2БИОТЕХНОЛОГИЯ.БИОПРЕПАРАТЫ.
БИОТЕХНОЛОГИЯ — технология, т.е. способ получения продуктов
из биологическихобъектов или с применением биологических объек-
тов. (Спор — этонаука или производство.)
В качестве биологических объектов чаще всего используются
клетки(микроорганизмов, растительного илиживотного происхож-
дения).Преимущества:
1. клетки являются своего рода биофабриками белков, жиров,
углеводов,витаминов, нуклеиновых кислот, аминокислот, антибио-
тиков, гормонов,антител, ферментов, спиртов;
2. клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся(бактерии - за
20-60 мин.,дрожжевые — за 1,5-2 часа, животная — 24 часа),
3. биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики,
антигены,антитела и др. значительно экономичнее и технологи-
ческидоступнее, чем химический синтез. Длябиосинтеза исполь-
зуются отходысельскохозяйственной, рыбнойпродукции, пищевой
промышленности.
4. возможность проведения биотехнологического процесса в
промышленныхмасштабах.
_Направления биотехнологии .:
— медицинская (фармацевтическая, иммунная)
— сельскохозяйственная (ветеринарная,растений)
— промышленная (пищевая, легкая промышленность, химическая,
энергетическая)
— экологическая (очистка, деградация).
_Историябиотехнологии
( _историческиедостижения .)
— Земледелие, животноводство — 10-11 тыс.лет назад.
— Селекция (интуитивная, например, пшеницы, домашних живот-
ных), затемнаучная.
— Биотехнология возникла примерно 5-6 тысячлет назад, когда
люди научилисьвыпекать хлеб, варить пиво, приготовлять сыр и
вино.
— В 19 веке Пастером была открыта природаброжения (начался
научный этапбиотехнологии).
— Открытие многих микроорганизмов и способов их получения в
большомколичестве (сформировалась техническая микробиология);
в настоящее времяиз 100000 видов микроорганизмов используется
не более 100 5(см. ниже) 0. С 70-80-х годов ХХ века начали полу-
чатьштаммы-суперпродуценты.
— Искусственное оплодотворение вживотноводстве, искусствен-
ное опыление врастеневодстве. Трансплантация эмбрионов(в жи-
вотноводстве). Разработка технологии искусственногооплодотво-
рения человека.
— Биодобавки в медицине, животноводстве,растеневодстве.
— Трансплантация органов. Переливание крови. Позднее созда-
ние искусственныхорганов (искусственная почка ...).
— Выделение ферментов, использование иммобилизованных фер-
ментов в молочномделе и пр.
— Разработка получения МАТ (моноклональныхантител) гибридом
(Келлер иМильштейн, 1975; Нобелевские лауреаты)
— Разработка и применение биосенсоров — технических средств
детектированиявеществ (с помощью антител, ферментов,рецепто-
ров...). Ужесозданы биосенсоры более 100 веществ. /1990г./
_- Развитие геннойинженерии .. Технология включениягена (ин-
сулина и пр.)Е.coli.
— Использование микроорганизмов(бактерий, дрожжей, виру-
сов) как реципиентов чужеродного генетическогоматериала для
получениеБАВ. Например, получены 2рекомбинантные 0 штаммыЕ.с.,
продуцирующиеинтерфероны, инсулин, гормон роста; В.subtilis, -
вырабатывающиеинтерферон, инсулин; дрожжи — продуценты ИЛ, ре-
комбинантныевирусы осповакцины, синтезирующие антиген гепатита
В. Производстволекарственных форм (интерлейкины, интерферон,
тканевыйактиватор плазминогена, фактор VIII, эритропоэтин, ре-
лаксин, использующийся для расслабления шейки матки, гормон
роста, фактор роста эпидермисаколониестимулирующие факторы,
МАТ). 4В клиниках сегодня (1988г.) проходитиспытания около 150
4биотехнологическихлекарств. 0
— Разработка способов переноса генов (впрыскивание в яйцек-
летку,электроток, вирусами, плазмидами).Некоторые методы пе-
реноса дают врезультате не трансгенных животных, а 2химер 0. Для
этого в эмбрионживотного вводят группу эмбриональных клеток
другоговида. Получаемое потомство построено из«мозаики» кле-
ток, часть которых несет гены одного из родителей, а часть -
другого. 4Так, широко известная сегодня «ковца» (химеракозы и
4овцы),выведенная в Кембридже (Англия), является такой химерой.
4От козыона унаследовала рога, а от овцы — лохматую шкуру. 0
— В клетки молочных желез овец введены геныфактора IХ ССК
(лечениегемофилии В), другим — альбумин (используется после
хирургическихопераций).
— В 1982г. Ричарду Палмитеру и Ральфу Бринстеру удалось пе-
ресадить ген гормона роста крысы мышке. В итоге трансгенная
мышь была в 1,5раза большего размера, чем обычные.
— Разработка автоматизированных синтезаторовгена. Получение
рекомбинантныхДНК. Разработка технологии репарацииДНК. С по-
мощью ферментоврестрикции (их обнаружено более 400) разрезается
кольцевая плазмида,вставляется новый участок ДНК.
— Генноинженерные микробы (например, «форсбан», защищающий
растения отзаморозков), семена и пр. 4Рекомбинантные организмы
4попадают в окружающую среду (известно более 20случаев). Нега-
4тивныепоследствия не обнаружены. 0
— Разработан способ усиления естественнойспособности бакуло-
вирусов поражатьнасекомых-вредителей, введя в них гены ДНК, ко-
дирующиеяды. Если в вирусы встроить гены белковчеловека, то в
организме хозяина(насекомого) они будут усиленно продуцировать
данные белки.
— Клонирование.
— Технология гибридизации фрагментов ДНК иРНК, на основе ко-
торой разработаныразличные методы ( ПЦР = полимеразная цепная
реакция/Мюллис,1983/, лигазная цепная реакция, Q-бета-система и
др.).
— Созданная технология получения гомозиготных «knockout»-мы-
шей сотсутствием в их геноме тех или иных генов /Koller
B.H.,1992/.
_Использование микроорганизмов
— из грибов для получения антибиотиков используются актино-
мицеты (родStreptomyces), Penicillium chrysogenum, Clphalospo-
rum acremonium,Streptomyces spp и др.
— дрожжи (в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении
соков, кормовогобелка, питательный сред для выращивания бакте-
рий и культурживотных клеток); Из 500 известных видовдрожжей
используетсятолько несколько;
— род Acetobacter для превращения этанола вуксусную кислоту
и уксуснойкислоты в газ;
— род Bacillus — для получения ферментов(В.subtilis)
— средства защиты растений(В.thuringiensis);
— род клостридий — для сбраживания сахаров вацетон, бутанол;
— молочно-кислые бактерии (lactobacillus,Leuconostoc,Strep-
tococcus);
— псевдомонады для получения витаминаВ 412 0;
— коринебактерии glutamicum для полученияаминокислот и др.
2БИОПРЕПАРАТЫ
3Классификация
I. 2Биопрепараты, использующиеся invivo
1. АГ-ые (вакцины /в т.ч. анатоксины/, аллергены, лизаты
микробов длякожных проб), создающие активный иммунитет. Специ-
фические АТ и Ткпоявляются в кровотоке примерно через неделю у
здоровогочеловека (у лиц с ИД — позже).
2. АТ-содержащие (антисыворотки, гамма-глобулины, МАТ, им-
мунноемолоко), создающие за счет готовых АТпассивный иммуни-
тет. Однако«примеси» данных биопрепаратов и ксеногенные (лоша-
диные и пр.) АТзапускают активный «вредоносный» иммунитет. По-
этомуиспользование желательно в течение 1 недели после первой
инъекции (до появления вторичных АТ и избежания ИК-ыхосложне-
ний,васкулитов). Антисыворотки вводят толькопо жизненным по-
казаниям.
3. Иммунокорректоры
— животного происхождения (цитомедины, интерлейкины, интер-
фероны, факторыроста, гормоны /глюкокортикоиды и др./)
— растительного происхождения (аллергены,лектины)
— микробного происхождения (БЦЖ,продигиозан, антибиотики)
— химические иммунокорректоры
4. Бактериофаги.
Бактериофаги относятся к эффективнымпрепаратам антимикробно-
го действия, обладающим строгой специфичностью и не вызывающим
развитиядисбактериозов, как это имеет местопри использовании
антибиотиков.
II. 2Биопрепараты, использующиеся invitro
— Диагностикумы (для РНГА) антигеновмикробов (самих клеток,
лизатов, или очищенных АГ-ов), использующиеся в серологических
реакциях. Иммунодиагностикумы — это часто взвесьизвестных уби-
тых микробов. Для инактивации используютвысокую температуру,
химическиевещества (формалин, спирт, ацетон, фенол), ультраз-
вук, ультрафиолетовые и рентгеновские лучи. При выделениииз
клеток различныхАГ используют методы разрушения, экстракции,
обработкуферментами и различными детергентами, центрифугирова-
ние. /2551к/
— Антигены, в т.ч. анатоксины /токсины/ дляпроведения РП,
РН (для постановкиконтроля в серологии).
— Диагностические антисыворотки. Для удаления из антисыворо-
токгруппоспецифических антител в сыворотку последовательно до-
бавляютмикроорганизмы, в состав которых входятгрупповые анти-
гены (методКастеллани). Таким образом получаютадсорбированные
сыворотки,которые содержат антитела к определенному виду микро-
бов. /2551к/
— МАТ (мышиные) для ИФА, иммуноблоттинга, ИФМ и пр. сероло-
гических реакций.
АЛЛЕРГЕНЫ
Известно более 200 тысяч аллергенов.
Аллергией страдает 20% населения земногошара.
I. ЭНДОАЛЛЕРГЕНЫ
— тепловые — тепловая аллергия (наперегрев),
— ожоговые белки («аллергия наУФ»),
— холодовые эндоаллергены (измененная конформация белков на
холоду) — холодовая аллергия,
— появляющиеся новые антигенные детерминантыпри физнагрузке
(«аллергияна физнагрузку»)
— появляющиеся новые антигенные детерминанты при стрессе
(«аллергияна стресс»)
II. ЭКЗОАЛЛЕРГЕНЫ
31) Растительного происхождения
Официально зарегистрировано 600 (598) видов аллергических
растений.
1Поллинозы на пыльцу 0. Количество пыльцы в воздухе max ранним
вечером и minутром, поэтому период активнойдеятельности надо
перенести наутренние часы.
Пыльца деревьев: ива, ольха, тополь, лещина, береза,дуб,
клен, ясень, рябина, вяз,липа, ильм.
Пыльца хвойных деревьев: сосна, лиственница, ель, пихта,
кедр.
Пыльца злаков: овес, рожь, пшеница, пырей, рис, овсянница,
ежа, амброзия, тимофеевка,мятлик; загряз-
няющие зернопродукты животного, токсического,химического ха-
рактера (аллергияна пшеничную или овсяную муку).
Растения, вызывающие фитодерматозы: крапива,середка тополя,
волчье лыко, одуванчик, марь, паслен, ле-
беда, полынь. /7538/91/
Аллергены цитрусовых — какие-тобелковые компоненты кожуры
мандарин,лимонов, апельсин.
Лук, клубника, малина, земляника, соя ...
Чай, кофе, шоколад.
Ваниль, горчица, гвоздика, миндаль, корица, мускатный орех,
чеснок,сельдерей, перец.
32) Животного происхождения
— кожный эпителий животных (перья и пухптиц, «шерсть» жи-
вотных — пуховыеи шерстяные изделия)
— корм для аквариумных рыбок (сухие рачки идафнии)
— экстракт тараканов
— морские продукты, особенно богатые иодом
— мед, яйца, рыба и икра, свинина, куриное мясо,
— молоко (альфа-лактальбумин, казеин) — 7% аллергийу детей;
У кипяченого молока аллергические свойства резко падают(меня-
ется структурабелков). Молоко заменяют кефиром, творогом и пр.
Сыр.
— яды насекомых
— препараты крови, лечебные сыворотки.
33) 1 3микробногопроисхождения
— Некоторые АГ пневмококков, стафилококков,стрептококков,
— АГ дрожжей /аллергия на хлеб/,
— АГ спор плесневых грибов — ГП (М. более 40кД),
— АГ паразитов
— АГ вакцин
— Антибиотики
34) химического происхождения
— краски, лаки, моющие средства, косметика (только 20% кос-
метическихсредств безопасны в отношении аллергии /1652к/),
— лекарственные препараты(сульфаниламиды, новокаин, дикаин
и др.анальгетики, анестетики /аспирин, анальгин/), [анальгети-
ки — блокируютболевую чувствительность; анестетики — подавляют
любой видчувствительности]
— отходы химического производства /профессиональные болез-
ни/,
— рентгеноконтрастные вещества
— дезинфецирующие средства и пр.
[5) физическогопроисхождения (см. эндоаллергены).]
6) Промышленная,бытовая и библиотечная 3пыль 0.
— клещ домашней пыли
Проба на аллергены: за рубежом накладываютманжету на предп-
лечье с 40 ячейками, в каждой их которых один из основных ал-
лергенов. Через1-2 сут оценивается зона покраснения и соот-
ветствующаяячейка. (У пожилых лиц пробы чаще отрицательные.)
.
3АНТИТЕЛО-СОДЕРЖАЩИЕБИОПРЕПАРАТЫ
(вызывают пассивный иммунитет)
АТ-содержащие биопрепараты включают антимикробныеили анти-
токсические АТ ииспользуются для лечения или диагностики. Ан-
тисывороткииспользуют по жизненным показаниям с целью экстрен-
нойсеропрофилактики (при непосредственной угрозе заболевания).
1) Кровь, плазма (переливание). Сыворотки. _Антисыворотки ..
2) _Гамма-глобулины .(общие, направленного действия, получае-
мые либо послеиммунизации, либо от лица, недавно перенесшего
заболевание).
3) _МАТ . (пока только мышиные,человеческие гибридомы в насто-
ящее времяотсутствуют).
14) Иммунное молоко. Сочетаниепарентеральной и диалетической
1иммунизациипозволило получить _иммунное молоко ., содержащее ан-
1титела квибрионам холеры и токсину, ЭПКП, протеям, шигеллам
1Зонне. В настоящее время наметились 2 тенденции в технологии
1изготовленияпрепаратов иммунного молока — получение _лактосыво-
_ 1ротокили лактоглобулинов … Лактосыворотка, в отличие от лактог-
1лобулина, обладает большей буферной емкостью, содержитингиби-
1торытрипсина и химотрипсина, что в известной степени обеспечи-
1вает устойчивость белков коровьего молока кдействию ферментов
1ЖКТ. Кроме того, некоторые белки лактосыворотки(лактоперокси-
1даза,лактоферрин, лизоцим и др.) оказывают неспецифическое ан-
1тимикробноедействие и способы потенцировать защитный эффект
1специфическихантител. /2114к/87/ — (ПОВТОР материала по ОКИ)
_Получение антисыворотки из молока
4Молозиво центрифугируют при 20000 об./мин. 2 часа при 4 50 4С,
4липидныйслой отделяют (обезжиривание). Казеиносаждают титро-
4ванием 1Нуксусной кислотой до рН 4,6 с последующим центрифуги-
4рованием втех же условиях. Используют надосадок,который диа-
4лизируют в0,01М растворе фосфатного буфера с рН 7,0. Для выде-
4ленияочищенной фракции Ig A можно использовать ионообменную
4хроматографию(ИОХ) на ДЭАЭ-целлюлозе. /6737/ 0
5) Антиидиотипические АТ используют для запуска активного
иммунитета,поэтому называют антиидиотипическими вакцинами 4(см.
4материалпо вакцинам) 0
_ 2Получение 0АТ .-содержащих препаратов
I. От иммунизированных животных
II. Из крови иммунных лиц (недавновыздоровевших)
_Иммунизацияживотных
┌────────────────────┴─────────────────────┐
селезенка мыши Кровь
│ │
выделение Ретракциясгустка
ПК, синтезирующих (40 минут, 37 5о 0С)
искомые АТ │
│ Сыворотка
ПК+ (В-лимфоцит, (=антисыворотка)
инфицированный ВЭБ │
— лимфомная клетка) (Высаливание,
+ ПЭГ спиртовоеосаждение,
│ адсорбция)
Гибридома — активация │
│ клеток Гамма-фракция
МАТ │ иммуноглобулинов
ИФ, ФНО, ИЛ │
в питательной Аффинная хромато-
среде графия (сорбция
│ на комплекс «АГ-
│ носитель"
Реакция на │
«примеси» Моновалентные АТ
31. Иммунизация
Первая иммунизация вызывает первичный ИО;вторая и последую-
щие — вторичныйИО. Многократную иммунизациюназывают гипе-
риммунизацией(--- гипериммунная сыворотка).
Способы иммунизации животных:
2- в/кож. 0 (объем до 100 мкл)--- региональные ЛУ
2- п/кож. 0 (объем 1-30 мкл). При данном способе иммунизации
антигенраспространяется медленно, т.к.подкожная клетчатка не
имеет развитыхлимфатических протоков.
2- в/мыш. 0 (0,5-8мл соответственно для мышей-кроликов) в об-
ласть бедра;птицам в грудную мышцу.
2- в/бр. 0 (2-30мл соответственнодля мышей-кроликов); при этом
животноеопускается головой вниз;
2- в/в 0 (1-10мл); если в боковую вену хвоста, то хвост предва-
рительноопускается в стакан с горячей водой -55 5о 0С;
2- интраназально 0 (по каплям от 0,03 до 1 млсоответственно
длямышей-кроликов);
2- оральное введение 0 (0,3-5мл): антиген смешивают с кормом и
скармливают или ввиде питья, можно через зонд — в желудок.
/7143/89/1
— 2per rectum 0
5Пример:
5Один объем антигена смешивают с 3объемами полного адъюванта
5Фрейнда итщательно перемешивают. Полученную эмульсию вводят
5внутрикожнопо 0,1мл в 10 точек спины, расположенных по 5 в ряд
5нарасстоянии 2 см по обе стороны от позвоночника. Общая доза
5иммуногенаравна 10-100 мкг на кролика. Иммунизируют 6 кроликов
5массой по2 кг. Через 8-10 недель проводят пробноекровопуска-
5ние. При удовлетворительном качестве антисыворотки последова-
5тельнопроводят до 3 кровопусканий, послечего кроликам дают
5отдохнутьв течение 1 месяца и затем делают следующие кровопус-
5кания. Принеудовлетворительном качестве антисыворотки проводят
5вторичную иммунизацию, используя половинную дозу иммуногена в
5неполномадъюванте Фрейнда. Иммунизируют подкожно в складку ко-
5жи нашее. Через 10 суток делают пробноекровопускание и опре-
5деляюткачество антисыворотки. При неудовлетворительном качест-
5ве индивидуальной антисыворотки иммунизируютновую группу кро-
5ликов илиживотных другого вида. /6817/84/ 0
32. Получение крови и сыворотки
У животных или иммунизированного человекаберут кровь в пус-
тые пробирки, после ее свертывания откручивают на центрифуге,
получаетсят.н. антисыворотка, из которой можно выделить гам-
ма-глобулиновуюфракцию.
Противоэнцефалитный иммуноглобулин получалииз сывороток лю-
дей, проживающихв местах распространения данного заболевания,
содержащихдостаточно высокий уровень специфическихпротивови-
русных антител./1430к/
32. 2О 3чистка 0( 3фракционирование 0) и тестирование
— Осаждение
— высаливанием (осаждение сульфатом натрия или сульфатом
аммония)
— осаждение спиртом
— полиэтиленгликолем (ПЭГ)
— каприловой кислотой
— ферментирование
— диализ
— адсорбция
— аффинной хроматографией
— выделение на белок А-сефарозе (FcRзолотистого стафило-
кокка)
Силу антитоксических сывороток измеряют вмеждународных еди-
ницах (МЕ) поспособности нейтрализовать определенную дозу ток-
сина.
_Антисыворотки
— Лечебные │ (используется только по
— Профилактические │ жизненным показаниям)
— Диагностические
По специфичности различают
- моновалентнуюантисыворотку
- поливалентнуюантисыворотку
- антицельнуюантисыворотку (против всех сывороточных белков -
36)
_Недостатки антисывороток .:
— Выделенная из крови сыворотка, сколько бы ее не очищали и
ни концентрировали, содержит набор различных антител. Поэтому
ее называютполиклональной. Лишь _небольшаячасть антител . нап-
равлена _против специфичных антигенных детерминант ..
— Иммуноглобулины антисывороток уже соткрытыми углеводными
компонентами,поэтому _быстрее выводятся из организма ..
— Углеводные компоненты, переплетаясь между собой, приводят
к спонтанной _агрегации белков . при длительном хранении, что спо-
собствует вкровотоке закупорке некоторого количества капилля-
ров и активациисистемы комплемента по альтернативному пути.
— " _Примесные АТ ."дают многочисленные «перекрестные» положи-
тельныереакции, которые приводят к ошибочнымдиагнозам по се-
родиагностике.
— " _Примесные АГ .".Иные белки сыворотки могут содержать раст-
воримые(сброшенные) антигены HLA, АВ, Rh, иныеаллотипы анти-
тел и др., чтоиммунизирует реципиента.
— Ксеногенные (лошадиные) сыворотки приповторном введении в
организм могутвызывать _аллергические реакции . на чужеродный бе-
лок. Поэтому необходима постановка _внутрикожной пробы . с сыво-
роткой вразведении 1:100 в объеме 0,1 мл. Введение антитокси-
ческой лошадинойсыворотки допустимо лишь в случае отсутствия
выраженной кожнойреакции в течение 20-30 минут. /1430к/
— Ещеодин серьезный недостаток: для полученияантител каж-
дый разнеобходимо _заново иммунизировать . животных и очищать вы-
деленнуюсыворотку. Это стоит немалых денег.
_Гамма-глобулины(преимущественно Ig G)
Содержание антител в препаратахиммуноглобулинов человека:
— АТ к токсинам (дифтерийному, столбнячному,пертуссигену)
— Титры агглютинирующих АТ к штаммамвозбудителей располага-
ются в следующемпорядке (по убыванию)
— P. aeruqinosa
— S. sanguis,
— B.melaninogenicus,
— B. bronchisrptica,
— Veillonella,
— E. coli.
Титры к E.c. очень низкие. /2384к/84/
Использование иммуноглобулинов
для пассивной иммунизации/7330/87/
────────────────────┬─────────────────────┬────────────────────
Пулированные │ Специфические │ Специфические
Ig человека │ Ig человека │ лошадиные Ig
────────────────────┴─────────────────────┴────────────────────
ГуморальныйИД Гепатит В Ботулинум токсин
Гепатит А Бешенство Дифтерийный токсин
Корь Столбняк Змеиный яд
Ветряная оспа Яд паука
Натуральная оспа Black widow
(коровья оспа)
Rh изоиммунизация
pertussis
───────────────────────────────────────────────────────────────
2МАТ
2МАТ (моноклональные ант