надниркових залоз у людини.
Після 3 днів введення естрадіолу спостерігалось істотне зростання рівня сумарних 11-ОКС у плазмі крові як інтактних, так і орхіектомованих щурів (табл. 4). Показано, що введення 50 мкг естрадіолу інтактним тваринам призводить до збільшення рівня кортикостероїдів у 1,5 рази порівняно з інтактними тваринами, що отримували ін’єкції олії. При введенні 100 мкг естрадіолу цей показник зростає більш ніж у 2 рази. Подібний ефект естрадіолу спостерігався і у кастрованих тварин. У контрольних орхіектомованих щурів рівень 11-ОКС був нижчим, ніж у інтактних (яким вводили сливову олію). Збільшення концентрації кортикостероїдних гормонів під впливом естрадіолу було подібним в обох експериментальних групах. Виходячи з цих даних можна стверджувати, що рівень тестостерону в організмі не має помітного впливу на зміни функції адренокортикальних клітин під впливом естрадіолу. Ні орхіектомія, ні замісне введення тестостерону щурам не призводили до змін концентрації вільного холестерину або його ефірів, які є попередниками синтезу кортикостероїдів [Dudaetal., 1985].
Таблиця 4
Вплив естрадіолу бензоату (Е2) invivoна вміст сумарних 11-гідроксикортикостероїдів у плазмі крові самців щурів (нмоль/л)
Примітки:
*, ** – різниця з контролем є вірогідною, відповідно р
+ – різниця між інтактними і орхіектомованими тваринами є вірогідною, р
Оскільки найважливішими етапами переносу сигналу основного регулятора функції кори надниркових залоз – АКТГ є активація аденілатциклази та cAMP-залежної протеїнкінази А, ми досліджували вплив естрадіолу in vivo на активність ПКA у субклітинних фракціях кори надниркових залоз.Відомо, що ПКА відіграє суттєву роль у найважливіших етапах стероїдогенезу: відщепленні бокового ланцюга холестерину цитохромом Р450scc, активації білка StAR, транспорті вільного холестерину до внутрішнього шару мембрани мітохондрій[Gallo-Payet et al., 2003; Richards, 2001]. Визначення активності ПКА в субклітинних фракціях показало, що триденне введення естрадіолу призводить до істотного зростання активності ПКА як у цитозольній, так і у мікросомній фракціях кори надниркових залоз інтактних та орхіектомованих щурів (табл. 5). Вірогідність змін була вищою у мікросомній фракції. Ми визначали також активність ПКС, яка може брати участь в опосередкуванні регуляторних сигналів естрогенів (табл. 5). Активність ПКС вірогідно збільшується як в цитозольній фракції адренокортикоцитів, так і, ще в більшому ступені, в мікросомній фракції надниркових залоз інтактних і орхіектомованих щурів, що отримували естрадіол.
Таблиця 5
Вплив естрадіолу бензоату (Е2) invivoна активність протеїнкіназ А та С у субклітинних фракціях кори надниркових залоз самців щурів (нмоль субстрату х хв-1 х мг-1 білка)
Примітки:
*, ** – різниця з контролем є вірогідною, відповідно р
Естрадіол підвищує активність ПКС в мікросомній фракції кори надниркових залоз у 1,7 рази в групі інтактних тварин та у 2,0 рази в групі орхіектомованих тварин. Зміни рівня кортикостероїдів і активності ПКА та ПКС під впливом естрадіолу бензоату є подібними у інтактних та кастрованих самців щурів, що дозволяє зробити висновок: видалення сім’яників не впливає на відповідь надниркових залоз на естрогени. Таким чином, отримані дані дозволяють вважати, що збільшення синтезу кортикостероїдів та активація ПКА і ПКС у субклітинних фракціях адренокортикоцитів інтактних та орхіектомованих щурів внаслідок дії естрадіолу свідчить про причетність естрогенів до регуляції функції кори надниркових залоз і про залучення протеїнкіназ до перенесення регуляторного сигналу естрадіолу в адренокортикальних клітинах.
Отже, естрадіол in vitro та in
vivoпосилює продукцію кортикостероїдних гормонів в корі надниркових залоз і збільшує рівень cAMP, який, в свою чергу, є активатором cAMP-залежної ПКА. У субклітинних фракціях клітин збільшується активність ПКА і ПКС, що свідчить про участь цих ферментів в реалізації ефектів естрогенів в корі надниркових залоз. Узагальнюючи наші результати і дані інших дослідників [Aronica et al., 1994; Seval et al., 2006] можна висловити припущення, що регуляція стероїдогенезу естрогенами в корі надниркових залоз зумовлена здебільшого cAMP-залежною системою. Ймовірною є також участь систем, до яких залучена ПКС. Отримані дані дозволяють розширити розуміння сукупності негеномних механізмів, за якими естрогени здатні чинити контроль метаболічних процесів в адренокортикальній тканині.
продолжение
--PAGE_BREAK--Участь сигнального каскаду, пов’язаного з протеїнкіназами, що активуються мітогенами, в опосередкуванні сигналу естрадіолу. В опосередкуванні впливу естрогенів на клітини-мішені зараз розглядається участь декількох сигнальних систем, серед яких важливе місце відводять крім протеїнкіназ А і С, месенджерним системам, що використовують як вторинні посередники протеїнкінази, що активуються мітогенами. Каскад MAPK/ERKє одним з провідних шляхів сигнальної трансдукції естрогенів, що залучається до реалізації широкого спектру ефектів, спрямованих на проліферацію клітин-мішеней. Показано, що активована естрогенами форма ERK1/2 здатна до транслокації в ядро і прямої взаємодії з ядерними транскрипційними факторами [Edwards, 2005; Lee, McEwen, 2001].
В корі надниркових залоз щурів естрадіол бензоат чинить найбільш виразний вплив на рівень ERK1/2 кінази (рис. 7). За результатом Вестерн-блот аналізу, введення 50 мкг естрадіолу не призводить до змін вмісту ERK1/2 в адренокортикальній тканині порівняно із контрольними тваринами, що отримували ін’єкції олії. Після тридобового введення естрадіолу в дозі 100 мкг цей показник вірогідно зростає в 1,7 рази(рис. 7). Збільшення вмісту JNK кінази спостерігається в адренокортикальній тканині при введенні 100 мкг естрадіолу бензоату. Рівень р38 МАР-кінази при введенні естрадіолу в обох дозах залишається без змін.
В інших типах клітин, зокрема раку молочної залози MCF-7, фосфорилювання р38 кінази і, особливо, ERK1/2 збільшується під впливом 17β-естрадіолу в клітинах [Gutzmanetal., 2005].
Потрібно зазначити, що стимульована естрогенами транскрипція полягає в активації експресії низки генів, серед яких протоонкогени c-jun таc-fos [Albanitoetal., 2007]. Продукти активації цих генів, білки с-jun і c-fos, утворюючи гомодимерні та гетеродимерні комплекси, входять до складу фактора транскрипції АР-1, який є надзвичайно важливим елементом трансдукції сигналу в ядрі. Ми визначали в адренокортикоцитах щурів рівень білкових факторів транскрипції с-jun та c-fos, які можуть брати участь в опосередкуванні регуляторних сигналів естрогенів в корі надниркових залоз (рис. 7). Максимальний рівень с-fos спостерігається при введенні 100 мкг естрадіолу. В цих умовах рівень білка с-jun в корі надниркових залоз практично не змінюється.
Встановлено, що c-jun таc-fos не єдині ранні протоонкогени|, експресія яких стимулюється естрогенами. 17β-εстрадіол також істотно|суттєво| збільшує рівень експресії мРНК|посилює| протоонкогена| c-myc в ембріональних стовбурових клітинах [Hanetal., 2006].
Таким чином, можна зробити висновок, що до перенесення регуляторного сигналу естрадіолу в клітинах кори надниркових залоз можуть бути залучені МАРК ERK1/2 та фактор транскрипції c-fos, який активується цією кіназою.
Рис. 7. Вплив естрадіолу бензоату (Е2) in
vivoна вміст ERK1/2 та c-fos у корі надниркових залоз щурів.
Репрезентативні результати імуноблот-аналізу одного з 3-х дослідів (А) та усереднені дані (Б). 1 – контроль, 2 – Е2 50 мкг/тварину, 3 – Е2 100 мкг/тварину. Різниця з контролем є вірогідною, * – p
Дослідження впливу NAE на стероїдогенез в корі надниркових залоз. участь систем вторинних посередників перенесення регуляторних сигналів nae в адренокортикоцитах
Зміна біосинтезу кортикостероїдів під впливом NAE та дофаміну.N-ацилетаноламіни завдяки ліпотропним властивостям добре поглинаються збагаченими на ліпіди тканинами, зокрема адренокортикальною. Розподіл введеного щурам міченого N-пальмітоїлетаноламіну свідчить про переважне його включення саме до надниркових залоз [Жуков та ін., 2000].Оскільки стероїдогенез є основною функцією цієї залози, NAE можуть відігравати важливу роль в синтезі кортикостероїдних гормонів. Відповідь кори надниркових залоз на введення NAE в організм може бути пов’язана із зміною функції гіпофізу і вищих регуляторних центрів. Тому дослідження кортикостероїдогенезу було проведено на зрізах надниркових залоз в середовищі, що містило NAE, а також дофамін.Дофамін, який є інгібітором секреції альдостерону, є одним з найменш досліджених модуляторів адренокортикальної функції. Як нейромедіатор, дофамін відіграє важливу роль в регуляції секреції пролактину, який, в свою чергу, виконує регуляторну функцію в клітинах кори надниркових залоз.
В дослідах використовували N-стеароїлетаноламін або суміш N-ацилетаноламінів, в якій більше 60 % складають залишки ненасичених жирних кислот: 6,3 % арахідонової, 1,8 % лінолевої, 7,6 % гондової, 18,4 % олеїнової, 6,4 % пальмітоолеїнової, 16,7 % ейкозапентаенової, 2,7 % докозагексаенової; близько 30 % – ацили насичених жирних кислот: 6,4 % міристинової, 22,4 % пальмітинової, 3,0 % стеаринової, 1,0 % арахінової, 1,4 % бегенової.
Додавання до середовища інкубації N-стеароїлетаноламіну у концентраціях 10-7-10-6Мне викликало суттєвих змін щодо включення мітки в альдостерон та кортикостерон. Однак у присутності N-стеароїлетаноламіну в концентрації 10-5Ммічення гормонів підвищувалось.
Вплив дофаміну на включення мітки холестерину в альдостерон і кортикостерон залежав від його концентрації (рис. 8). В концентрації 10-7 – 10-6Мдофамін не впливав на включення холестеринової мітки в кортикостерон. Мічення альдостерону мало тенденцію до зростання при концентрації дофаміну 10-6М. Вірогідним пригнічення мічення кортикостерону і альдостерону ставало при концентрації дофаміну 10-5М. Потрібно зазначити, що це гальмування відбувається лише при досить високій концентрації дофаміну.
Аналіз особливостей сумісної дії дофаміну та NAE проведено з використанням таких концентрацій сполук, котрі самі по собі не змінювали включення мітки в альдостерон і кортикостерон – 10-6М(рис. 9). Дофамін у використаній концентрації дещо збільшував включення мітки в альдостерон, але не в кортикостерон.
Встановлено, що кожен з препаратів NAEпотенціював включення 3Н-холестерину в кортикостероїди за дії дофаміну. При цьому радіоактивність альдостерону та кортикостерону зростала в порівнянні з контролем на 60-80 %. Для альдостерону суттєве підвищення включення 3Н-холестерину досягалось тільки при додаванні суміші ненасичених NAE.
За контроль (100 %) слугували проби, що не містили NAE і дофаміну. Порівняння з контролем: * – р
Не існує чітких односпрямованих результатів, які б характеризували вплив NAE на процеси стероїдогенезу в корі надниркових залоз людини і експериментальних тварин. Проте не викликає сумнівів той факт, що NAE мають адреномодуляторні властивості. Ми показали, що N-ацильовані етаноламіни in vitro суттєво збільшували секрецію 11-ОКС в адренокортикальній тканині самок щурів, проте утворення 11-ОКС зрізами надниркових залоз людини та самців щурів в присутності NAE пригнічувалось (дані не наведені). Питання залежності відповіді на NAE від статі тварин обговорювати вкрай важко, тому що характер впливу статевих гомонів на синтез кортикостероїдів в корі надниркових залоз не досліджено ґрунтовно. Статеві відмінності щільності місць зв’язування каннабіноїдів та зміни їх рецепції під впливом статевих гормонів було знайдено в деяких структурах мозку, але фізіологічна роль цих відмінностей залишається нез’ясованою [De Fonseca et al., 2005].
Слід відзначити, що вплив суміші NAE, яка містила похідні етаноламіну з насиченими і з ненасиченими залишками жирних кислот, на мічення альдостерону був виразнішим, ніж у випадку використання N-стеароїлетаноламіну(рис. 9). Очевидно, властивості залишків жирної кислоти, що входять у склад NAE, мають значення у визначенні реакції адренокортикоцитів. Це, в свою чергу, може свідчити про те, що дія NAE не обмежується впливом на мембрани, а й може впливати на месенджерні механізми або на стероїдогенез безпосередньо. Зростання включення мітки 3H-холестерину до кортикостероїдів під впливом NAE може пояснюватись збільшенням проникнення вільного міченого холестерину до зрізів.
Одним із можливих механізмів впливу NAE може бути зміна транспорту електронів від NADPH на цитохром Р450, який забезпечує реакції гідроксилювання стероїдів. У дослідах in vitro виявлено зниження синтезу 11-ОКС зрізами надниркових залоз самців щурів при додаванні NAE [Гула та ін., 2000]. Перенесення електронів на штучні акцептори, цитохром С та дихлорфеноліндофенол в цих же умовах не змінюється. Це дозволяє вважати, що процес перенесення електронів від NADPH на цитохром Р450 під впливом NAE не змінюється, а гальмування стероїдогенезу у присутності NAE може обумовлюватись зниженням активності аденілатциклази. Пригнічення аденілатциклазної активності і зниження рівня cAMPє найбільш вивченим механізмом переносу сигналів від канабіноїдних рецепторів СВ1 [Felder et al., 1995; Maccarrone et al., 2001]. Встановлено, що активація канабіноїдних рецепторів, сполучених з G(i/0)-cубодиницею GTP-зв’язуючого білка, призводить до інгібування аденілатциклази і пригнічення ефектів, залежних від cAMP-залежної протеїнкінази А.
Роль циклічних нуклеотидів, протеїнкіназ А і С в реалізації ефектів N-ацилетаноламінів в адренокортикоцитах.
Дослідження впливу етаноламінів, N-ацильованих сумішшю жирних кислот,на продукцію cAMP корою надниркових залоз людини дозволило показати, що помітне зниження вмісту cAMP в адренокортикальній тканині спостерігається вже при концентрації NAE 0,3 мкг/мл, при збільшенні концентрації NAE вміст cAMP продовжує зменшуватись і становить 0,083 ± 0,005 пмоль/мг тканини при концентрації NAE 33 мкг/мл. В контрольних пробах вміст cAMP становить 0,200 ± 0,012 пмоль/мг тканини. Рівень cGMP за цих умов залишається незмінним.
Для з’ясування можливості модуляції стероїдогенезу за рахунок змін активності ПКА і ПКС ми провели пряме визначення впливу NAEна активність ферментів в субклітинних фракціях. Суміш N-ацильованих похідних етаноламінузмінює активність ПКAу субклітинних фракціях кори надниркових залоз людини, як це видно з табл. 6.
Таблиця 6
Вплив NAEна активність ПКА і ПКС (нмоль субстрату х хв-1 х мг-1 білка) у субклітинних фракціях зрізів умовно нормальної тканини кори надниркових залоз людини
Примітка. * –вірогідно по відношенню до контролю, p
У цитозольній фракції клітин спостерігається вірогідне зниження активності ферменту, починаючи з концентрації NAE3,3 мкг/мл. При збільшенні концентрації NAEдо 33 мкг/мл протеїнкіназна активність знижується на 34 % у порівнянні з контрольними пробами.У дослідженихконцентраціях NAEin vitro не впливає на активність ПКА у мембранній фракції адренокортикоцитів.
Внесення суміші NAEдо середовища інкубації в жодній з досліджуваних концентрацій не впливає на активність ПКС в цитозольній фракції клітин кори надниркових залоз (табл. 6). У мембранній фракції зростання протеїнкіназної активності спостерігається тільки при одній концентраціїNAE -3,3 мкг/мл.
Виходячи з отриманих даних, виявлені прямі стимулювальні ефекти N-ацилетаноламінів на стероїдогенез в корі надниркових залоз можуть пояснюватись залученням ПКС до перенесення регуляторних сигналів NAE в адренокортикоцитах. Привертає увагу той факт, що для суміші NAE концентрація 3,3 мкг/мл виявилася найбільш біологічно активною в дослідах in vitro як в корі надниркових залоз людини, так і самок щурів. Можливо, ПКС не є єдиною протеїнкіназою, що активується NAE в адренокортикоцитах. Для деяких типів клітин існують дані щодо активації анандамідом, 2-арахідоноїлгіцеролом та D9-тетрагідроканабінолом протеїнкіназ, що активуються мітогенами, а також кінази фокальних контактів [Lepicieretal., 2003].
Вплив NAE на апоптичні процеси в умовно нормальній та пухлинній тканинах надниркових залоз людини.Вважається, що при пошкодженні багатьох тканин і, в першу чергу, нервової тканини та серцевого м’язу утворюються NAE, які виконують захисну функцію щодо пошкодженої тканини. Стабілізаційні ефекти NAE щодо травмованих тканин можуть бути пов’язані з їх протекторним впливом на клітинні мембрани. Нашу увагу NAE привернули такими ефектами, як здатність викликати і посилювати апоптоз та пригнічувати проліферацію урізних типах тканин [Гула та ін., 2006; Maccarrone et al., 2002], в тому числі ів пухлинній тканині надниркових залоз людини [Kostyuchenkoetal., 2005]. Проте, незважаючи на проведені дослідження, антипроліферативний та проапоптичний ефекти NAE в різноманітних пухлинах кори надниркових залоз вивчені ще дуже недостатньо.
Тому метою наступного етапу досліджень було визначення залежності ступеня фрагментації ДНК в деяких пухлинних тканинах надниркових залоз людини від вмісту NAE (N-стеароїлетаноламіну та суміші ненасичених NAE) в інкубаційному середовищі (табл. 7).In vitro суміш NAE, що містила похідні етаноламіну здебільшого з ненасиченими залишками жирних кислот, не змінює фрагментацію ДНК в умовно нормальній тканині у випадках альдостером та андростером. Водночас в умовно нормальній тканині у випадку феохромоцитом сумарний об’єм фрагментів ДНК зростає майже в два рази (табл. 7).
Очевидно, реакція тканини надниркових залоз у значній мірі визначається її генетичними особливостями і, відповідно, біохімічними змінами, що відбуваються в тканині внаслідок патологічного перетворення. Слід відзначити, що ступені фрагментації ДНК у пухлинних і умовно нормальних ділянках у межах однієї залози тканин кори надниркових залоз, одержаних від хворих альдостеромою, феохромоцитомою, андростеромою в значній мірі різняться між собою (табл. 7). Різна інтенсивність апоптичних явищ у клітині може пояснюватися перебудовою генетично детермінованих процесів у патологічно змінених клітинах у порівнянні з нормальною тканиною [Berninietal., 2002].
Таблиця 7
Порівняльна характеристика інтенсивності апоптичних процесів (%) у пухлинних і умовно нормальних ділянках в межах однієї залози під впливом суміші NAE
Джерело тканини
Суміш NAE (3,3 мкг/мл)
пухлина
умовно нормальна
Альдостерома
143,6 ±8,6 **
109,8 ±7,7
Андростерома
102,4 ±13,7
106,4 ±9,1
Феохромоцитома
-
198,0 ±42,2 **
Примітка. За 100 % прийнята фрагментація ДНК за умов інкубації без NAE, ** – вірогідна різниця з контролем без NAE, р
Найбільш чутливими до дії NAE пухлинами виявилися альдостероми, фрагментація ДНК в них збільшується більш ніж на 30 % порівняно з умовно нормальною тканиною. У випадку андростером фрагментація ДНК залишається без змін, у випадку феохромоцитом чутливою до дії NAE є умовно нормальна тканина надниркових залоз. Відомо, що при феохромоцитомі істотно посилюється кортикостероїдогенез в прилеглій адренокортикальній тканин [Wolfetal., 2005]. Цей факт може бути поясненням встановленого нами збільшення фрагментації ДНК під впливом NAE майже на 100 % саме у випадку феохромоцитоми (табл. 7).
Той факт, що N-ацильовані похідні етаноламіну здатні вибірково вражати пухлинну тканину альдостером, помітно не впливаючи і не завдаючи шкоди нормальній, може бути підґрунтям для розробки нових підходів оптимізації хіміотерапії пухлин надниркових залоз.
продолжение
--PAGE_BREAK--Дослідження участі протеїнкіназ у перенесенні регуляторного сигналу іонів калію в адренокортикальних клітинах
Іони калію відіграють значну роль в регуляції адренокортикальної функції. Відомо, що К+ здатний активувати гормонопоез при підвищенні його вмісту в крові або інкубаційному середовищі. Крім того, він є тлом, що модулює ефекти інших регуляторів, в першу чергу ангіотензину II та кортикотропіну [Chenetal., 1999; Prattetal., 1989]. Проте регуляція синтезу мінералокортикоїдів іонами калію є дослідженою значно гірше порівняно з іншими агоністами. Вважається, що основною ланкою в опосередкуванні ефектів калію в клітинах клубочкової зони надниркових залоз є Са2+/кальмодулін-залежна протеїнкіназа [Condonetal., 2002; Gangulyetal., 1992]. В той же час в регуляції найважливіших метаболічних функцій клітини, зокрема в регуляції стероїдогенезу, значну роль відіграють циклічні нуклеотиди. Ми провели дослідження на умовно нормальних та гіперплазованих тканинах кори надниркових залоз людини, які свідчать про участь в трансдукції регуляторних сигналів іонів К+ cAMP, ПКА та ПКС. Для того щоб прослідкувати можливу участь ПКС в опосередкуванні регуляторних сигналів іонів калію в адренокортикоцитах людини, ми вивчали розподіл основної ізоформи ПКС у корі надниркових залоз, ПКС-α, в субклітинних фракціях після інкубації зрізів в середовищі з різним вмістом К+. Встановлено, що кількість ферменту за присутності іонів калію в інкубаційному середовищі є більшою в мікросомах. Таке накопичення ПКС-α в мембранній фракції (її транслокація) свідчить про активацію ферменту. В цитозольній фракції адренокортикоцитів вміст α-ізоформи ПКС залишається без змін.
Ми також вивчали зміни активності ПКС у субклітинних фракціях зрізів адренокортикальної тканини людини під впливом змін концентрації іонів калію. Суттєва активація ПКС спостерігалась в мікросомній фракції: при концентрації калію 8,5 мМактивність ПКС визначалась у мікросомах на рівні 11,09 ±2,33 нмоль субстрату х хв-1 х мг-1 білка. Цікаво відмітити, що після інкубації зрізів у середовищі без калію активність ПКС в мікросомах дещо знижується, порівняно з кіназною активністю при фізіологічній (3,5 мМ) концентрації К+. Визначення активності ПКС в ізольованих ядрах адренокортикоцитів морських свинок показало значне посилення її активності внаслідок дії К+ [Пушкарьов, 2005]. Натомість, інші протеїнкінази в ядрах не активувались, або їх активність навіть мала тенденцію до зменшення.
Активація ПКС в ядрах, можливо, пов’язана з фосфорилюванням деяких транскрипційних чинників, а через них посиленням експресії генів, продукти яких кодують ферменти стероїдогенезу та білки-регулятори стероїдогенезу (StAR). Таким чином, активація ПКС зі збільшенням концентрації К+ спостерігається в надниркових залозах людини та морських свинок [Пушкарьов, 2005], які є близькими за спектром кортикостероїдних гормонів, що секретуються адренокортикоцитами. Така активація залежить від обміну фосфоінозитидів та мобілізації кальцію з внутрішньоклітинних кальцієвих депо і значною мірою визначає рівень синтезу альдостерону в клубочковій зоні залози. Щоб оцінити можливу роль cAMP-залежної ПКА в опосередкуванні стероїдогенного ефекту К+ в корі надниркових залоз людини, визначали вміст нуклеотиду в залежності від концентрації калію в інкубаційному середовищі.
Аналіз залежності продукції cAMPкорою надниркових залоз людини від концентрації іонів каліюдозволив продемонструвати, що при збільшенні концентрації іонів калію до 8,5 мМпродукція cAMPзростає в 4 рази і становить 0,62 ± 0,15 пмоль/мг тканини. В умовах відсутності калію вміст cAMP становить 0,14 ± 0,02 пмоль/мг тканини. Зростання кількості cAMP також спостерігалось за умов стимуляції тканини калієм в клітинах кори надниркових залоз морських свинок [Pushkarev, Mikosha, 1991].
Крім того, у присутності інгібітору ПКА фосфорилювання білків при 5,5 мМК+ в надниркових залозах морських свинок вірогідно зменшувалося [Пушкарьов, 2005]. Ці дані свідчать про можливу участь ПКА у посиленні регуляторного сигналу К+ в адренокортикоцитах морських свинок, як це спостерігається при дії АКТГ. Пряме визначення активності ПКА в мікросомній фракції за інтенсивністю фосфорилювання специфічного субстрату – кемптиду показало, що калій активує цю кіназу, хоча амплітуда активації виявилась нижчою порівняно з ПКС. Як і у випадку ПКС, при концентрації калію в середовищі, нижчій від фізіологічної (3,5 мМ), активність ПКА в мікросомній фракції знижується, при збільшенні концентрації калію до 8,5 мМактивність ПКА також зростає до рівня 4,16 ±0,83 нмоль субстрату х хв-1 х мг-1 білка. Активність ПКА в цитозольній фракції зростає при збільшенні концентрації калію. Уфізіологічних умовах активність ПКА в цитозольній фракції визначалася на рівні 2,11 ±0,14 нмоль субстрату х хв-1 х мг-1 білка, при збільшенні концентрації калію до 8,5 мМвона сягала 3,04 ±0,38 нмоль субстрату х хв-1 х мг-1 білка.
На відміну від цитозолю та мікросом, активність ПКА в ядрах, при визначенні фосфорилювання білків в безклітинній системі, практично не змінюється [Пушкарьов, 2005]. Останній факт може свідчити про те, що основні субстрати цієї кінази знаходяться в цитоплазмі адренокортикоцитів.
Таким чином, базуючись на одержаних нами даних та даних літератури можна стверджувати, що перенесення регуляторних сигналів іонів калію в адренокортикоцитах є значно складнішим процесом, ніж вважалось до цього часу. Ефект підвищених концентрацій іонів калію в адренокортикоцитах реалізується за участю різних месенджерних систем. У перенесенні активуючого сигналу іонів калію в адренокортикальних клітинах можуть брати участь cAMP-залежна протеїнкіназа [Pushkarev, Mikosha, 1991], кальмодулін-залежна протеїнкіназа [Condonetal., 2002], протеїнкіназа С [Betancourt-Calle etal., 2001; Pushkarevetal., 1994]. В результаті активації протеїнкіназ та фосфатаз відбувається фосфорилювання та дефосфорилювання клітинних білків, що обумовлює фізіологічну відповідь клітини.
Отже, можна вважати, що отримані результати обґрунтовують нову концепцію щодо участі регуляторів адренокортикальної функції у формуванні адаптаційних реакцій, які здійснюються безпосередньо наднирковими залозами. Аналіз механізмів взаємодії на молекулярному рівні агоністів, причетних до регуляції адренокортикальної функції і проліферації клітин кори надниркових залоз, переконливо доводить, що ця взаємодія реалізується шляхом низки трансрегуляторних впливів систем внутрішньоклітинних месенджерів, починаючи з першої ланки їхньої дії – рецепції на плазматичній мембрані.
ВИСНОВКИ
1. Обґрунтовано концепцію мультифакторного контролю регуляції гормонопоезу в корі надниркових залоз, взаємодії між різними системами вторинних месенджерів, які опосередковують внутрішньоклітинне перенесення сигналів агоністів, та їх трансрегуляторні впливи. Універсальність мережі месенджерних систем, які запускаються в адренокортикоцитах різними регуляторами – кортикотропіном, естрогенами, пролактином, іонами калію, дофаміном, N-ацильованими похідними етаноламіну, забезпечують реалізацію специфічної функції клітин кори надниркових залоз – синтез кортикостероїдних гормонів.
2. Збільшення активності cAMP-залежної протеїнкінази А, а також протеїнкінази С та її α-ізоформи в клітинах кори надниркових залоз та субклітинних фракціях під впливом АКТГ, естрадіолу, іонів калію свідчить про залучення до забезпечення їхньої регуляторної дії обох кіназних систем.
3. До подальшого перенесення сигналу АКТГ залучено сигнальний каскад протеїнкіназ, що активуються мітогенами, а також ядерні транскрипційні фактори. Серед них найбільш вагома роль у трансдукції сигналу АКТГ в адренокортикоцитах належить МАР-кіназі JNK та ядерному фактору транскрипції с-jun.
4. Виявлені під впливом АКТГ антиапоптичні зміни в клітинах надниркових залоз, оцінювані за зниженням вмісту каспази-3 і ступеня фрагментації ДНК, значною мірою визначаються активацією протеїнкінази С.
5. Встановлено дозозалежність зниження специфічного зв’язування тропних гормонів (АКТГ та пролактину) мембранами адренокортикоцитів за дії адренокортиколітичного препарату хлодитану.
6. В корі надниркових залоз людини основною ізоформою протеїнкінази С є Са2+/фосфоліпід-залежна α-ізоформа. Її експресія в адренокортикальній тканині істотно перевищує експресію інших досліджуваних ізоформ. Транслокація α-ізоформи з цитозольної до мікросомної фракції адренокортикоцитів значно посилюється в пухлинах кори надниркових залоз.
7. В субклітинних фракціях адренокортикоцитів людини експресуються всі Са2+-незалежні ізоформи протеїнкінази С.
8. Збільшення експресії тирозинкінази РТК спостерігається в адренокортикальних карциномах людини. Цей факт може бути теоретичним підґрунтям для використання експресії рецепторних тирозинкіназ як діагностичного маркера злоякісності при адренокортикальній патології.
9. Естрадіол бере участь в регуляції глюкокортикоїдної функції кори надниркових залоз. Дозозалежна стимуляція секреції 11-гідроксикортикостероїдів в дослідах in vitro на первинній культурі надниркових залоз свідчить про пряму дію гормону на адренокортикоцити. Про залучення до опосередкування дії естрадіолу in vivo центральних ланок гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи свідчить збільшення рівня кортикостероїдів в плазмі крові та нуклеїнових кислот в корі надниркових залоз, гіпофізі та гіпоталамусі.
10. Естрадіол in vitro
та in vivo посилює продукцію кортикостероїдів в корі надниркових залоз. До реалізації цих ефектів в адренокортикальних клітинах залучені cAMP-залежна протеїнкіназа А та протеїнкіназа С.
11. Естрадіол викликає збільшення в корі надниркових залоз вмісту МАР-кінази ERK1/2 та ядерного фактора транскрипції с-fos.
12. Адреномодуляторна дія N-ацилетаноламінів in vitro виявляється у стимуляції включення міченого холестерину до синтезованих корою надниркових залоз щурів альдостерону та кортикостерону.
13. Виявлено модулюючий ефект N-ацилетаноламінів in vitro на функцію кори надниркових залоз: підвищення рівня 11-гідроксикортикостероїдів, що синтезуються корою надниркових залоз самок щурів, та зниження вмісту 11-гідроксикортикостероїдів в середовищі інкубації тканини кори надниркових залоз людини та самців щурів. N-ацилетаноламіни здійснюють свій стимулюючий ефект на кору надниркових залоз шляхом активації протеїнкінази С; зменшення стероїдогенезу забезпечується пригніченням утворення cAMP та протеїнкінази А.
14. N-ацилетаноламіни здатні викликати апоптоз або некроз в тканинах пухлин надниркових залоз людини.
СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Тронько М.Д., Ковзун О.І., Пушкарьов В.М. Механізми регуляції стероїдогенезу в корі надниркових залоз. -К.: Центр навчальної літератури, 2006. -304 с. (Дисертантом особисто написано розділи 1, 2.1, 2.3.3, 2.5).
2. Саутин Ю.Ю., Тронько Н.Д., Ковзун Е.И., Микоша А.С. Анаболическое действие пролактина на метаболизм фосфатидилхолина в адренокортикоцитах морских свинок // Укр. биохим. журн. -1991. -Т. 63, № 5. -С. 73-78. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено всі експерименти, зроблено внесок в аналіз результатів та написання статті).
3. Mikosha A.S., Sautin Yu.Yu., Kovzun E.I., Povorotnij V.Yu., Tronko N.D. Inhibitory effect of adrenocorticolytic drug mitotane on corticotropin and prolactin binding by isolated cells and microsomal membranes of human and guinea pig adrenocorticocytes // Экспериментальная онкология. -1997. -Т. 19, № 2. -С. 162-166. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено експерименти, зроблено внесок в аналіз результатів та написання статті).
4. Mikosha A., Kovzun O., Zhukov A., Gulaya N. Effect of dopamine and long-chain N-acylethanolamines on steroidogenesis in rat adrenal gland in vitro // Med. Sci. Res. -1998. -N 2. -Р. 85-88. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено всі експерименти, зроблено внесок в аналіз результатів та написання статті).
5. Ковзун О.І. Розширення уявлень про регуляцію функції кори надниркових залоз різними агоністами // Ендокринологія. -2002. -Т. 7, № 1. -С. 108-113.
6. Микоша А.С., Ковзун Е.И., Гринченко Е.Н. Эстрадиол-17bактивирует образование кортикостероидов и тормозит пролиферацию культивируемых клеток надпочечников свиней // Укр. біохім. журн. -2003. -Т. 75, № 1. -С. 29-32. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проаналізовано результати, написано статтю).
7. Tronko N.D., Kovzun O.I., Kovalenko A.E., Mikosha A.S. Subcellular distribution of protein kinase C isoforms in human conditionally normal and tumor adrenal tissues // Ендокринологія. – 2004. – Т. 9, № 1. – С. 9-15. (Дисертантом самостійно проведено дослідження, проаналізовано експериментальні дані, написано статтю).
8. Ковзун О.І., Тронько М.Д., Микоша О.С. АКТГ активує in vitro протеїнкінази А та С у корі надниркових залоз людини // Укр. біохім. журн. -2005. -Т. 77, № 6. -С. 97-100. (Дисертантом самостійно сплановано експерименти, проаналізовано результати, написано статтю).
9. Ковзун О.І. Загальна активність протеїнкінази С та розподіл її α-ізоформи у пухлинах надниркових залоз людини // Доповіді НАН України. -2005. -№ 10. -С. 166-170.
10. Ковзун О.І. Участь циклічного АМФ в перенесенні регуляторних сигналів естрогенів у пухлинах надниркових залоз людини // Буковинський мед. вісник. -2005. -Т. 9, № 2. -С. 123-125.
11. Пушкарьов В.М., Ковзун О.І., Тронько М.Д., Костюченко Н.М., Микоша О.С. Участь фосфоінозитидів, протеїнкіназ С та А у передачі регуляторного сигналу К+ в адренокортикальних клітинах людини // Укр. біохім. журн. -2005. -Т. 77, № 1. -С. 65-71. (Дисертантом самостійно здійснювався аналіз літератури, сплановано експерименти, проведено визначення активності протеїнкіназ, статистичну обробку та узагальнення матеріалів, зроблено внесок у написання статті).
12. Ковзун О.І. Шляхи внутрішньоклітинного перенесення регуляторних сигналів естрадіолу в корі надниркових залоз людини // Доповіді НАН України. -2006. -№ 8. -С. 187-191.
13. Ковзун О.І., Пушкарьов В.М. Роль протеїнкінази С у внутрішньоклітинних механізмах регуляції функціонального стану кори надниркових залоз в умовах норми та при патології // Укр. біохім. журн. -2006. -Т. 78, № 4. -С. 54-66. (Дисертантом самостійно здійснювався аналіз літератури, узагальнення даних, написано статтю).
14. Ковзун О.І., Костюченко Н.М. N-ацильовані похідні етаноламіну ініціюють апоптоз в тканинах надниркових залоз людини // Медична хімія. -2006. -Т. 8, № 1. -С. 21-24. (Дисертантом самостійно сплановано експерименти, проаналізовано результати, написано статтю).
15. Ковзун О.І., Грінченко Є.М., Калинська Л.М., Микоша О.С. Вивчення впливу естрадіолу бензоату in vivo на вміст РНК і ДНК в корі надниркових залоз, аденогіпофізі і гіпоталамусі самців щурів // Ендокринологія. -2006. -Т. 11, № 2. -С. 213-218. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено експерименти, проаналізовано результати та написано статтю).
16. Тронько М.Д., Ковзун О.І., Грінченко Є.М., Микоша О.С. Вплив естрадіолу на синтез кортикостероїдів, активність протеїнкіназ А та С в корі надниркових залоз інтактних та орхіектомованих щурів // Фізіол. журн. -2006. -Т. 52, № 6. -С. 30-34. (Дисертантом самостійно проведено дослідження, проаналізовано експериментальні дані, написано статтю).
17. Левчук Н.І., Ковзун О.І., Тронько М.Д., Пушкарьов В.М. Вплив N-стеароїлетаноламіну на інтенсивність апоптозу в пухлинних тканинах надниркових залоз людини // Ендокринологія. -2007. -Т. 12, № 1. -С. 121-125. (Дисертантом сформульовано завдання роботи, зроблено внесок в аналіз експериментальних даних та написання статті).
18. Ковзун О.І., Костюченко Н.М., Микоша О.С. Вплив адренокортикотропного гормону на вміст каспази-3 і рівень фрагментації ДНК у гіперплазованій тканині надниркових залоз людини // Укр. біохім. журн. -2007. -Т. 79, № 2. -38-43. (Дисертантом самостійно проведено дослідження, проаналізовано експериментальні дані, написано статтю).
19. Ковзун О.І., Левчук Н.І., Гула Н.М., Микоша О.С. Участь циклічних нуклеотидів, протеїнкіназ А та С у реалізації дії N-ацилетаноламінів в адренокортикальних клітинах людини // Укр. біохім. журн. -2007. -Т. 79, № 5. -С. 133-139. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено дослідження, проаналізовано експериментальні дані, написано статтю).
20. Ковзун О.І. Залучення протеїнкіназ, активованих мітогенами, і транскрипційного чинника c-Fosдо трансдукції регуляторного сигналу естрадіолу в адренокортикоцитах щурів // Фізіол. журн. -2007. -Т. 53, № 6. -С. 46-51.
21. Ковзун О.І. Кортикотропін in vitro збільшує вміст a-ізоформи протеїнкінази С в ядрах адренокортикальних клітин людини // продолжение
--PAGE_BREAK--